Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Cette méthode peut aider les scientifiques à maximiser l’utilisation productive des îlots pancréatiques pour évaluer plusieurs résultats sur chaque échantillon dans son architecture tissulaire native. Le principal avantage de cette nouvelle méthode d’encastrement est que les îlots sont répartis uniformément sur une zone bien définie, plaçant de nombreux îlots dans le plan de section, ce qui optimise le rendement expérimental de ce matériau de faible abondance. La démonstration de la procédure sera faite par le docteur Yahui Kong, un associé de recherche dans mon laboratoire.

Pour commencer cette procédure, utilisez une pointe de pipette p200 à faible liaison et une grille calibrée sous un stéréomicroscope pour choisir à la main 250 équivalents d’îlots. En les transférant dans chaque tube microfuge à faible liaison de 1,5 millilitre. Laissez les îlots se déposer au fond du tube de microfuge.

Ensuite, utilisez une pipette avec un embout p200 frais pour retirer soigneusement la majeure partie du surnageant. Assurez-vous de ne pas enlever d’îlots. Ajoutez un millilitre de PBS et centrifugez dans une centrifugeuse à godet oscillant jusqu’à ce que la vitesse atteigne 200 fois la gravité, puis arrêtez la rotation.

Retirez le surnageant. Répétez tout ce processus de lavage PBS pour un total de deux cycles de lavage. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de formol à 10 % ou de paraformaldéhyde fraîchement préparé.

Laissez l’échantillon fixer à température ambiante pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une pipette avec un embout p200 pour retirer le fixateur. Ajoutez un millilitre de PBS et centrifugez jusqu’à ce que la vitesse atteigne 200 fois la gravité, puis arrêtez l’essorage.

Retirez le surnageant, puis répétez à nouveau l’ensemble du processus de lavage PBS pour un total de deux cycles de lavage. Préparez le gel souhaité dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, placez ces tubes de microcentrifugation dans un bloc chauffant à 70 degrés Celsius pour réchauffer le gel.

À l’aide d’une pointe de micropipette coupée, transférez 10 microlitres de billes de bleu d’agarose par échantillon dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre de PBS aux billes, puis centrifugez-les à 800 fois la gravité pendant une minute. Retirez le PBS et répétez ce lavage une fois de plus.

Après le deuxième lavage, remettez les perles en suspension dans une quantité appropriée de PBS. Centrifuger les tubes contenant les îlots jusqu’à ce que la vitesse atteigne 200 fois la gravité, puis arrêter la rotation. Retirez la majeure partie du surnageant.

À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez l’extrémité d’une pointe de micropipette de 10 microlitres pour chaque échantillon. Ajoutez 10 microlitres de billes dans chaque tube d’îlot à l’aide d’une pointe de coupe nette pour chaque échantillon. Ensuite, centrifugez jusqu’à ce que la vitesse atteigne 200 fois la gravité.

Après cela, utilisez un embout non coupé de 200 microlitres suivi d’un embout de 10 microlitres pour éliminer autant de PBS que possible. Étiquetez les lames de microscope pour l’identification de l’échantillon et placez-les sur la paillasse près du bloc chauffant avec le gel réchauffé. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez les extrémités de quelques pointes de micropipette à faible liaison par échantillon.

À l’aide d’une micropipette munie d’une pointe coupée, ajoutez du gel chaud dans un tube contenant des îlots et des billes. Mélangez immédiatement en évitant la création de bulles. Appliquez ce mélange sur une lame en formant un disque près du bord de la lame tout en laissant de l’espace pour l’anneau extérieur en gel.

Ensuite, tapotez doucement le toboggan plusieurs fois pour installer les îlots et les perles. Ajoutez 20 microlitres de gel chaud dans le tube d’échantillon et mélangez le nouveau gel avec les îlots et les billes restants. Appliquez ce mélange sur la même lame entourant le disque d’origine.

