Name: Développement et caractérisation de In vitro Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de lendothélium Ca 2+ i Et production doxyde nitrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez la culture de cellules endothéliales HUVEC dans un dispositif microfluidique pour mesurer le calcium intracellulaire et la production d'oxyde nitrique en temps réel. Cette méthode valide un modèle de microvaisseau in vitro.

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Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL56237, Institut national du diabète et de l&#39;appareil digestif et maladies rénales Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 et EPS-1003907).

1. microfluidique Fabrication de périphériques <ol><li> Photolithographie standard Fabrication d&#39;un moule SU-8 50 Maître <ol><li> Nettoyer la tranche de silicium avant centrifugation. Rincez nue tranche de silicium de 2 pouces avec de l&#39;acétone pendant 15 min suivi par l&#39;alcool isopropylique (IPA) pour 15 min. Déshydrater la plaquette en la plaçant sur une plaque chauffante à 150 ° C pendant 1 heure. Après séchage, refroidir la plaquette à température ambiante. </li><li> Spin-coat la plaquette de silicium avec SU-8. Ajouter 2 ml SU-8 sur la plaquette. Rampe de la plaquette à 500 tours par minute à une accélération / s 100 rpm pendant 10 s, suivie de 1000 tours par minute à une accélération / s 300 rpm pendant 30 s. (Voir la vidéo supplémentaire 1) </li><li> Pré-cuire la galette sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10 min, cuire ensuite douce à 95 ° C pendant 30 min. </li><li> Utiliser l&#39;exposition aux UV pour transformer le modèle conçu à partir d&#39;un masque de film à la photoréserve enduite par centrifugation. Imprimez le motif sur un film transparent mince comme un masque de film. Placer le masque de film sur la partie supérieure de laenduction centrifuge résine photosensible et exposer aux UV avec une dose de 300 mJ / cm2. (Voir la vidéo supplémentaire 2) Remarque: Dans ce protocole, le modèle de réseau de microcanaux (159 um canaux mères larges ramifications en quatre 100 um canaux fille large) est conçu avec le logiciel de CAO. Le motif sur le film montre comme un champ libre et le reste du film est couvert par l&#39;encre noire. Parce que SU-8 est une résine photosensible négative, la partie de la résine photosensible qui est exposée aux rayons UV sera réticulé et deviennent insolubles dans le solvant au cours du développement de moisissures (étape 1.1.6). Après le développement, cette portion insoluble va reproduire le motif de réseau conçu et servir en tant que moule maître. </li><li> Post-cuisson de la tranche exposée sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 1 min, puis 95 ° C pendant 10 min. </li><li> Développer le moule maître. Utilisez SU-8 développeur comme solvant pour enlever la résine photosensible de non-réticulé. Immerger la plaquette dans SU-8 développeur pendant 3 minutes et rincer avec de l&#39;IPApendant 1 min. </li><li> Répétez ce cycle de développement 2-3 fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y a pas de formation de bande blanche (résidu de résine photosensible non durcie) après le rinçage IPA. Séchez délicatement la tranche avec de l&#39;azote gazeux et d&#39;examiner les petits éléments du modèle sous un microscope. Répéter les cycles de développement supplémentaires si nécessaire. </li><li> Dur cuire la galette sur une plaque chaude à 150 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Lithography souple <ol><li> Manuellement mélanger les deux parties (base et durcisseur) de polydiméthylsiloxane (PDMS) élastomère à un poids. rapport de 10: 1. </li><li> De gaz, le mélange PDMS avec un dessiccateur relié à un vide de la maison pendant 15 min. Cast la solution PDMS sur le moule maître de résine photosensible. L&#39;épaisseur du PDMS doit être supérieure à 3 mm pour fournir un maintien stable de la tubulure d&#39;entrée / sortie. De gaz PDMS à nouveau pendant 15 minutes, et éliminer les bulles d&#39;air restantes avec de l&#39;azote gazeux si nécessaire. Cure PDMS