Développement et caractérisation de

L'objectif général de cette procédure est de concevoir un dispositif microfluidique permettant aux cellules endothéliales de croître sous un écoulement de cisaillement physiologiquement pertinent et de mesurer les modifications induites par un agoniste dans leur production de calcium et d'oxyde nitrique. Ce protocole peut contribuer à faire progresser la recherche sur les microvaisseaux, en validant le modèle in vitro de microvaisseau et en comblant les écarts entre les études in vivo et in vitro. Les principaux avantages de cette technique résident dans la conception polyvalente des microcanaux, qui imite divers types de vaisseaux sanguins, ainsi que dans l'amélioration de l'environnement de culture cellulaire, plus proche des conditions in vivo que les cultures statiques classiques.

Les procédures seront démontrées par Sulei et Xiang, les deux membres de mon laboratoire. Avant de commencer, utilisez la photolithographie standard pour créer un moule maître et la lithographie douce pour fabriquer les dispositifs microcanaux en PDMS, comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les dispositifs microcanaux, couvrez d'abord l'entrée et la sortie avec un morceau fin de PDMS et placez le dispositif dans une boîte de Pétri avec un morceau de tissu humide.

Ensuite, enveloppez la boîte avec du Parafilm et stérilisez l'appareil sous une lumière UV pendant au moins trois heures. L'étape suivante consiste à appliquer la fibronectine. Commencez par déposer une goutte de 30 à 50 microlitres de PBS à l'entrée.

Créez un vide à la sortie pour rincer le dispositif. Ensuite, déposez une goutte de fibronectine à 100 microgrammes par millilitre à l'entrée. Créez un vide à la sortie pour charger la solution de fibronectine.

Ensuite, couvrez l'entrée et la sortie. Enveloppez à nouveau la boîte avec du Parafilm et incubez le dispositif toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez manuellement le dispositif trois fois avec du PBS.

Ensuite, chargez-le avec 30 à 50 microlitres de milieu de culture cellulaire et faites réchauffer l'appareil dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Commencez par mélanger les HUVECs dans le milieu de culture des HUVECs contenant 8 % de dextrane à une concentration de deux à quatre millions de cellules par millilitre. Le dextrane est nécessaire pour augmenter la viscosité et ainsi améliorer l'ensemencement cellulaire.

Ensuite, déposez 10 à 20 microlitres de cellules sur l'entrée et introduisez-les par gravité ou par action capillaire à l’aide d’une pipette Pasteur en verre placée à la sortie. Incubez ensuite le dispositif pendant 15 à 20 minutes. Puis, vérifiez l’état d’ensemencement au microscope.

Si nécessaire, chargez davantage de cellules afin d'atteindre la densité cellulaire souhaitée. Une fois le nombre suffisant de cellules chargé, rincez délicatement le dispositif avec un milieu de culture cellulaire normal et tiède pour éliminer le dextran. Incubez ensuite le dispositif sans perfusion de milieu pendant six heures.

Ensuite, préparez les raccordements de tubulure pour la perfusion à long terme. Fixez le dispositif à une boîte de Pétri à l’aide de ruban adhésif, puis reliez la tubulure d’entrée à une seringue munie d’une aiguille. Insérez la tubulure dans l’entrée et la sortie du dispositif.

Reliez le tube de sortie à un collecteur de déchets. Placez ensuite la boîte et le récipient de déchets dans un incubateur. Connectez la seringue munie d'un long tube d'entrée à une pompe de perfusion externe qui traverse la porte de l'incubateur.

Ensuite, régler le débit de perfusion en fonction du plan expérimental. Grâce à une perfusion bien contrôlée, la culture dans le réseau microvasculaire peut être maintenue jusqu'à deux semaines. Elle peut ainsi être étendue à des études à plus long terme, imitant l’environnement cellulaire et hémodynamique dans différentes conditions physiologiques et pathologiques.

Pour commencer la coloration immuno-histochimique, comme l'étiquetage de la VE-cadhérine, fixez d'abord les cellules par perfusion avec du paraformaldéhyde à deux pour cent pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après une série de perfusions destinées à bloquer, permeabiliser et colorer avec des anticorps, conservez le dispositif à quatre degrés Celsius jusqu'à l'acquisition des images cellulaires. Pour visualiser la concentration en calcium dans les cellules, perfusez le dispositif avec 10 milligrammes par millilitre d'albumine en solution de Ringer pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, perfuser l'appareil avec du Fluo-4 AM à cinq micromoles pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, éliminer par lavage le Fluo-4 AM lié à la lumière avec du Ringer albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, démarrer le système confocal pour l'imagerie du taux de calcium intracellulaire à l'aide du Fluo-4 AM. Acquérir des images des microvaisseaux chargés en Fluo-4.

Acquérir les images de base pendant 10 minutes. Ensuite, perfuser l'appareil en continu avec de l'ATP à 10 micromolaire et enregistrer les variations de l'intensité de fluorescence pendant 20 minutes. Pour imager la production d'oxyde nitrique dans les cellules, perfuser l'appareil avec du Ringer albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, perfuser les cellules avec 5 micromolaires de DAF-2 DA pendant environ 35 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, préparer le système d'imagerie de fluorescence pour mesurer la production de monoxyde d'azote induite par l'ATP. Enregistrer la ligne de base pendant 5 minutes, puis perfuser le dispositif avec 10 micromolaires d'ATP et recueillir les images pendant 30 minutes à des intervalles d'une minute.

Pour la mesure du monoxyde d'azote dans les cellules, il est important de comprendre que le détachement de l'adaptateur pour le profil d'intensité représente une production cumulative de monoxyde d'azote dans le temps et non une concentration de monoxyde d'azote. Sélectionnez manuellement les régions d'intérêt sur les images recueillies au niveau de la cellule individuelle. Chaque ROI couvre la surface d'une cellule individuelle, qui peut être indiquée par le contour de fluorescence.

Quantifiez les variations du calcium endothélial et de l'oxyde nitrique induites par l'ATP. Pour ce faire, calculez les variations de l'intensité de fluorescence de Fluo-4, après soustraction du fond tissulaire. Quantifiez la vitesse de production d'oxyde nitreux en effectuant la dérivée première de l'intensité de fluorescence de DAF-2 au cours du temps.

Le motif de microcanaux dans le dispositif présente un réseau de branchement à trois niveaux. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour estimer les distributions de contrainte de cisaillement à un débit de 0,35 microlitre par minute. Les cellules endothéliales ont été semées dans le réseau comme décrit.

Ensuite, l'actine F et les noyaux ont été marqués. De même, la VE-cadhérine a également été colorée. Les résultats étaient similaires à l'expression de la VE-cadhérine dans une vénule intacte.

Ensuite, les augmentations induites par l'ATP du calcium intracellulaire et de la production d'oxyde nitrique ont été examinées. Les niveaux de calcium ont été mesurés à l'aide de Fluo-4 AM, comme décrit dans la section de protocole. La production d'oxyde nitrique a été suivie à l'aide de DAF-2 DA, comme décrit dans la section de protocole.

Les résultats étaient comparables à ceux obtenus avec des veinules intactes perfusées individuellement. L'approche était simple et rigoureusement contrôlée dans des conditions biologiques et des environnements fluides dynamiques, ce qui n'aurait pas été possible avec des techniques microchirurgicales conventionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer le dispositif et effectuer des mesures de calcium et d'oxyde nitrique.

Après que cette technique ait ouvert la voie aux chercheurs, non seulement pour étudier les mécanismes sous-jacents induits par les agonistes, mais aussi pour élargir les applications à la recherche biomédicale.