Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement

L’objectif général de cette étude est de comparer deux méthodes différentes d’isolement de monocytes humains pour la génération de cellules dendritiques in vitro et de caractériser l’expression à la surface cellulaire CT11c, CT14 des populations dérivées de monocytes résultantes par cytométrie en flux d’imagerie. Ces protocoles d’isolement des monocytes peuvent contribuer au développement de méthodes fiables pour la purification des cellules dendritiques humaines pour la recherche et les applications cliniques. Le principal avantage de ces protocoles est qu’ils facilitent l’isolement des monocytes humains et leur différenciation en cellules dérivées de monocytes viables et fonctionnelles.

De plus, il s’agit de la première étude à caractériser la population spécifique de cellules dendritiques dérivées de monocytes par cytométrie en flux d’imagerie unicellulaire. Cette méthode peut également être appliquée comme alternative pour l’isolement d’autres cellules rares à un rendement adéquat pour les applications de recherche en aval. La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle, car il peut être difficile de manipuler les échantillons de sang en toute sécurité sans les instructions et l’expérience appropriées.

Commencez par diluer l’échantillon de sang dans un rapport de un pour un avec du PBS dans une fiole T75. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de solution à gradient de densité dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et superposez soigneusement 25 à 30 millilitres de sang dilué sur le gradient. Pour obtenir une séparation correcte des cellules mononucléées du sang périphérique, chargez le sang sur la solution de gradient de densité rapidement, mais soigneusement et sans mélanger les couches.

Séparez les cellules par centrifugation, suivie du transfert de la couche d’interface des globules blancs dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Lavez les cellules deux fois dans du PBS, en remettant en suspension la pastille finale dans 10 millilitres de tampon de lyse de potassium de chlorure d’ammonium pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules deux fois de plus dans du PBS.

Pour isoler les monocytes par la méthode d’adhérence, cultivez cinq fois 10 sur les sept cellules de la pastille PBMC résultante par 10 millilitres de milieu complet dans une fiole T75 neuve pendant deux heures à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. À la fin de l’incubation, jetez les cellules flottantes non adhérentes et lavez doucement les cellules adhérentes deux fois avec du PBS. Ensuite, nourrissez les cellules adhérentes avec un milieu de culture cellulaire complet complété par du GMCSF humain et de l’IL4 et retournez la culture dans l’incubateur pendant cinq à sept jours.

Pour isoler les monocytes par séparation magnétique, après avoir collecté le PBMC par séparation par gradient de densité, transférez la couche de globules blancs dans un tube de polystyrène de cinq millilitres et remettez les cellules en suspension dans le PBS à une concentration de cinq fois 10 à sept cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’un cocktail d’enrichissement en monocytes humains par millilitre aux cellules en mélangeant et incubez les cellules avec le cocktail à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 50 microlitres de particules magnétiques par millilitre de cellules en mélangeant soigneusement et incubez les cellules à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.

À la fin de la deuxième incubation, ajoutez du PBS dans les cellules pour porter le volume total à deux virgule cinq millilitres et mélangez en pipetant deux à trois fois. Placez ensuite le tube de polystyrène dans un dispositif magnétique approprié à température ambiante. Après deux minutes et demie, avec le tube toujours dans l’aimant, décantez la fraction de monocytes purifiée dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, cultivez les monocytes purifiés et le milieu de culture cellulaire complet complété par du GMCSF et de l’IL4 pendant cinq à sept jours, comme nous venons de le démontrer. Après sept jours de différenciation, distribuer une fois 10 aux six aliquats cellulaires des cellules dendritiques dérivées des monocytes dans le nombre approprié de tubes d’un virgule cinq millilitres, et ajouter 50 microlitres de sérum humain inactivé par la chaleur à chaque échantillon pour bloquer toute découverte non spécifique. Après 10 minutes, centrifugez les cellules et remettez les pastilles en suspension dans les anticorps primaires conjugués à la fluorescence appropriés pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules deux fois dans un millilitre de PBS, en remettant les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS par une fois dix aux six cellules. Juste avant l’analyse, ajoutez un microlitre de DAPI dans chaque tube. Ensuite, lisez les échantillons sur un cytomètre en flux d’imagerie à cellule unique selon les instructions du fabricant.

En moyenne, les monocytes isolés par la méthode d’adhérence représentent environ six virgule deux pour cent de la population totale de cellules monocytaires du sang périphérique, ou PBMC, tandis que les monocytes isolés par séparation magnétique représentent jusqu’à 25 pour cent de la population totale de PBMC. Les monocytes isolés par l’une ou l’autre méthode sont tout aussi viables. Les MDDC différenciés des monocytes purifiés par les deux méthodes ont d’abord été contrôlés sur la base de cellules DAPI négatives ou viables à partir de cellules uniques totales, puis suivis d’un contrôle de chaque population cellulaire.

Les deux méthodes d’isolement ont donné un faible nombre de CD14 positifs pour un seul CD14 et une population totale élevée de CD11c positifs. Une analyse phénotypique plus poussée a été effectuée sur toutes les cellules CD11c positives et même si l’isolement magnétique donne un pourcentage plus élevé de cellules CD14 positives CD11c positives doublement positives, cet effet n’était pas significatif par rapport à la méthode d’observance. Ces cellules CD11c positives et CD14 positives peuvent être des MDDC différenciées à un stade précoce qui n’ont pas encore abandonné le marqueur monocytaire CD14.

Lors de l’analyse des cellules CD11c positives uniques, la méthode d’adhérence donne le rendement le plus élevé de cellules CD11c positives et CD14 négatives. Ces cellules positives uniques peuvent être des MDDC différenciés à un stade avancé. Une fois maîtrisées, les techniques d’adhérence et d’isolement magnétique peuvent être réalisées en trois à quatre et une à deux heures respectivement si elles sont correctement exécutées.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir des cytokines de différenciation des cellules dendritiques fraîches toutes les 48 heures lorsque le milieu est réapprovisionné. Travailler avec des fluides à risque biologique tels que le sang peut être extrêmement nocif, et l’utilisation d’un équipement de protection individuelle et de méthodes d’élimination appropriés doit toujours être prise lors de l’exécution de ces procédures. Cette étude ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer l’utilisation des monocytes humains et des cellules dendritiques pour le traitement thérapeutique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’optimiser l’isolement des monocytes humains pour générer différentes populations de cellules dérivées de monocytes in vitro.