casted dans un four à 65 ° C pendant 3 heures. </li><li> Nettoyer la surface dela lamelle de verre avec un ruban adhésif et un nettoyeur à plasma (de traitement par plasma 30 sec). PDMS Spin-manteau un-durci (0,5 ml) sur la lamelle de verre par rampe à 4000 tours par minute à un taux d&#39;accélération / sec 500 rpm pendant 30 secondes. Traiter le PDMS lamelle couvre-objet revêtu par centrifugation dans un four à 65 ° C pendant au moins 30 min. </li><li> Couper et libérer les PDMS durcis du moule maître. Ensuite, créer une entrée et une sortie avec un 1 mm perforatrice de diamètre à l&#39;extrémité distale des canaux mères. </li><li> Bond du dispositif à la lamelle de verre PDMS spin-enduit. Oxyder les surfaces des PDMS et Coverslip avec un nettoyeur à plasma pendant 1 min. Après le traitement par plasma d&#39;oxygène, déposer une goutte d&#39;eau déminéralisée (DI eau) à la surface de collage, et de placer les deux parties ensemble. Cuire au four le dispositif dans un four à 65 ° C pendant 30 min pour obtenir une liaison permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Vidéo supplémentaire 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Supplemental Vidéo 1 (clic pour télécharger).</a> <img alt="Supplemental Vidéo 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Supplemental Vidéo 2 (clic pour télécharger).</a> 2. Ensemencement des cellules endothéliales et de la culture <ol><li> Stérilisation de périphériques et fibronectine Coating <ol><li> Préserver la propriété hydrophobe de la surface PDMS autour de l&#39;entrée / sortie de l&#39;oxydation. Couvrez la surface PDMS autour de l&#39;entrée et de sortie avec de petites bandes de ruban adhésif pour empêcher l&#39;oxydation. Cette procédure permet d&#39;éviter la propagation de l&#39;eau déminéralisée sur toute la surface supérieure du dispositif pendant l&#39;étape de remplissage (2.1.3). </li><li> Traiter le dispositif PDMS avec un plasma d&#39;oxygène for 5 min pour modifier la surface hydrophile, ce qui facilite l&#39;écoulement de fluide à travers le canal et empêcher le piégeage de la bulle dans la procédure de remplissage (2.1.3). </li><li> Utiliser une seringue avec une aiguille fixée ou une pipette pour remplir le dispositif avec de l&#39;eau DI de l&#39;entrée. Continuer le remplissage jusqu&#39;à ce qu&#39;une goutte d&#39;eau déminéralisée (30 à 50 pi) à la sortie accumulée. Examiner l&#39;appareil sous un microscope pour vérifier s&#39;il y a des bulles emprisonnées à l&#39;intérieur du microcanal. Enlever la goutte d&#39;eau excessive à l&#39;entrée et à la sortie avec un mouchoir en papier. </li><li> Stériliser le dispositif dans une boîte de Pétri avec UV pour un minimum de 3 heures dans une hotte de biosécurité laminaire. Pour éviter l&#39;évaporation, couvrir l&#39;entrée / sortie avec un mince morceau de PDMS, mettre un mouchoir en papier humide à l&#39;intérieur du plat, et envelopper le plat avec Parafilm. </li><li> Enduire le dispositif avec la fibronectine. Rincer le premier dispositif avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis enduire de 100 pg / ml de fibronectine pendant une nuit dans un réfrigérateur (4 ° C). Placez une gouttelette de solution à l&#39;entrée, puis créer une pression négative à la sortie avec un vide de la maison, une seringue avec une aiguille ou une pipette. </li><li> Remplir le dispositif avec un milieu de culture cellulaire. Rincer l&#39;appareil avec du PBS manuellement 3 fois avant de charger les milieux de culture cellulaire. Réchauffez l&#39;appareil dans un incubateur à 37 ° C. </li></ol></li><li> CEs Semis et Perfusion à long terme Remarque: La comparaison avec la culture statique conventionnelle 2D CE, le modèle de réseau in vitro avec des microvaisseaux perfusion continue a fait le milieu de culture cellulaire plus proche des conditions in vivo. Le vitro réseau de microvaisseaux en évidence dans ce protocole peut être maintenu jusqu&#39;à deux semaines. La perfusion bien contrôlée en permanence reconstituer les éléments nutritifs, éliminer les déchets et éviter une confluence de la monocouche CE. Par