Name: Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes disolement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez la caractérisation des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains par imagerie cytométrie de flux. Cette méthode compare deux protocoles d'isolement pour optimiser la recherche immunologique.

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Cette recherche est soutenue par l’Institut national sur l’abus d’alcool et l’alcoolisme, prix K99/R00 AA021264. Le Département d’immunologie, l’Institut de pharmacologie neuro-immunitaire, le Collège de médecine Herbert Wertheim et le Bureau de la recherche et du développement économique de la FIU ont fourni un soutien supplémentaire au laboratoire dans le cadre du programme de démarrage. Gianna Casteleiro a été soutenue par le NIH/NIGMS R25 GM061347. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Des études globales de sang humain ont été examinés et approuvés par le comité d&#39;examen institutionnel (IRB) de CRF, protocole IRB approbation # IRB-13-0440. leukopaks humains ont été achetés auprès de la banque de sang de la communauté à Miami, Floride. 1. Isolement des PBMC par gradient de densité standard Technique <ol><li> Effectuer une dilution 1: 1 de sang avec une solution saline 1x-tamponnée au phosphate dans un flacon T75. </li><li> Introduire à la pipette 15 ml d&#39;une solution à gradient de densité dans 50 ml de tubes de centrifugeuse et soigneusement couche (25 - 30 ml / tube) du sang dilué sur ce gradient. </li><li> Centrifuger pendant 20 min à 1200 x g avec une accélération et une décélération de 1 à 0. </li><li> Après centrifugation, recueillir la couche d&#39;interface (globules blancs) dans un nouveau tube centrifuge de 50 ml et laver les cellules deux fois dans du PBS (3 min à 1.080 xg). Rejeter le surnageant à chaque fois. </li><li> Traiter les cellules avec du chlorure d&#39;ammonium et de potassium de lyse (ACK) du tampon (pour lyser les globules rouges). Ajouter 10 ml de tampon et encubate pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec PBS, centrifuger 3 min à 1.080 xg et jeter le surnageant à chaque fois. </li><li> Enregistrer le culot, qui contiendra les CMSP. </li><li> Procéder à la méthode de purification des monocytes de choix. </li></ol> 2. monocytes Purification par adhésion Méthode <ol><li> Préparer un milieu de culture cellulaire complet contenant de la L-glutamine (300 mg / ml) et additionné de pénicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 pg / ml) et 10% de sérum bovin foetal. </li><li> Permettre d&#39;adhérer PBMC pendant environ 2 heures en les cultivant dans un flacon T75 à une concentration de 5 x 10 7 cellules par 10 ml de milieu complet à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié. </li><li> Après incubation, éliminer les cellules flottantes non adhérentes du flacon de culture et laver délicatement les cellules adhérentes deux fois avec PBS. </li><li> Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de granulocytes humain macr-ophage facteur de stimulation des colonies (GM-CSF) et l&#39;interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml. </li><li> Changer la moitié du milieu et de reconstituer toutes les cytokines 48 h. </li><li> Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs. </li></ol> 3. monocytes Purification par la méthode de séparation magnétique <ol><li> Collecter des PBMC à partir de la technique à gradient de densité standard, verser dans un tube en polystyrène de 5 ml et remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / ml. </li><li> Ajouter un cocktail d&#39;enrichissement de monocytes humains en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Après incubation, ajouter des particules magnétiques en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Apportez suspension cellulaire jusqu&#39;à un volume total de 2,5 ml en ajoutant du tampon PBS, bien mélanger par pipetage de haut en bas 2 - 3 fois. </li><li> Placer le tube de polystyrène sans bouchon dans le dispositif magnétique et mettre de côté à température ambiante pendant 20,5 min. </li><li> Après incubation et dans un mouvement continu, ramasser l&#39;aimant et verser la fraction purifiée souhaitée de monocytes dans un 50 ml tube de centrifugation propre. </li><li> Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de facteur de stimulation