Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement

L'objectif général de cette étude est de comparer deux méthodes différentes d'isolement de monocytes humains pour la génération in vitro de cellules dendritiques et de caractériser l'expression à la surface des cellules CT11c et CT14 des populations dérivées des monocytes par cytométrie en flux d'imagerie. Ces protocoles d'isolement des monocytes peuvent contribuer au développement de méthodes fiables pour la purification de cellules dendritiques humaines à des fins de recherche et d'applications cliniques. Le principal avantage de ces protocoles est qu'ils facilitent l'isolement de monocytes humains et leur différenciation en cellules viables et fonctionnelles dérivées des monocytes.

En outre, cette étude est la première à caractériser la population spécifique des cellules dendritiques dérivées des monocytes par cytométrie en flux d'imagerie unicellulaire. Cette méthode peut également être utilisée comme alternative pour l'isolement d'autres cellules rares avec un rendement adéquat pour des applications de recherche ultérieures. La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle, car il peut être difficile de manipuler les échantillons sanguins de manière sécuritaire sans instruction appropriée ni expérience.

Commencez par diluer l'échantillon de sang à un ratio de un pour un avec du PBS dans un flacon T75. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de solution de gradient de densité dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et superposez soigneusement 25 à 30 millilitres du sang dilué au-dessus du gradient. Pour obtenir une séparation adéquate des cellules mononucléées du sang périphérique, chargez le sang sur la solution de gradient de densité rapidement, mais avec précaution et sans mélanger les couches.

Séparer les cellules par centrifugation, puis transférer la couche d'interface des globules blancs dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Laver les cellules deux fois dans du PBS, en re-suspendant le culot final dans 10 millilitres de tampon de lyse au chlorure d'ammonium et au potassium pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires dans du PBS.

Pour isoler les monocytes par la méthode d'adhérence, cultiver cinq fois 10 à la puissance 7 cellules du culot de PBMC obtenu par 10 millilitres de milieu complet dans un nouveau flacon T75 pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. À la fin de l'incubation, éliminer les cellules non adhérentes en suspension et laver doucement les cellules adhérentes deux fois avec du PBS. Ensuite, nourrir les cellules adhérentes avec du milieu de culture cellulaire complet supplémenté en GM-CSF humain et en IL-4 et replacer la culture dans l'incubateur pendant cinq à sept jours.

Pour isoler les monocytes par séparation magnétique, après avoir collecté les PBMC par centrifugation en gradient de densité, transférez la couche de globules blancs dans un tube en polystyrène de cinq millilitres et resuspendez les cellules dans du PBS à une concentration de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d'un cocktail d'enrichissement des monocytes humains par millilitre aux cellules en mélangeant, puis incubez les cellules avec le cocktail à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Puis ajoutez 50 microlitres de particules magnétiques par millilitre de cellules en mélangeant soigneusement, et incubez les cellules à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes.

À la fin de la deuxième incubation, ajouter du PBS aux cellules pour porter le volume total à deux virgule cinq millilitres et mélanger en pipetant deux à trois fois. Puis placer le tube en polystyrène dans un dispositif magnétique adapté à température ambiante. Après deux minutes et demie, avec le tube toujours dans l'aimant, décanté la fraction purifiée de monocytes dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, cultivez les monocytes purifiés dans un milieu de culture cellulaire complet supplémenté en GM-CSF et en IL-4 pendant cinq à sept jours, comme vient de l'être démontré. Après sept jours de différenciation, répartissez des aliquots de 1 × 10⁶ cellules de cellules dendritiques dérivées des monocytes dans le nombre approprié de tubes de 1,5 mL, puis ajoutez 50 µL de sérum humain inactivé par la chaleur à chaque échantillon afin de bloquer toute liaison non spécifique. Après 10 minutes, centrifugez les cellules et resuspendez les culots dans les anticorps primaires marqués avec un fluorochrome approprié pendant 20 minutes à 4 °C, à l’abri de la lumière.

Ensuite, laver les cellules deux fois dans un millilitre de PBS, en resuspendant les culots dans 100 microlitres de PBS par un fois dix puissance six cellules. Juste avant l'analyse, ajouter un microlitre de DAPI à chaque tube. Puis, analyser les échantillons sur un cytomètre de flux à imagerie unicellulaire selon les instructions du fabricant.

En moyenne, les monocytes isolés par la méthode d'adhérence représentent environ six virgule deux pour cent de la population totale de monocytes du sang périphérique, ou PBMC, tandis que les monocytes isolés par séparation magnétique représentent jusqu'à 25 pour cent du total des PBMC. Les monocytes isolés par l'une ou l'autre méthode présentent une viabilité équivalente. Les MDDC différenciées à partir de monocytes purifiés par les deux méthodes ont d'abord été sélectionnées en fonction des cellules négatives pour le DAPI, c'est-à-dire viables, parmi l'ensemble des cellules simples, puis chaque population cellulaire a fait l'objet d'un tri successif.

Les deux méthodes d'isolement ont donné une faible population unique positive pour CD14, et les deux méthodes ont produit une forte population totale positive pour CD11c. Une analyse phénotypique supplémentaire a été réalisée sur toutes les cellules positives pour CD11c, et bien que l'isolement magnétique fournisse un pourcentage plus élevé de cellules doublement positives CD11c et CD14, cet effet n'était pas significatif par rapport à la méthode d'adhérence. Ces cellules doublement positives CD11c et CD14 pourraient correspondre à des MDDC à un stade précoce de différenciation qui n'ont pas encore perdu le marqueur monocytique CD14.

Lors de l'analyse des cellules uniques positives pour CD11c, la méthode d'adhérence donne le rendement le plus élevé de cellules positives pour CD11c et négatives pour CD14. Ces cellules uniques positives pourraient correspondre à des MDDC différenciés au stade tardif. Une fois maîtrisées, les techniques d'isolement par adhérence et par aimantation peuvent être réalisées respectivement en trois à quatre heures et en une à deux heures, si elles sont effectuées correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter des cytokines fraîches pour la différenciation des cellules dendritiques toutes les 48 heures lors du renouvellement du milieu. Le travail avec des liquides biologiques dangereux, tels que le sang, peut être extrêmement nocif, et l'utilisation d'équipements de protection individuelle appropriés ainsi que de méthodes d'élimination adéquates doivent toujours être appliquées lors de l'exécution de ces procédures. Cette étude ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer l'utilisation des monocytes humains et des cellules dendritiques dans le traitement thérapeutique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'optimiser l'isolement des monocytes humains afin de générer différentes populations de cellules dérivées des monocytes in vitro.