conséquent, il peut être étendu à une études à long terme, imitant l&#39;environnement cellulaire et hémodynamique sous Physiologica différentel et états pathologiques. <ol><li> Mélanger HUVEC primaires dans HUVEC milieux de culture (MCDB 131) avec 8% de dextran (de poids moléculaire 70.000). Le dextrane est utilisé pour augmenter la viscosité du milieu de chargement et d&#39;obtenir un meilleur résultat de l&#39;ensemencement des cellules. La densité cellulaire recommandée est d&#39; environ 2-4 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ensemencer les cellules dans le dispositif. Placez une goutte 10-20 ul de cellules sur l&#39;entrée. Introduire un léger flux soit par l&#39;inclinaison du dispositif, ou une action capillaire à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre à la sortie. La clé pour une charge de cellule couronnée de succès consiste à contrôler la vitesse d&#39;écoulement inférieure à 1 mm / s dans les petits canaux. </li><li> Vérifiez l&#39;ensemencement des cellules. Après l&#39;ensemencement initial, incuber le dispositif pendant 15-20 min (atmosphère humidifiée de 5% de CO 2 à 37 ° C) avant de vérifier l&#39;état de semis sous le microscope. Si nécessaire, effectuer le chargement de la cellule supplémentaire pour atteindre une densité cellulaire souhaitée. </li><li> Rincer délicatement le dispositif avec un milieu de culture cellulaire (37° C) pour éliminer le dextran. Culture du dispositif en l&#39;absence d&#39;écoulement pour les 6 premières heures dans un incubateur (5% de CO 2 à 37 ° C). </li><li> Mettre en place la connexion de tubes pour perfusion à long terme. Tape le dispositif dans une boîte de Pétri pour empêcher le mouvement. Créer des petits trous sur le couvercle de la boîte de Petri pour l&#39;entrée et la tubulure de sortie des insertions. Raccorder le tuyau d&#39;entrée à une seringue avec une aiguille pour la perfusion de la culture cellulaire de support. Connecter le tuyau de sortie à un collecteur de déchets. Remarque: Placez l&#39;appareil et le collecteur de déchets dans un incubateur de culture cellulaire, tout en plaçant une pompe à perfusion en dehors de l&#39;incubateur et le connecter avec le dispositif par la longue tubulure d&#39;admission. Le taux de perfusion est déterminé par la conception expérimentale. Dans le présent dispositif, utiliser un débit de perfusion de 0,35 pi / min et une plage de contrainte de cisaillement entre 1-2 dyne / cm 2. Sous cette condition de perfusion, les HUVEC atteignent la confluence dans environ 3-4 jours. </li></ol></li></ol> 3. Jemmunofluorescent coloration <ol><li> Fixer CEs dans le dispositif par perfusion de paraformaldehyde à 2% pendant 30 min à 4 ° C, puis 1 x PBS rinçage à température ambiante pendant 15 min et 1% de BSA blocage pendant 30 min. Utiliser un débit de perfusion qui est le même que celui utilisé pour la culture cellulaire. </li><li> Perméabiliser CEs fixée pour la coloration d&#39;anticorps avec 0,1% de Triton X-100. Perfuser l&#39;appareil avec du Triton pour 5-7 min à l&#39;étiquette VE-cadhérine, et 3 min à l&#39;étiquette F-actine. </li><li> Chargez les anticorps dans le dispositif. Perfuser l&#39;appareil avec 1x PBS pendant 15 minutes pour se laver les solutions précédentes. Chargez manuellement l&#39;anticorps primaire contre VE-cadhérine (anti-chèvre) dans le dispositif à la concentration de 2 pg / ml (le volume total est de 20-50 pi). Gardez l&#39;appareil dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. Perfuser l&#39;anticorps secondaire (âne anti-chèvre) par une pompe à seringue à la concentration de 7 ug / ml pendant 45 à 60 min. </li><li> Étiquette CE F-actine avec phalloïdine. Perfuser l&#39;appareil avec fo 1x PBSr 15 min avant de le charger manuellement phalloïdine (10 pg / ml) pendant 7 à 10 min. </li><li> Étiquette noyaux CE (voir liste des matières). </li><li> Rincer l&#39;appareil avec PBS 1x et le maintenir à 4 ° C jusqu&#39;à formation d&#39;image. </li></ol> 4. Fluorescence Imaging de endothéliale [Ca 2+] i <ol><li> Perfuser le dispositif avec de l&#39;albumine (10 mg / ml), la solution de -Ringer pendant 15 min à 37 ° C. Utiliser le même débit de perfusion comme celui utilisé pour la culture cellulaire. Les concentrations de tous les composants de la solution de l&#39; albumine-Ringer sont décrites dans la liste des matières. </li><li> Mettre en place le système confocal pour CE [Ca2 +] i imagerie avec Fluo-quatre heures. Utiliser un système microscopique confocale pour Ca l&#39;imagerie. Utilisez un laser à argon (488 nm) pour l&#39;excitation et fixer la bande d&#39;émission comme 510-530 nm. Recueillir les images avec un objectif 25X (immersion dans l&#39;eau, NA: 0,95) à 512 x 512 format de balayage. Z utiliser une étape de 2 pm et un intervalle de balayage pour chaque pile d&#39;images de 20 sec. </li><li> Perfuser l&#39;appareil avec Fluo-4 AM (5 uM) pendant 40 min à 37 ° C, puis laver la lumière fluo-4 AM avec la solution de l&#39;albumine-Ringer. </li><li> Acquérir les images de microvaisseaux FLUO-4 chargé. Recueillir les images de base pendant 10 min. Perfuser le dispositif avec de l&#39;ATP (10 uM) et enregistrer les changements d&#39;intensité de fluorescence (FI) pendant 20 min. </li></ol> 5. Fluorescence Imaging de production d&#39;oxyde nitrique <ol><li> Perfuser le dispositif avec la solution de l&#39;albumine-Ringer pendant 15 min. Utiliser un débit de perfusion qui est le même que celui utilisé pour la culture cellulaire. </li><li> Mettre en place le système d&#39;imagerie de fluorescence pour mesurer la production d&#39;oxyde nitrique ATP-induite. Utiliser un microscope équipé d&#39;une caméra CCD numérique de 12 bits et un obturateur commandé par ordinateur pour la mesure de l&#39;oxyde nitrique. Utiliser une lampe au xénon de 75 W comme source de lumière. Remarque: Sélectionner la longueur d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission pour le DAF-2 DA par un filtre d&#39;interférence (480/40 nm) et un miroir dichroïque(505 nm) avec une barrière de bande passante (535/50 nm). Utilisez un objectif 20X (NA: 0,75) pour recueillir les images. Pour réduire au minimum le photoblanchiment, placer un filtre de densité neutre (0,5 N) devant le filtre d&#39;interférence et de limiter le temps d&#39;exposition de 0,12 seconde. </li><li> Chargez les cellules avec DAF-2 DA (5 uM). Perfuser l&#39;appareil avec DAF-2 DA pour environ 35-40 min à 37 ° C. Notez la ligne de base DAF-2 intensité de fluorescence (FI DAF) après le chargement initial. Note: DAF-2 DA est continuellement présent dans le perfusat pendant toute l&#39;expérience 7. </li><li> Collecter DAF-2 images. Notez la ligne de base FI DAF pendant 5 min. Perfuser le dispositif avec de l&#39;ATP (10 uM) et de recueillir les images pendant 30 minutes avec des intervalles de 1 min. Recueillir toutes les images à partir du même groupe de cellules dans le même plan focal. </li></ol> Analyse 6. Données <ol><li> Sélectionnez manuellement la région d&#39;intérêts (ROI) à partir des images recueillies au niveau de la cellule individuelle. ChaqueROI couvre la zone d&#39;une cellule individuelle, qui peut être indiquée par le contour de la fluorescence. </li><li> Soustraire fluorescence de fond et calculer la FI moyenne de chaque ROIs. </li><li> Mesurer les changements ATP-induits dans CE [Ca2 +] i et la production de NO. Quantifier changements ATP-induits dans CE [Ca2 +] i en calculant les variations de Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, où FI 0 est la FI base moyenne pendant la perfusion d&#39; albumine-Ringer avant d&#39; ajouter ATP) moins la mesure Contexte. Quantifier NO taux de production en effectuant la première conversion différentielle de la FI DAF au fil du temps. Note: Le cours du temps de FI DAF représente une production de NO cumulatif avec le temps. Par conséquent, aucun taux de production est calculée sur la base du profil de FI DAF sous basale et stimulée ATP conditions. Les détails de l&#39; analyse des données et les procédures expérimentales ont été décrites dans une publication antérieure 7. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont aucun conflit d&#39;intérêts ou des conflits d&#39;intérêts à divulguer.