de colonies (GM-CSF), de granulocytes-macrophages humains et d&#39;interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml. </li><li> Chaque 48 heures, changer la moitié du milieu, tourner vers le bas à 1.080 xg pendant 5 min et remettre en suspension culot avec les nouveaux médias (cRPMI) et des cytokines. </li><li> Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs. </li></ol> 4. L&#39;exclusion au bleu Trypan dosage de viabilité Remarque: Utilisez cette technique pour obtenir un rendement cellulaire et la viabilité des CMSP, monocytes et MDDCs. <ol><li> la récolte des cellules à l&#39;aide de type trypsine-EDTA et d&#39;effectuer des lavages des flacons et le culot de cellules en utilisant du PBS. En fonction de la taille de la pastille, remettre en suspension dans 5 à 10 ml de PBS pour dissoudre la pastille. </li><li> Dans un tube de micro-centrifugeuse, effectuer une dilution 1: 1 de réactif bleu trypan avec culot cellulaire dilué. </li><li> A partir de ce mélange, aliquote de 10 ul dans une cellule de comptage diapositive et lire les résultats en utilisant un compteur de cellules automatisé selon le protocole du fabricant. Si un compteur de cellules automatisé ne sont pas disponibles, une numération cellulaire similaire est possible en utilisant un hémocytomètre ou d&#39;un compteur manuel. </li></ol> 5. Dosage MTT <ol><li> Cellules de la plaque à une concentration de 4 x 10 4/100 pi de milieu complet par puits dans une plaque à 96 puits. Autoriser 24 h pour les cellules de s&#39;adapter à la culture. </li><li> Incuber et effectuer des lectures à 0 (jour 0), 36 (jour 3) et 84 (jour 7) h respectivement. </li><li> A la fin de l&#39;incubation désiré, retirer le support et le remplacer par 100 ul de PBS seul. </li><li> Préparer l&#39;acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-solution diphényl tétrazolium (MTT) (5 mg / ml) en ajoutant 10 ml d&#39;dimethyl (DMSO) à 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS). </li><li> Ajouter 10 ul (5 mg / ml) de solution de MTT à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 2 heures supplémentaires. </li><li> Après incubation, retirer surnageants contenant du PBS et le mélange de MTT non converti (solution jaune-couleur). </li><li> Ajouter 100 pi de solution de SDS-DMSO dans chaque puits et incuber pendant une heure supplémentaire. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques. </li></ol> 6. surface cellulaire Coloration Analyse par imagerie cytométrie de flux <ol><li> Au bout de 7 jours de différenciation des monocytes purifiés, distribuer des aliquotes 1x10 6 cellules des cellules dendritiques dérivées de monocytes dans le nombre approprié de tubes de 1,5 ml. </li><li> Commencer la coloration de la surface cellulaire par les cellules de blocage à l&#39;aide de 50 pi de inactivé à la chaleur (HI) dans le sérum humain, on incube à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Après incubation, les cellules de centrifugation à 720 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant. </li><li> Pour cellule pellet, ajouter des anticorps conjugués à un fluorochrome respectifs (par exemple, anti-CD11c ou anti-CD14) et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes à l&#39; abri de la lumière. Dans des tubes séparés, préparer un seul fluorochrome tachée échantillons / ml), car ils sont nécessaires à une indemnisation. </li><li> Après incubation, laver les cellules deux fois dans 1 ml de tampon PBS et centrifuger à chaque fois à 720 xg pendant 5 min. </li><li> Maintien de cellules protégées de la lumière, remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / 100 ul pour analyse par cytométrie en flux. </li><li> Afin de grille sur des cellules viables, ajouter 1 pi de DAPI à chaque tube avant d&#39;acquérir les cellules sur le seul flux d&#39;imagerie cellulaire instrument de cytométrie en suivant les instructions du fabricant. </li></ol> 7. Analyse statistique <ol><li> Entrée toutes les données dans une feuille de calcul. </li><li> Comparer les résultats en utilisant le test t de l&#39;étudiant et / ou un ANOVA selon le cas. </li><li> Envisager des différences statistiquement significatives si p &lt;0,05. </li&gt; </ol>

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<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Tous les auteurs ne divulguent aucun intérêt financier concurrent.

