Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la cytométrie en flux pour isoler la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux humain pour le phénotypage des différentes populations de cellules immunitaires présentes dans le tissu adipeux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche métabolique, telles que quelles cellules immunitaires s’accumulent dans le tissu adipeux des personnes obèses et dans quelle mesure. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer simultanément plusieurs marqueurs sur les cellules immunitaires et d’identifier et de quantifier ces cellules immunitaires dans le tissu adipeux.

Bien que cette technique puisse fournir des informations cruciales sur l’inflammation du tissu adipeux, elle peut également être appliquée à d’autres organes et tissus. En général, les personnes novices dans cette technique seront principalement confrontées à la contamination des cellules vasculaires stromales et à la perte de cellules pendant la procédure de coloration. Deux de mes candidats au doctorat, Suzan Wetzels et Mitchell Bijnen, exécuteront le protocole.

Commencez par utiliser un scalpel pour émincer un gramme de biopsie du tissu adipeux en morceaux d’environ deux millimètres carrés. Transférez les morceaux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase aux échantillons. Incuber les fragments de tissu pendant 60 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius à 60 cycles par minute.

Suivi d’une filtration à travers une crépine de 200 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Rincez le filtre avec sept millilitres de PBS avant la centrifugation. Ensuite, à l’aide d’une pipette, vous pouvez retirer le surnageant sans immerger toute la pointe de la pipette dans la solution.

La pastille doit être clairement visible et éliminer presque tout le surnageant pour éviter la contamination de la fraction vasculaire stromale par des cellules adipeuses. Nous suspendons la pastille de cellules vasculaires stromales avec cinq millilitres de PBS frais et filtrons la fraction vasculaire stromale à travers une crépine de 70 micromètres dans un nouveau tube. Après la centrifugation, nous suspendons la pastille de fraction vasculaire stromale lavée dans trois millilitres de tampon de lyse érythrocytaire pendant cinq minutes sur de la glace.

Ensuite, arrêtez la lyse avec sept millilitres de PBS et granulez les cellules par centrifugation. Pour colorer la fraction vasculaire stromale pour l’analyse cytométrique en flux, remettez la pastille en suspension dans 90 microlitres de tri cellulaire activé par fluorescence à quatre degrés Celsius, ou tampon FACS, et bloquez la coloration non spécifique avec dix microlitres d’IgG humaines. Répartissez la suspension cellulaire entre deux puits d’une plaque à fond en V de 96 puits et placez les cellules sur de la glace pendant 15 minutes.

À la fin de l’incubation, lavez chaque échantillon avec 100 microlitres de tampon FACS, en retournant la plaque d’un seul mouvement fluide sans tapoter pour jeter les surnageants à la fin de la centrifugation. Assurez-vous que vous pouvez clairement voir le granulé au bas de la plaque avant de le retourner pour éviter la perte de vos cellules pendant la procédure. Remettre en suspension la première pastille dans 29,5 microlitres de cocktail d’anticorps pour le premier panel FACS et la deuxième pastille dans 23 microlitres de cocktail d’anticorps pour le deuxième panel FACS.

Après 30 minutes sur la glace dans l’obscurité, lavez les cellules avec 150 microlitres de tampon FACS par puits et fixez les granules de cellules dans 150 microlitres de solution de formaldéhyde à un pour cent. Transférez les suspensions cellulaires de chaque puits dans les tubes FACS correspondants appropriés et placez les échantillons sur de la glace. Avant l’analyse, chargez une commande négative non colorée sur le cytomètre en flux pour régler les paramètres de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale.

Ajustez ensuite les tensions du cytomètre en flux selon les instructions du fabricant jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient visibles dans les graphiques de diffusion directe et latérale, et qu’une distinction puisse être faite entre les débris et les cellules vivantes. Lorsque tous les paramètres ont été réglés, vortex le premier échantillon expérimental à 800 tr/min pour remettre complètement les cellules en suspension et charger l’échantillon sur le cytomètre. Lisez un minimum de 50 000 événements dans la porte en direct, puis vortex et chargez le deuxième échantillon pour l’analyse comme nous venons de le démontrer.

Pour permettre l’analyse des populations de macrophages du tissu adipeux dans cette expérience représentative, d’autres cellules immunitaires, telles que les cellules T, les cellules B, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles, ont été exclues pour révéler la présence de macrophages CD11b + CD11c + macrophages CD 11C et de cellules dendritiques CD11B + CD11C. La quantification de l’intensité de fluorescence principale de ces cellules a révélé l’expression des cellules dendritiques cytoïdes plasmatiques et des marqueurs de cellules dendritiques génériques sur les cellules CD11B+CD11C+ et CD11Blow-CD11C+, avec une expression plus élevée des deux marqueurs observée sur les cellules CD11Blow-CD11C+, confirmant que les cellules CD11Blow-CD11C+ étaient en fait des cellules dendritiques. Le déclenchement des cellules CD45 positives a révélé des populations de lymphocytes T CD19 positifs et CD3 positifs, ces derniers pouvant être subdivisés en sous-ensembles de lymphocytes T CD3+CD4+T auxiliaires, CD3+CD8+cytotoxiques et CD3-CD56+cellules tueuses naturelles.

Le pourcentage de cellules immunitaires viables a ensuite été calculé pour chaque sujet, révélant une augmentation significative du pourcentage de macrophages CD11B+CD11C+11C+pro-inflammatoires dans le tissu adipeux viscéral des sujets masculins adultes obèses. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder les tampons et les fractions cellulaires sur de la glace, et lors du marquage des cellules avec des anticorps, il est très important de les garder dans l’obscurité.

Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la recherche métabolique d’explorer les altérations des cellules immunitaires dans le tissu adipeux de l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules immunitaires du tissu adipeux et d’effectuer une cytométrie en flux sur ces cellules. Gardez à l’esprit que vous travaillez avec des matières et des substances humaines potentiellement infectieuses, telles que le formaldéhyde, qui peuvent être dangereuses.

Prenez toujours des précautions en portant des gants et des lunettes de sécurité.