<html> Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour le développement du réseau de microvaisseaux culture, la caractérisation des jonctions CE et cytosquelette distribution F-actine, et les mesures quantitatives des CE [Ca2 +] i et la production de NO en utilisant un dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique perfusé fournit un modèle in vitro qui permet une simulation proche des in vivo géométries de microvasculaires et des conditions d&#39;écoulemen...

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l&#39; écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire 1,2. La technologie microfluidique permet à un fluide régulé avec précision à travers un micro - géométrie contrainte (inférieure au millimètre) , les canaux 3, ce qui offre la possibilité aux cellules mises en culture, en particulier pour vasculaires endothéliales, de croître sous des conditions d&#39;écoulement désirées. Ces caractéristiques rendent les conditions de culture cellulaire plus proche in vivo que les cultures classiques, des cellules 2D statique. Ils sont extrêmement importants lorsque les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour modéliser différents types de systèmes vasculaires et d&#39;étudier les réponses des CE aux stimulations mécaniques et / ou chimiques. En dépit des avantages démontrés par le réseau de micro-canaux sur une culture cellulaire statique, l&#39;adaptation et l&#39;application de la microfluidique dans le f biomédicalield restent limitées. Rapporté par une récente étude, la majorité des publications de ce domaine (85%) sont encore dans des revues d&#39;ingénierie 4. La performance des dispositifs microfluidiques n&#39;a pas été assez convaincant pour la plupart des biologistes de passer de techniques actuelles, telles que le test Transwell et la glissière boîte de culture / verre macro-échelle à ce dispositif miniaturisé. La microfluidique est un domaine multidisciplinaire, ce qui nécessite des collaborations interdisciplinaires pour faire avancer ce domaine avant. L&#39;objectif de cet article technique est de réduire les écarts de connaissances entre les disciplines et rendre les procédures de fabrication compréhensible par les biologistes, tout en assurant l&#39;application biologique et la validation fonctionnelle des microvaisseaux microfluidiques. Les protocoles expérimentaux visualisés comprennent la fabrication des deux dispositifs microfluidiques et leurs utilitaires biologiques, ce qui représente une étroite collaboration entre les ingénieurs et les biologistes. Nous avons récemment rapporté certainsapplications biologiques en utilisant le réseau de microvaisseaux in vitro avec dispositif microfluidique 5. Afin de concevoir de manière appropriée les dimensions du réseau de microcanaux et d&#39;appliquer la contrainte de cisaillement souhaitée, un modèle numérique a été construit avec le logiciel de dynamique des fluides computationnelle pour estimer étroitement le profil d&#39;écoulement. Les cellules primaires de la veine ombilicale humaines endotheliales (HUVEC) qui ont été ensemencés dans les microcanaux ont atteint la confluence, soit couvert l&#39;ensemble des surfaces internes du micro - canal, en 3-4 jours avec une perfusion continue. La formation de la barrière adéquate a été démontrée par la VE-cadhérine et la coloration par rapport à ceux formés dans des conditions de culture cellulaire statiques et dans les microvaisseaux intactes. En appliquant les protocoles expérimentaux développés en microvaisseaux intacts perfusés individuellement 6-8, nous quantitativement mesuré les changements dans la CE [Ca2 +] i et de l&#39;oxyde nitrique (NO) en réponse à l&#39; adénosine triphosphate (ATP) avec fluorescent dansindicateurs et confocale et la microscopie par fluorescence conventionnelle. Les augmentations induites par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été rapportés en tant que signaux intracellulaires nécessaires pour inflammatoires augmentations induites médiateur-en microvaisseaux perméabilité 6-15. Bien que certaines études antérieures ont montré des images de dispositifs microfluidiques DAF-2 DA chargés 16,17, la résolution et des données appropriées analyse n&#39;a pas encore atteint 18 ans. À notre connaissance, cette étude démontre les premières mesures quantitatives de changement dynamique induite par l&#39; agoniste en endothéliales [Ca 2+] i et la production de NO en utilisant microfluidique système basé. Techniques de microfabrication ont la possibilité de fabriquer des microcanaux jusqu&#39;à quelques microns et permettre le développement de modèles complexes pour imiter les géométries de microvascularisation in vivo. Ici, nous avons présenté un réseau de microcanaux typique avec trois niveaux de ramification. Cele réseau est fabriqué par la combinaison de la photolithographie, qui est réalisé dans une salle blanche de microfabrication et la lithographie molle.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de cerveau bovin (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Recouvrement</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre IgG (H+L) Anticorps secondaires</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (coloration des noyaux)&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Verre Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sel sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solution saline tamponnée</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solution de sonnerie de mammifère Ingrédient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot ; 2H2O (2,0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 &middot ; 7H2O (1,2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5,5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (5,0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sel de Hepes (9,1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Acide de Hepes (10,9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium Life</td><td>technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine (coloration à l’actine F)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photorésine</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>flacons de culture tissulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Tube de microalésage en PTFE, 0,012 » ID x 0,030 » OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadhérine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>Nom de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments/DescriptionBiosafety</td></tr> <tr><td>Capot laminaire</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Classe II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Four</td><td>Isotemp Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithographie banc</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Lithographie</td><td></td>de contact</tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Nikon</td><td>L200 ND & Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Obturateur pour la caméra CCD</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Système de pompe à seringue</td><td>Harvard Appareil</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>Nom du logiciel</td><td> Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Commentaires/Description</td></tr><tr><td>Logiciel de CAO</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de simulation CFD</td><td>COMSOL COMSOL</td><td>Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition et analyse d’images pour la production NO&nbsp ;</td><td>Imagerie universelle</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