Sur la base des difficultés connues d&#39;isolement et de générer MDDCs de sang humain, la présente étude vise à fournir une comparaison détaillée des deux méthodes bien établies pour la génération de MDDCs. La première méthode comparée est une méthode traditionnelle bien établie pour générer MDDCs en exploitant la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d&#39;adhérence) 21,22,27. La méthode d&#39;adhésion est rapide et rentable, et ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;équipemen...

Les cellules dendritiques (CD) sont des médiateurs essentiels des systèmes immunitaires innées et adaptatives. Ils fonctionnent à induire des réponses immunitaires primaires et faciliter le développement de la mémoire immunologique. Ces cellules sont principalement responsables de capture d&#39; antigène, la migration et la stimulation des cellules T et sont donc appelées cellules comme professionnels présentant l&#39;antigène (CPA) 1 .Manipulation des PED pourraient être utilisés dans un large éventail de domaines de recherche et dans le cadre clinique pour traiter différents des maladies inflammatoires telles que le VIH 6,7, le cancer, les maladies auto - immunes 8, 9 et 10 des réactions allergiques. DC sont également utilisés pour la recherche sur la toxicomanie afin de résoudre des mécanismes et des voies inconnues , tels que ceux associés à la dépendance à l&#39;alcool 11-14, la dépendance aux drogues 13,15, et la combinaison de l&#39; infection et de la substance VIH abus 16-19. Ces études en cours et les futures études de recherche in le domaine de l&#39; immunologie faire dans la production in vitro de DC extrêmement important pour la recherche. Cependant, il existe plusieurs difficultés associées à l&#39; isolement DCs à partir de sang humain comme elles ne constituent que 0,1 à 1% du nombre total de cellules mononucléées du sang 20. À ce jour, quelques - unes des méthodes bien établies pour la production de CD in vitro consiste en plastique ou en verre adhérence des monocytes 21,22, la densité centrifugation gradient 23, séparation spécifique à base de marqueur tel que magnétique tri cellulaire activé 22, fluorescent tri cellulaire activé 24, sélection positive des monocytes CD14 + à l&#39; aide de nanoparticules magnétiques dextran revêtues 25, et l&#39; isolement rapide des monocytes hautement purifiés à l&#39; aide de la sélection de cellule négative entièrement automatisé 26. Cependant, la meilleure méthode de choix reste controversé. Par conséquent, pour améliorer les techniques de génération de courant continu, plusieurs méthodes ont été mises au point, dans lequella pureté de ces cellules peut être fortement augmentée par la différenciation de cellules progénitrices CD34 + et les monocytes purifiés isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) 27. Comme mentionné avant, une méthode largement utilisée et populaire pour générer monocytes des cellules dendritiques dérivées (de MDDCs) est d&#39;explorer la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d&#39;adhérence) 21,22,27. Le procédé d&#39;adhérence est une méthode simple et rapide qui ne nécessite pas l&#39;utilisation d&#39;un équipement complexe. Cependant, certains inconvénients de ce procédé comprennent la contamination des lymphocytes, une faible flexibilité et de manipulation monocyte transitoire 28. Une méthode alternative à la méthode d&#39;adhérence est l&#39;isolation magnétique des monocytes à partir de PBMC totaux, en particulier avec l&#39;utilisation d&#39;un kit d&#39;enrichissement de monocyte humain, qui est destinée à isoler des monocytes à partir des PBMC par sélection négative 26. Au cours de cette procédure, les cellules indésirables sont ciblées pour l&#39;élimination de tétramèreles complexes d&#39;anticorps et des particules magnétiques revêtues de dextrane. L&#39;avantage de cette méthode d&#39;isolement est que les cellules marquées non désirées sont séparés à l&#39;aide d&#39;un aimant tandis que les cellules cibles peut être versé librement au loin dans un nouveau tube sans qu&#39;il soit nécessaire pour les colonnes. A ce jour, la disponibilité d&#39;anticorps monoclonaux spécifiques qui peuvent étiqueter des populations de cellules uniques, la technique de séparation magnétique est devenue non seulement une méthode supplémentaire, mais une nécessité pour l&#39;isolement de cellules rares dans le domaine de l&#39;immunologie. Par exemple, des techniques telles que la cellule magnétique de tri disponibles dans le commerce avec paramagnétiques MACS-nanoparticules ont facilité le développement de nouvelles approches pour la recherche et les applications cliniques 22,29. En outre, des études récentes comparant génération DC à partir de méthodes monocytes d&#39;adhérence et de la technologie MACS ont démontré une pureté et la viabilité plus élevée DC en utilisant MACS monocytes 22,30 séparés. Les cadeaux de l&#39;étude en coursune comparaison entre les deux procédés pour la production de CD humaines à partir de