Développement et caractérisation de In vitro Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l'endothélium [Ca ²⁺] _i Et production d'oxyde nitrique

L’objectif global de cette procédure est de développer un dispositif microfluidique qui permet aux cellules endothéliales de se développer sous un flux de cisaillement physiologiquement pertinent et de mesurer les changements induits par les agonistes dans leur production de calcium et d’oxyde nitrique. Ce message peut contribuer à faire progresser l’avenir de la recherche sur les micro-vaisseaux, en validant le modèle de micro-récipients in vitro et en comblant les écarts entre les études in vivo et les études in vitro. Les principaux avantages de cette technique sont la conception polyvalente des microcanaux pour imiter diverses voies vasculaires et ils améliorent l’environnement de culture cellulaire qui est plus proche de l’in vivo que la statique conditionnelle à ces cultures originales.

Sulei et Xiang, les deux de mon laboratoire, feront la démonstration des procédures. Avant de commencer, utilisez la photolithographie standard pour créer un moule maître et la lithographie douce pour fabriquer les dispositifs à microcanaux PDMS comme décrit dans le protocole texte. Pour préparer les dispositifs à microcanaux, couvrez d’abord l’entrée et la sortie avec un mince morceau de PDMS et placez l’appareil dans une boîte de Pétri avec un mouchoir humide.

Ensuite, enveloppez le plat avec du Parafilm et stérilisez l’appareil sous une lumière UV pendant au moins trois heures. L’étape suivante consiste à appliquer la fibronectine. Tout d’abord, placez une goutte de 30 à 50 microlitres de PBS à l’entrée.

Créez un aspirateur à la sortie pour rincer l’appareil. Ensuite, placez une goutte de 100 microgrammes par millilitre de fibronectine à l’entrée. Créez un vide à la sortie pour charger la solution de fibronectine.

Ensuite, couvrez l’entrée et la sortie. Enveloppez à nouveau le plat avec du Parafilm et incubez l’appareil pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez manuellement l’appareil avec du PBS trois fois.

Ensuite, chargez-le avec 30 à 50 microlitres de milieu de culture cellulaire et réchauffez l’appareil dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Commencez par mélanger les HUVEC dans des milieux de culture HUVEC avec huit pour cent de Dextran à raison de deux à quatre millions de cellules par millilitre. Le Dextran est nécessaire pour augmenter la viscosité et ainsi améliorer l’ensemencement des cellules.

Ensuite, placez 10 à 20 microlitres de cellules sur l’entrée et introduisez-les par gravité ou par capillarité à partir d’une pipette pasteur en verre à la sortie. Ensuite, incubez l’appareil pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, vérifiez l’état de l’ensemencement au microscope.

Si nécessaire, chargez plus de cellules pour obtenir la densité de cellules souhaitée. Une fois qu’un nombre suffisant de cellules est chargé, rincez doucement l’appareil avec un milieu de culture cellulaire normal et chaud pour retirer le Dextran. Ensuite, cultivez l’appareil sans aucune perfusion de milieu pendant six heures.

Ensuite, configurez les raccords de tubulure pour la perfusion à long terme. Collez l’appareil sur une boîte de Pétri, puis connectez le tube d’entrée à une seringue avec une aiguille. Insérez le tube dans l’entrée et la sortie de l’appareil.

Connectez le tube de sortie à un collecteur de déchets. Maintenant, placez le récipient à vaisselle et à déchets dans un incubateur. Connectez la seringue avec un long tube d’entrée à une pompe de perfusion externe qui passe par la porte de l’incubateur.

Ensuite, réglez le taux de perfusion en fonction du plan expérimental. Avec une perfusion bien contrôlée, la culture dans le réseau de microvaisseaux peut être maintenue jusqu’à deux semaines. Par conséquent, il peut être étendu à des études à plus long terme imitant l’environnement cellulaire et hémodynamique sur les différents états physiologiques et pathologiques.

Pour commencer l’immuno-marquage, comme le marquage VE-cadhérine, fixez d’abord les cellules en les perfusant avec deux pour cent de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après une série de perfusions pour bloquer, perméabiliser et colorer avec des anticorps, maintenez l’appareil à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient imagées. Pour imager la concentration de calcium dans les cellules, perfuser l’appareil avec 10 milligrammes par millilitre d’albumine dans une solution Ringer pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, perfuser l’appareil avec cinq micromolaires Fluo-4 AM pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez le Fluo-4 AM lié à la lumière avec des sonneries d’albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, démarrez le système confocal pour l’imagerie intercellulaire du niveau de calcium avec Fluo-4 AM. Acquérir des images des microvaisseaux chargés de Fluo-4.

Collectez les images de référence pendant 10 minutes. Ensuite, perfuser l’appareil en continu avec 10 micromolaires d’ATP et enregistrer les changements d’intensité de fluorescence pendant 20 minutes. Pour imager la production d’oxyde nitrique dans les cellules, perfuser l’appareil avec des sonneries d’albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, perfuser les cellules avec 5 micromolaires DAF-2 DA pendant environ 35 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, configurez le système d’imagerie par fluorescence pour mesurer la production d’oxyde nitrique induite par l’ATP. Enregistrez la ligne de base pendant 5 minutes, puis perfuser l’appareil avec 10 ATP micromolaires et collectez les images pendant 30 minutes à des intervalles d’une minute.

Pour la mesure de l’oxyde nitrique cellulaire, il est important de comprendre que l’adaptateur de détachement pour le profil d’intensité représente une production cumulative d’oxyde nitrique avec le temps et non une concentration d’oxyde nitrique. Sélectionnez manuellement la région d’intérêt à partir des images collectées au niveau de la cellule individuelle. Chaque retour sur investissement couvre la surface de la cellule d’un individu, ce qui peut être indiqué par le contour de floresense.

Quantifier les changements induits par l’ATP dans le calcium endothélial et l’oxyde nitrique. En calculant les changements dans l’intensité floresense de Fluo-4, moins le fond tissulaire. Quantifiez le taux de production de protoxyde d’azote en effectuant la première conversion différentielle de l’intensité floresense de DAF-2 au fil du temps.

Le modèle de microcanaux dans l’appareil a un réseau de ramification à trois niveaux. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour estimer les distributions des contraintes de cisaillement sous un débit de 0,35 microlitre par minute. Les cellules endothéliales s’ensemencent dans le réseau comme décrit.

Ensuite, l’actine F et les noyaux ont été marqués. De même, la VE-cadhérine a également été colorée. Les résultats étaient similaires à l’expression de la VE-cadhérine dans une veinule intacte.

Ensuite, les augmentations induites par l’ATP de la production intracellulaire de calcium et d’oxyde nitrique ont été examinées. Les taux de calcium ont été examinés à l’aide de Fluo-4 AM, comme décrit dans la section sur le protocole. La production d’oxyde nitrique a été surveillée à l’aide de DAF-2 DA, comme décrit dans la section sur le protocole.

Les résultats étaient comparables à ceux obtenus avec des veinules intactes perfusées individuellement. L’avancée était facile et étroitement contrôlée dans des conditions biologiques et des environnements fluides dynamiques, ce qui n’aurait pas été possible avec les techniques de microcompétences conventionnelles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de l’appareil et effectuer des mesures de calcium et d’oxyde nitrique.

Par la suite, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, non seulement pour étudier les agonistes sous-jacents induits, mais aussi pour ouvrir des applications plus larges pour la recherche biomédicale.