développement et caractérisation de<em&gt; in vitro</em&gt; microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; et production d&#39;oxyde nitrique

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l&#39; écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire. Bien que le développement de dispositifs microfluidiques a été adopté par les ingénieurs plus de deux décennies, leurs applications biologiques restent limitées. Un modèle in vitro plus physiologiquement pertinents dans des microvaisseaux validées par des applications biologiques est important pour faire avancer le terrain et combler les lacunes entre in vivo et in vitro des études. Ici, nous présentons des procédures détaillées pour le développement du réseau de microvaisseaux cultivées en utilisant un dispositif microfluidique avec une capacité de perfusion à long terme. Nous démontrons également ses applications pour des mesures quantitatives de changements induits par un agoniste de la CE [Ca2 +] i et de l&#39; oxyde nitrique (NO) la production en temps réel en utilisant la microscopie confocale et de fluorescence conventionnelle. Le filet de microvaisseaux formétravail avec perfusion continue a montré des jonctions bien développées entre CEs. la distribution VE-cadhérine était plus proche de celle observée dans les microvaisseaux intacts que monocouches CE statiquement cultivées. ATP-induit des augmentations transitoires CE [Ca2 +] i et la production de NO ont été quantitativement mesurée à des niveaux de cellules individuelles, qui a validé la fonctionnalité des microvaisseaux de culture. Ce dispositif microfluidique permet ECs de croître sous un flux physiologiquement pertinente bien contrôlée, ce qui rend l&#39;environnement de culture cellulaire plus proche de in vivo que dans les cultures, 2D statiques classiques. La conception du réseau de microcanaux est très polyvalent, et le processus de fabrication est simple et reproductible. Le dispositif peut être facilement intégré au système microscopique confocale ou conventionnelle permettant l&#39;imagerie haute résolution. Plus important encore, parce que le réseau de microvaisseaux de culture peut être formé par CEs humaines primaires, cette approche servira comme un outil utile pour étudier commentpathologiquement modifiés composants sanguins à partir d&#39;échantillons de patients affectent CEs humaines et permettent de mieux comprendre les problèmes cliniques. Il peut également être mis au point en tant que plate-forme pour le criblage de médicaments.

Cette section présente quelques-uns des résultats obtenus avec le réseau de microvaisseaux culture développée avec ce protocole. Le motif de micro - canaux est un réseau de dérivation à trois niveaux (figure 1A). Dans cette conception, un 159 m de large branches en deux 126 um canaux larges, et les branches de canal mère à nouveau en quatre 100 um canaux filles larges. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour évaluer les distributions de contraintes de cisaillemen...