monocytes isolés à partir de PBMC: 1) l&#39;isolement de monocytes par adhérence et 2) l&#39;isolement de monocytes par sélection négative en utilisant un kit commercial d&#39;enrichissement de monocytes humains. Cette étude fournit des preuves pour montrer que la procédure de sélection de séparation magnétique négatif pour isoler les monocytes génère le plus haut rendement de monocytes avec aucune différence significative dans la viabilité des monocytes par rapport aux monocytes isolés par la méthode d&#39;adhérence. À son tour, au bout de sept jours, les monocytes isolés par séparation magnétique différenciées en MDDCs avec une capacité proliférative significativement plus élevée et plus grande quantité de cellules exprimant positive double (CD11c + / CD14 +) phénotype sans affecter CDMD viabilité. Dans l&#39;ensemble, l&#39;étude actuelle diffère des études antérieures mentionnées ci-dessus car elle démontre la capacité des deux techniques pour générer simultanément des monocytes qui sont capables de proliférer et de se différencier en cd11cMDDCs (&gt; 70%) après sept jours de culture sans compromettre leur viabilité. En outre, l&#39;approche actuelle prévoit la première caractérisation temporelle de CD11c différents / populations CD14 MDDCs par flux d&#39;imagerie cytométrie. En résumé, étant donné que les PED jouent un rôle central en ce qui concerne la recherche dans le domaine de l&#39; immunologie, des paramètres différents doivent être pris en considération lors de l&#39; examen comment ils sont dérivés et quelles méthodes sont utilisées pour isoler et les cultiver in vitro. Par conséquent, cette étude vise à fournir des indications sur deux méthodes différentes d&#39;isolement des monocytes et comment ces méthodes affectent différemment monocytes la viabilité et le rendement peut éventuellement affecter la viabilité des cellules dendritiques, la prolifération et le phénotype. Ces résultats contribueront grandement au domaine de l&#39;immunologie et fournira un protocole détaillé de DC isolement, la purification et la caractérisation.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Doit être utilisé chez RT</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ACK</td><td>Qualité Biologique</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RoboSep</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’enrichissement en monocytes humains</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur multimode Synergy 2</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Bioréactif au sel de sodium (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bioréactif au sulfoxyde de diméthyle (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de tétrazolium au bleu de thiazolyle (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Méthosulfate de phénazine (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inactivé (HI) Sérum humain</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Cytomètre en flux</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Cytomètre en flux</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes du système immunitaire qui jouent un rôle crucial dans les réponses lymphocytaires, les mécanismes de défense de l’hôte et la pathogenèse de l’inflammation. L’isolement et l’étude des CD ont été importants dans la recherche biologique en raison de leurs caractéristiques distinctives. Bien qu’ils soient des médiateurs clés essentiels du système immunitaire, les CD sont très rares dans le sang, représentant environ 0,1 à 1 % du total des cellules mononucléées sanguines. Par conséquent, les alternatives aux méthodes d’isolement reposent sur la différenciation des CD à partir de monocytes isolés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Il est impératif d’envisager l’utilisation de techniques d’isolement appropriées qui combinent simplicité, prix abordable, grande pureté et rendement élevé des cellules. Dans la présente étude, deux méthodes distinctes de génération de CD seront comparées. Les monocytes ont été sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement à l’aide d’une procédure de séparation magnétique suivie d’une différenciation en DC avec IL-4 et GM-CSF. La viabilité, la prolifération et le phénotype des monocytes et des MDDC ont été évalués à l’aide de colorants de viabilité, d’un test MTT et d’une analyse des marqueurs de surface CD11c/CD14 par cytométrie en flux d’imagerie. Bien que la méthode de séparation magnétique ait donné un pourcentage significativement plus élevé de monocytes ayant une capacité de prolifération plus élevée par rapport à la méthode d’adhésion, les résultats ont démontré la capacité des deux techniques à générer simultanément des monocytes capables de proliférer et de se différencier en CD11c+ MDDC viables après sept jours de culture. Les deux méthodes ont donné > 70 % de CD11c+ MDDC. Par conséquent, nos résultats fournissent des informations qui contribuent au développement de méthodes fiables pour l’isolement et la caractérisation des CD humains.

