Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

L’isolement de cellules à partir d’implants disséqués et leur caractérisation par cytométrie en flux peuvent contribuer de manière significative à la compréhension du schéma de réponse immunitaire contre les implants. Cet article décrit une méthode précise pour l’isolement de cellules d’implants disséqués et leur coloration pour l’analyse par cytométrie en flux.

Ce protocole peut nous aider à caractériser la réponse immunitaire de l’hôte contre différents biomatériaux, ce qui peut par la suite aider à concevoir de meilleurs implants médicaux futurs. La cytométrie en flux nous donne des informations sur les cellules immunitaires qui infiltrent un biomatériau, ce qui nous aide à déterminer les mécanismes de réponse des cellules aux lésions et à l’implantation du matériau, ainsi que des cibles pour améliorer les traitements. Le même protocole peut être modifié pour caractériser la réponse immunitaire dans différents contextes.

Disséquez le muscle quadruple de souris qui ont reçu un implant ECM il y a une semaine et qui ont été recueillies dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieux sans sérum. Enfin, coupez le mouchoir en dés à l’aide de ciseaux. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu enzymatique digestif dans le tube.

Placez le tube contenant le milieu digestif et les mouchoirs en dés dans un incubateur agité pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 100 tr/min. À la fin de l’incubation, filtrez la suspension tissulaire digérée à travers une passoire de 70 microns dans un tube individuel de 50 millilitres. Utilisez une tête de seringue de cinq millilitres pour écraser n’importe quel morceau solide de tissus et lavez la passoire avec du PBS à température ambiante.

Jetez tout résidu restant dans la passoire et ajustez le volume du tube à 50 millilitres avec du PBS à température ambiante. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre les pastilles en suspension dans 10 millilitres de solution froide d’EDTA de cinq millimolaires dans du PBS. Si des cellules sanguines sont présentes dans l’échantillon, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges, incuber pendant 10 minutes, puis ajouter neuf millilitres d’EDTA.

Laissez la suspension sur glace pendant 10 minutes. Ajustez ensuite le volume à 50 millilitres avec du PBS froid. Collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension les granulés et 100 microlitres de PBS froid.

Transférez 10 microlitres de suspension dans des microtubes à centrifuger individuels et mélangez avec 10 microlitres de trip et de bleu pour le comptage. Distribuez le volume restant de cellules dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond en V. Retirez 20 microlitres de cellules du puits et ajoutez-les dans un nouveau puits pour les utiliser comme contrôle non coloré.

Ensuite, utilisez PBS pour porter le volume final dans chaque puits à 200 microlitres. Recueillir les cellules au fond des puits de plaques par centrifugation et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres d’une concentration de 1 à 1000 colorant de viabilité par puits. À la fin de l’incubation, laver chaque puits avec 100 microlitres de PBS frais et remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration par puits.

Après la deuxième centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 50 microlitres d’une dilution de un à 100 bloqueurs de monocytes. Incubez la suspension cellulaire pendant cinq minutes sur de la glace, puis ajoutez 50 microlitres de cocktail d’anticorps. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière.

Lavez ensuite les puits avec 100 microlitres de tampon de coloration par puits. Centrifugez à nouveau les cellules et lavez-les avec 200 microlitres de tampon de coloration. Répétez le processus deux fois de plus, puis remettez les cellules en suspension dans 400 microlitres de tampon de coloration.

Avant d’analyser l’échantillon, exécutez un échantillon non coloré pour permettre d’ajuster la population cellulaire sur un nuage de points latéral par rapport à un nuage de points avant. Ensuite, exécutez l’échantillon coloré. Extraire la signature autofluorescente.

Importez ensuite les fichiers FCS pour les utiliser comme contrôle de démixage. Cliquez sur l’icône de démixage pour ouvrir l’assistant de démixage et effectuez le démixage à l’aide de toutes les commandes de couleur unique en contrôlant les populations positives et négatives. Ensuite, cliquez sur la section QC et regardez l’indice de complexité.

L’indice de complexité est une mesure de la distinction d’un ensemble de signatures spectrales lorsque les signatures spectrales ne sont pas mélangées. Enfin, annulez le mixage de l’échantillon en cliquant sur le démixage en direct. Ici, les résultats d’un 14 faits de couleur sur des tissus de souris témoins peuvent être observés.

Dans cette analyse, plusieurs populations lobbyistes, telles que les neutrophiles ly6g positifs et les classes de monocytes ly6c exprimant moyenne et élevée, ont pu être observées. CD11c élevé CMH deux cellules dendritiques positives étaient facilement apparentes lorsqu’elles étaient opposées à CD11b pour exclure les macrophages et d’autres cellules de la lignée myéloïde telles que les neutrophiles et les monocytes. Un sous-ensemble de cellules dendritiques CD206 positives CD206 a pu être identifié en se concentrant sur cette population CD11c positive, qui comprend à la fois des cellules dendritiques de type CD86 à forte teneur en M1 et des populations de cellules dendritiques à forte teneur en M2 de CD206.

F4/80 a montré un gradient d’expression comme on l’observe couramment dans diverses populations de macrophages. Siglec-F était présent à la fois sur les populations F4-80 positives et négatives, correspondant très probablement à un sous-ensemble de macrophages et à des éosinophiles respectivement. Bien que la coloration avec des marqueurs de surface cellulaire permette de faire ces désignations de types cellulaires, il est important de noter que les cellules exprimant des marqueurs différents doivent être considérées de manière fonctionnelle par opposition à une classification plus binaire.

Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la compréhension de la signature autofluorescente de vos échantillons sous-colorés avant de concevoir votre panneau est essentielle pour obtenir un meilleur mélange. Outre l’analyse des cellules, les cellules isolées peuvent être triées en populations spécifiques pour des évaluations en aval avec des tests cellulaires, in vitro, une analyse transcriptomique ou pour une analyse microscopique afin d’évaluer la morphologie cellulaire. La complexité croissante des analyses par cytométrie en flux des biomatériaux permet de combler le fossé entre les études d’immunologie fondamentale et l’ingénierie de nouvelles thérapies.