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir un dispositif microfluidique permettant aux cellules endothéliales de croître sous un écoulement de cisaillement physiologiquement pertinent et de mesurer les modifications induites par un agoniste dans leur production de calcium et d'oxyde nitrique. Ce protocole peut contribuer à faire progresser la recherche sur les microvaisseaux, en validant le modèle in vitro de microvaisseau et en comblant les écarts entre les études in vivo et in vitro. Les principaux avantages de cette technique résident dans la conception polyvalente des microcanaux, qui imite divers types de vaisseaux sanguins, ainsi que dans l'amélioration de l'environnement de culture cellulaire, plus proche des conditions in vivo que les cultures statiques classiques.Les procédures seront démontrées par Sulei et Xiang, les deux membres de mon laboratoire. Avant de commencer, utilisez la photolithographie standard pour créer un moule maître et la lithographie douce pour fabriquer les dispositifs microcanaux en PDMS, comme décrit dans le protocole textuel. Pour préparer les dispositifs microcanaux, couvrez d'abord l'entrée et la sortie avec un morceau fin de PDMS et placez le dispositif dans une boîte de Pétri avec un morceau de tissu humide.Ensuite, enveloppez la boîte avec du Parafilm et stérilisez l'appareil sous une lumière UV pendant au moins trois heures. L'étape suivante consiste à appliquer la fibronectine. Commencez par déposer une goutte de 30 à 50 microlitres de PBS à l'entrée.Créez un vide à la sortie pour rincer le dispositif. Ensuite, déposez une goutte de fibronectine à 100 microgrammes par millilitre à l'entrée. Créez un vide à la sortie pour charger la solution de fibronectine.Ensuite, couvrez l'entrée et la sortie. Enveloppez à nouveau la boîte avec du Parafilm et incubez le dispositif toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez manuellement le dispositif trois fois avec du PBS.Ensuite, chargez-le avec 30 à 50 microlitres de milieu de culture cellulaire et faites réchauffer l'appareil dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Commencez par mélanger les HUVECs dans le milieu de culture des HUVECs contenant 8 % de dextrane à une concentration de deux à quatre millions de cellules par millilitre. Le dextrane est nécessaire pour augmenter la viscosité et ainsi améliorer l'ensemencement cellulaire.Ensuite, déposez 10 à 20 microlitres de cellules sur l'entrée et introduisez-les par gravité ou par action capillaire à l’aide d’une pipette Pasteur en verre placée à la sortie. Incubez ensuite le dispositif pendant 15 à 20 minutes. Puis, vérifiez l’état d’ensemencement au microscope.Si nécessaire, chargez davantage de cellules afin d'atteindre la densité cellulaire souhaitée. Une fois le nombre suffisant de cellules chargé, rincez délicatement le dispositif avec un milieu de culture cellulaire normal et tiède pour éliminer le dextran. Incubez ensuite le dispositif sans perfusion de milieu pendant six heures.Ensuite, préparez les raccordements de tubulure pour la perfusion à long terme. Fixez le dispositif à une boîte de Pétri à l’aide de ruban adhésif, puis reliez la tubulure d’entrée à une seringue munie d’une aiguille. Insérez la tubulure dans l’entrée et la sortie du dispositif.Reliez le tube de sortie à un collecteur de déchets. Placez ensuite la boîte et le récipient de déchets dans un incubateur. Connectez la seringue munie d'un long tube d'entrée à une pompe de perfusion externe qui traverse la porte de l'incubateur.Ensuite, régler le débit de perfusion en fonction du plan expérimental. Grâce à une perfusion bien contrôlée, la culture dans le réseau microvasculaire peut être maintenue jusqu'à deux semaines. Elle peut ainsi être étendue à des études à plus long terme, imitant l’environnement cellulaire et hémodynamique dans différentes conditions physiologiques et pathologiques.Pour commencer la coloration immuno-histochimique, comme l'étiquetage de la VE-cadhérine, fixez d'abord les cellules par perfusion avec du paraformaldéhyde à deux pour cent pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après une série de perfusions destinées à bloquer, permeabiliser et colorer avec des anticorps, conservez le dispositif à quatre degrés Celsius jusqu'à l'acquisition des images cellulaires. Pour visualiser la concentration en calcium dans les cellules, perfusez le dispositif avec 10 milligrammes par millilitre d'albumine en solution de Ringer pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, perfuser l'appareil avec du Fluo-4 AM à cinq micromoles pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, éliminer par lavage le Fluo-4 AM lié à la lumière avec du Ringer albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, démarrer le système confocal pour l'imagerie du taux de calcium intracellulaire à l'aide du Fluo-4 AM. Acquérir des images des microvaisseaux chargés en Fluo-4.Acquérir les images de base pendant 10 minutes. Ensuite, perfuser l'appareil en continu avec de l'ATP à 10 micromolaire et enregistrer les variations de l'intensité de fluorescence pendant 20 minutes. Pour imager la production d'oxyde nitrique dans les cellules, perfuser l'appareil avec du Ringer albumine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, perfuser les cellules avec 5 micromolaires de DAF-2 DA pendant environ 35 à 40 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, préparer le système d'imagerie de fluorescence pour mesurer la production de monoxyde d'azote induite par l'ATP. Enregistrer la ligne de base pendant 5 minutes, puis perfuser le dispositif avec 10 micromolaires d'ATP et recueillir les images pendant 30 minutes à des intervalles d'une minute.Pour la mesure du monoxyde d'azote dans les cellules, il est important de comprendre que le détachement de l'adaptateur pour le profil d'intensité représente une production cumulative de monoxyde d'azote dans le temps et non une concentration de monoxyde d'azote. Sélectionnez manuellement les régions d'intérêt sur les images recueillies au niveau de la cellule individuelle. Chaque ROI couvre la surface d'une cellule individuelle, qui peut être indiquée par le contour de fluorescence.Quantifiez les variations du calcium endothélial et de l'oxyde nitrique induites par l'ATP. Pour ce faire, calculez les variations de l'intensité de fluorescence de Fluo-4, après soustraction du fond tissulaire. Quantifiez la vitesse de production d'oxyde nitreux en effectuant la dérivée première de l'intensité de fluorescence de DAF-2 au cours du temps.Le motif de microcanaux dans le dispositif présente un réseau de branchement à trois niveaux. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour estimer les distributions de contrainte de cisaillement à un débit de 0,35 microlitre par minute. Les cellules endothéliales ont été semées dans le réseau comme décrit.Ensuite, l'actine F et les noyaux ont été marqués. De même, la VE-cadhérine a également été colorée. Les résultats étaient similaires à l'expression de la VE-cadhérine dans une vénule intacte.Ensuite, les augmentations induites par l'ATP du calcium intracellulaire et de la production d'oxyde nitrique ont été examinées. Les niveaux de calcium ont été mesurés à l'aide de Fluo-4 AM, comme décrit dans la section de protocole. La production d'oxyde nitrique a été suivie à l'aide de DAF-2 DA, comme décrit dans la section de protocole.Les résultats étaient comparables à ceux obtenus avec des veinules intactes perfusées individuellement. L'approche était simple et rigoureusement contrôlée dans des conditions biologiques et des environnements fluides dynamiques, ce qui n'aurait pas été possible avec des techniques microchirurgicales conventionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer le dispositif et effectuer des mesures de calcium et d'oxyde nitrique.Après que cette technique ait ouvert la voie aux chercheurs, non seulement pour étudier les mécanismes sous-jacents induits par les agonistes, mais aussi pour élargir les applications à la recherche biomédicale.