<html> Monocyte Rendement par séparation magnétique est plus élevé par rapport à monocytes Rendement par adhésion Méthode Les données présentées sur la Figure 1 affichage CMSP et le nombre de cellules de monocytes par la méthode d&#39;exclusion au bleu Trypan à jour de l&#39; isolement des CMSP et la séparation des monocytes. En moyenne, les monocytes isolés par le procédé d&#3...

Cette étude compare deux méthodes différentes d’isolement de monocytes humains pour obtenir des cellules dendritiques (DC) in vitro. Les monocytes sont sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement par séparation magnétique. Le rendement et la viabilité des monocytes ainsi que la viabilité, la prolifération et l’expression des marqueurs de surface CD11c/CD14 seront comparés entre les deux méthodes.

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

L'objectif général de cette étude est de comparer deux méthodes différentes d'isolement de monocytes humains pour la génération in vitro de cellules dendritiques et de caractériser l'expression à la surface des cellules CT11c et CT14 des populations dérivées des monocytes par cytométrie en flux d'imagerie. Ces protocoles d'isolement des monocytes peuvent contribuer au développement de méthodes fiables pour la purification de cellules dendritiques humaines à des fins de recherche et d'applications cliniques. Le principal avantage de ces protocoles est qu'ils facilitent l'isolement de monocytes humains et leur différenciation en cellules viables et fonctionnelles dérivées des monocytes.En outre, cette étude est la première à caractériser la population spécifique des cellules dendritiques dérivées des monocytes par cytométrie en flux d'imagerie unicellulaire. Cette méthode peut également être utilisée comme alternative pour l'isolement d'autres cellules rares avec un rendement adéquat pour des applications de recherche ultérieures. La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle, car il peut être difficile de manipuler les échantillons sanguins de manière sécuritaire sans instruction appropriée ni expérience.Commencez par diluer l'échantillon de sang à un ratio de un pour un avec du PBS dans un flacon T75. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de solution de gradient de densité dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et superposez soigneusement 25 à 30 millilitres du sang dilué au-dessus du gradient. Pour obtenir une séparation adéquate des cellules mononucléées du sang périphérique, chargez le sang sur la solution de gradient de densité rapidement, mais avec précaution et sans mélanger les couches.Séparer les cellules par centrifugation, puis transférer la couche d'interface des globules blancs dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Laver les cellules deux fois dans du PBS, en re-suspendant le culot final dans 10 millilitres de tampon de lyse au chlorure d'ammonium et au potassium pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires dans du PBS.Pour isoler les monocytes par la méthode d'adhérence, cultiver cinq fois 10 à la puissance 7 cellules du culot de PBMC obtenu par 10 millilitres de milieu complet dans un nouveau flacon T75 pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. À la fin de l'incubation, éliminer les cellules non adhérentes en suspension et laver doucement les cellules adhérentes deux fois avec du PBS. Ensuite, nourrir les cellules adhérentes avec du milieu de culture cellulaire complet supplémenté en GM-CSF humain et en IL-4 et replacer la culture dans l'incubateur pendant cinq à sept jours.Pour isoler les monocytes par séparation magnétique, après avoir collecté les PBMC par centrifugation en gradient de densité, transférez la couche de globules blancs dans un tube en polystyrène de cinq millilitres et resuspendez les cellules dans du PBS à une concentration de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d'un cocktail d'enrichissement des monocytes humains par millilitre aux cellules en mélangeant, puis incubez les cellules avec le cocktail à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis ajoutez 50 microlitres de particules magnétiques par millilitre de cellules en mélangeant soigneusement, et incubez les cellules à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.