Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser une plate-forme microfluidique pour construire un réseau vasculaire perfusable dans un agrégat multicellulaire, ou sphéroïde. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la forme alternative des domaines de la médecine régénérative, telles que l’importance d’un réseau vasculaire dans les modèles tissulaires in vivo et in vitro. Le principal avantage de cette technique est que la voie d’administration du médicament et du supplément peut être simulée in vitro via l’administration de régions d’intérêt directement dans les sphéroïdes.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à introduire les cellules dans la zone cible du dispositif microfluidique. Après avoir coulé le prépolymère PDMS, dégazez le matériau dans une chambre à vide pendant deux heures, puis durcissez pendant la nuit à 80 degrés Celsius dans un four ventilé. Le lendemain matin, décollez le PDMS de la plaquette de silicium et utilisez un poinçon de deux millimètres de diamètre pour créer des trous dans le matériau aux positions indiquées.

Utilisez un poinçon d’un millimètre de diamètre pour créer le puits sphéroïde, et utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la dalle PDMS et une lamelle en verre de 24 x 24 millimètres. Traitez la dalle propre avec du plasma d’air pendant 40 secondes et collez la dalle PDMS sur la lamelle. Ensuite, durcissez le PDMS à 80 degrés Celsius pendant au moins 12 heures.

Deux à trois jours avant l’ensemencement du dispositif microfluidique, ajoutez trois fois 10 à 10 litres de milieu endothélial frais dans une boîte de 10 millimètres dans une boîte de 10 millimètres. Lorsque les hLF et les RFP-HUVECs atteignent la sous-confluence, suspendre les hLF et les RFP-HUVECs dans le milieu endothélial jusqu’à des concentrations finales à 1,0 fois 10 puissance la cinquième et 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par millimètre, respectivement. Après deux jours de culture en suspension, dans une enceinte de biosécurité, ajoutez une gouttelette de 99 microlitres de solution de mélange principal fraîchement préparée au centre d’une boîte de Pétri de 35 millimètres sur de la glace.

Pour charger le dispositif microfluidique, utilisez une pointe de micropipette modifiée de 100 microlitres pour transférer un sphéroïde et 100 microlitres de milieu dans une deuxième boîte de Pétri à température ambiante. Ensuite, aspirez le sphéroïde dans un minimum de milieu et tournez la pipette à la verticale de sorte que le sphéroïde se déplace vers le bas de la pointe de la pipette par gravité. Touchez l’extrémité de la pipette sur le ménisque de la gouttelette de mélange principal pour éjecter le sphéroïde dans la solution sans appuyer sur le piston de la pipette.

Ensuite, ajoutez rapidement un microlitre de thrombine fraîchement préparée à la gouttelette et mélangez doucement la thrombine dans la solution. Avec la pipette réglée sur sept microlitres, transférez lentement le sphéroïde dans le puits sphéroïde de la dalle PDMS. L’étape la plus critique de la procédure consiste à injecter le sphéroïde avec suffisamment de gel pour permettre au sphéroïde de se déposer au fond de l’appareil.

Après le chargement, retirez délicatement la pointe de la pipette pour éviter les fuites entre les micro-tiges. Incuber le sphéroïde à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Lorsque la fibrine s’est solidifiée, injectez lentement 20 à 30 microlitres de milieu endothélial dans les trous un A et trois A pour charger les canaux un et trois, respectivement.

Ensuite, transférez l’appareil sur une lingette de laboratoire humide dans une parabole de 100 millimètres, et incubez l’appareil à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24 heures pour faciliter l’élimination de toute bulle à l’interface entre le milieu et la fibrine. Le lendemain, ajoutez deux millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA aux GFP-HUVECs sous-confluents, et arrêtez la réaction de trypsine avec quatre millilitres de milieu complet lorsque les cellules se sont complètement détachées. Recueillir les cellules endothéliales par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un milieu endothélial frais à une concentration de cinq fois 10 à six cellules par millilitre.

Ensuite, injectez 20 microlitres de HUVECs dans le trou un B pour charger le premier canal, et placez l’appareil à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, incliné à un angle de 90 degrés pour vous assurer que les HUVECs adhèrent à la fibrine du canal deux. Après avoir chargé le canal trois de la même manière, placez l’appareil dans une nouvelle parabole de 100 millimètres contenant une lingette de laboratoire humide dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept à 14 jours, en remplaçant la moitié du milieu dans les canaux un et trois par jour. Ces images représentatives prises le jour zéro de la charge HUVEC montrent que le gel de fibrine est chargé dans le canal deux seulement, sans aucune fuite dans les canaux un ou trois et que les HUVEC sont fixés avec succès à la paroi latérale du gel de fibrine.

On peut également observer que le sphéroïde est correctement installé au bas de l’appareil. Les pousses angiogéniques sont observées à partir du premier jour, la plus longue pousse atteignant le sphéroïde le troisième jour dans cette expérience, et la plupart des pousses angiogéniques atteignant le sphéroïde le septième jour. De manière optimale, après quatre jours dans l’appareil, le flux peut être observé à travers les lumières vasculaires avec l’angle vasculaire défini comme la direction de l’extrémité vasculaire et le centre du sphéroïde de la racine vasculaire

Les angles vasculaires diminuent en fonction du temps, ce qui indique la migration des pousses angiogéniques vers le sphéroïde. Les RFP et GFP-HUVECs peuvent former de manière coordonnée une seule lumière vasculaire, indiquant clairement comment les germinations angiogéniques des canaux un et trois s’anastomosent aux RFP-HUVECs dans le sphéroïde pour former un réseau vasculaire continu. De plus, le FITC-dextran injecté dans le canal un s’écoule dans le réseau vasculaire construit et à l’intérieur du sphéroïde, atteignant finalement le canal trois, ce qui implique que le réseau vasculaire intégré pourrait fournir des nutriments au sphéroïde et en éliminer les déchets.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine électrique organique pour explorer l’efficacité de médicaments ou de suppléments d’intérêt dans des modèles de tissus in vitro.