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La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans...

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

L'essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l'angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable.

Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em&gt; In Vitro</em&gt; Etude de l&#39;angiogenèse

La fonction des cellules vasculaires dépend de l’activité des messagers intracellulaires.  Il s’agit d’une méthode d’imagerie ex vivo à deux photons qui permet de mesurer les niveaux intracellulaires de calcium et d’oxyde nitrique en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques dans les cellules endothéliales et musculaires lisses individuelles d’une aorte isolée.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Les progéniteurs endothéliaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPS-EP) ont le potentiel de révolutionner les traitements des maladies cardiovasculaires et de permettre la création de modèles de maladies cardiovasculaires plus fidèles. Ici, l'encapsulation des iPSC-EPs dans les microenvironnements tridimensionnels (3D) de collagène et une analyse quantitative du potentiel vasculogenic de ces cellules sont décrites.

Un modèle 3D in vitro et un pipeline computationnel pour quantifier le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC

Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d'être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).

Modèle microfluidique pour imiter l&apos;événement initial de la néovascularisation

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Ce protocole détaille un test in vitro permettant de mesurer l’absorption cellulaire des lipides dans les cellules endothéliales lors d’une stimulation avec des analogues fluorescents BODIPY-C12 et BODIPY-C16 d’acides gras saturés à longue et très longue chaîne. Cette méthode est efficace et adaptable à d’autres types de cellules, offrant une approche utile pour étudier le métabolisme des lipides.

Quantification de l’absorption des acides gras endothéliales à l’aide d’analogues d’acides gras fluorescents

Découvrez la culture de cellules endothéliales HUVEC dans un dispositif microfluidique pour mesurer le calcium intracellulaire et la production d'oxyde nitrique en temps réel. Cette méthode valide un modèle de microvaisseau in vitro.

Développement et caractérisation de In vitro Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de lendothélium Ca 2+ i Et production doxyde nitrique (Vidéo) | JoVE Journal

Développement et caractérisation de

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