À la fin de la deuxième incubation, ajouter du PBS aux cellules pour porter le volume total à deux virgule cinq millilitres et mélanger en pipetant deux à trois fois. Puis placer le tube en polystyrène dans un dispositif magnétique adapté à température ambiante. Après deux minutes et demie, avec le tube toujours dans l'aimant, décanté la fraction purifiée de monocytes dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.Ensuite, cultivez les monocytes purifiés dans un milieu de culture cellulaire complet supplémenté en GM-CSF et en IL-4 pendant cinq à sept jours, comme vient de l'être démontré. Après sept jours de différenciation, répartissez des aliquots de 1 × 10⁶ cellules de cellules dendritiques dérivées des monocytes dans le nombre approprié de tubes de 1,5 mL, puis ajoutez 50 µL de sérum humain inactivé par la chaleur à chaque échantillon afin de bloquer toute liaison non spécifique. Après 10 minutes, centrifugez les cellules et resuspendez les culots dans les anticorps primaires marqués avec un fluorochrome approprié pendant 20 minutes à 4 °C, à l’abri de la lumière.Ensuite, laver les cellules deux fois dans un millilitre de PBS, en resuspendant les culots dans 100 microlitres de PBS par un fois dix puissance six cellules. Juste avant l'analyse, ajouter un microlitre de DAPI à chaque tube. Puis, analyser les échantillons sur un cytomètre de flux à imagerie unicellulaire selon les instructions du fabricant.En moyenne, les monocytes isolés par la méthode d'adhérence représentent environ six virgule deux pour cent de la population totale de monocytes du sang périphérique, ou PBMC, tandis que les monocytes isolés par séparation magnétique représentent jusqu'à 25 pour cent du total des PBMC. Les monocytes isolés par l'une ou l'autre méthode présentent une viabilité équivalente. Les MDDC différenciées à partir de monocytes purifiés par les deux méthodes ont d'abord été sélectionnées en fonction des cellules négatives pour le DAPI, c'est-à-dire viables, parmi l'ensemble des cellules simples, puis chaque population cellulaire a fait l'objet d'un tri successif.Les deux méthodes d'isolement ont donné une faible population unique positive pour CD14, et les deux méthodes ont produit une forte population totale positive pour CD11c. Une analyse phénotypique supplémentaire a été réalisée sur toutes les cellules positives pour CD11c, et bien que l'isolement magnétique fournisse un pourcentage plus élevé de cellules doublement positives CD11c et CD14, cet effet n'était pas significatif par rapport à la méthode d'adhérence. Ces cellules doublement positives CD11c et CD14 pourraient correspondre à des MDDC à un stade précoce de différenciation qui n'ont pas encore perdu le marqueur monocytique CD14.Lors de l'analyse des cellules uniques positives pour CD11c, la méthode d'adhérence donne le rendement le plus élevé de cellules positives pour CD11c et négatives pour CD14. Ces cellules uniques positives pourraient correspondre à des MDDC différenciés au stade tardif. Une fois maîtrisées, les techniques d'isolement par adhérence et par aimantation peuvent être réalisées respectivement en trois à quatre heures et en une à deux heures, si elles sont effectuées correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter des cytokines fraîches pour la différenciation des cellules dendritiques toutes les 48 heures lors du renouvellement du milieu. Le travail avec des liquides biologiques dangereux, tels que le sang, peut être extrêmement nocif, et l'utilisation d'équipements de protection individuelle appropriés ainsi que de méthodes d'élimination adéquates doivent toujours être appliquées lors de l'exécution de ces procédures. Cette étude ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer l'utilisation des monocytes humains et des cellules dendritiques dans le traitement thérapeutique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'optimiser l'isolement des monocytes humains afin de générer différentes populations de cellules dérivées des monocytes in vitro.

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