Répétez l’opération au besoin à l’aide de nouvelles pointes prédécoupées pour chaque application jusqu’à ce que le disque ait la taille et l’épaisseur souhaitées. Assurez-vous de préparer chaque disque individuellement et de garder une trace de l’ordre des échantillons si vous placez plusieurs disques de chaque côté. Ensuite, placez les lames sur une surface plane de glace humide et couvrez-les.

Laissez reposer les lames pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le gel se solidifie. Ensuite, retirez les lames en veillant à sécher le dos de chacune. Étiquetez une cassette de tissu de traitement et d’enrobage de biopsie pour chaque échantillon.

Utilisez le bord émoussé d’une lame de rasoir pour pousser doucement le disque dans toutes les directions afin de le libérer du verre. Lorsqu’il glisse facilement, poussez lentement le disque hors de la glissière et placez le disque côté plat vers le bas directement sur le papier. Il peut être difficile de garder les disques distincts intacts tout en les faisant glisser de la lame de verre au papier.

Si une ride se produit dans le disque, laissez-le revenir à sa position d’origine, ajoutez plus de gel et regelez la lame. Pliez le papier autour du disque pour éviter tout mouvement. Transférez-le dans la cassette, puis fermez la cassette.

Immergez la cassette dans un bécher rempli de PBS. Dans cette étude, une méthode d’enrobage modifiée basée sur un disque de gel est utilisée pour générer efficacement un rendement élevé d’îlots par section. La morphologie des îlots de rongeurs est nettement plus intacte après la récupération post-isolement dans le milieu des îlots, affichant une surface arrondie lisse et une forme sphérique compacte.

Le fait que la morphologie des îlots humains soit similaire, qu’elle soit encastrée le jour de l’arrivée ou après la récupération après l’expédition pendant la nuit, pourrait être dû au fait que les îlots se remettent du stress d’isolement avant l’expédition. En comparaison, les sections de paraffine obtenues via l’ancienne technique des microtubes ont une section transversale tissulaire plus petite avec moins d’îlots par section et avec des îlots et des billes densément tassés. Comme le montre ici, cette technique est capable de produire des coupes d’îlots de grande qualité pour la coloration histologique et d’immunofluorescence.

La coloration à l’insuline et au glucagon montre la diversité de la composition et l’hétérogénéité de l’architecture des îlots, démontrant des différences architecturales connues entre les îlots humains, de souris et de rats. Ces images représentent également des coupes en série des mêmes îlots. Démontrant que cette technique est capable d’obtenir plusieurs sections à partir d’un même îlot.

Une fois maîtrisée, cette technique permet de gagner du temps par rapport à la technique de la microcentrifugation. La formation du disque sur une surface plane plutôt que dans un tube facilite le transfert physique du disque sur la cassette pour le traitement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie des îlots, elle peut également être appliquée à d’autres blocs cellulaires ou tissus friables difficiles à sectionner.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un gel de petit volume pour concentrer les tissus sur une petite zone et former le disque sur une surface plane. Il est également essentiel d’utiliser des tubes de microcentrifugation à faible liaison et des pointes de pipette pour améliorer le rendement tissulaire. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des îlots pour explorer la composition et l’hétérogénéité des types cellulaires, l’interaction cellule-cellule et la régulation des gènes dans des îlots entiers cultivés dans leur architecture native.

La capacité de générer 10 sections ou plus contenant de nombreux îlots à partir d’une seule condition expérimentale permet de quantifier plusieurs résultats sur le même matériau, améliorant ainsi l’efficacité expérimentale. L’application de cette technique à des échantillons de tissus d’abondance limitée peut également offrir des avantages à d’autres domaines. Il peut être nécessaire de modifier certains éléments de cette procédure pour répondre aux besoins de l’utilisateur.

L’intensité de la fixation et la division doivent être optimisées. Un disque plus épais ou plus grand peut être généré à l’aide de cette technique. Il peut être nécessaire d’imbriquer des étapes de traitement simples pour l’intégration et de les optimiser.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un bloc cellulaire d’agarose de haute qualité pour les coupes de paraffine d’îlots pancréatiques entiers en culture.