Name: Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez la visualisation de l'activité électrique cellulaire chez les embryons de poisson-zèbre et dans les tumeurs. Cette méthode permet le suivi en temps réel des signaux électriques in vivo pour la biologie du développement et la recherche sur le cancer.

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Les travaux de recherche rapporté dans cette publication a été pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le prix nombre R35GM124913, programme d’incitation pour PI4D de l’Université de Purdue et PVM interne concurrentiel Programme de fonds de la recherche fondamentale. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des agents de financement. Nous remercions la construction Tol2, Michael Lin pour la construction de ASAP1, Koichi Kawakami et Leonard Zon pour le promoteur ubi construire par l’intermédiaire de Addgene.

Le poisson-zèbre sont logés dans une animalerie approuvé par AAALAC, et toutes les expériences ont été réalisées selon les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi (PACUC) et de Purdue animalier.
1. Tol2 Transposon plasmide Construct préparation
Remarque : Tol2, un transposon qui a été découvert en poisson medaka, a été employé couramment dans le poisson-zèbre recherche communautaire8,9. Il a été avec succès adoptée pour le système de passage spécifique axée sur la recombinaison clonage et connu comme le kit de Tol210. Le kit Tol2 permet un moyen plus pratique de créer des constructions d’expression personnalisée, tout en augmentant l’efficacité de la transgenèse. Ainsi, il a été une décision facile à prendre avantage de ce système et créer une ligne de poisson-zèbre expression ASAP1 omniprésente en utilisant un promoteur validés ubiquitin à conduire ASAP111.
<ol><li>Création d’une construction centrale entrée ASAP1 : pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Acquérir la construction du capteur ASAP1 tension génétiquement encodé, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), de Addgene. Pour amplifier la région codante de ASAP1, mis en place un PCR avec des amorces personnalisés (attB1-ASAP1F et attB2-ASAP1R) flanqués de séquences attB à l’extrémité 5' des amorces (Figure 1). Phusion ADN polymérase a été choisi pour sa grande efficacité, et conditions de la PCR ont été optimisées basé sur le protocole publiées antérieurement12.</li>
		<li>Charger les produits PCR 50 µL dans un 1 % TAE gel à l’aide d’une pipette ordinaire avec 200 conseils µL et effectuer l’électrophorèse à 160 V dans un réservoir horizontal de gel pendant environ 30 min.</li>
		<li>Vérifier le gel sous un Transilluminateur UV (353 nm), l’accise sur la bande désirée à l’aide de lame/scalpel sous un Transilluminateur UV comme précédemment publiés13,14et mettre l’échantillon de gel contenant de l’ADN dans une microcentrifugeuse propre 1,5 mL tube.</li>
		<li>Accomplissent gel de purification pour les produits de PCR ASAP1. Récupérer l’ADN contenu dans le gel excisé en utilisant un kit de purification de gel ADN commercial suivant les instructions du fabricant et éluer l’ADN dans 20 µL d’eau. Prendre 1 µL comme un échantillon et mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Coulent les instructions du logiciel utilisant l’eau comme un contrôle à blanc15.</li>
		<li>Prenez 100 ng de purifié produit de PCR et mélangez-le avec 150 ng de plasmide pDONR221 dans 10 µL de TE mettre en mémoire tampon (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Ajouter 2 µL de II Clonase BP dans la réaction et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.</li>
		<li>Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.</li>
		<li>Effectuer la transformation. La réaction de transfert et le mélanger avec 50 µL de Top10 compétentes d' e. coli cellules et incuber les cellules sur la glace pendant 30 min. Puis, transfert immédiatement, le tube de réaction dans un bain-marie à 42 ° C pendant 1 min. Retirez le tube et incuber sur glace pendant 2 min. Ensuite, mettre le tube dans un shaker de 37 ° C et il incuber pendant 1 heure.</li>
		<li>Retirez le tube et plaque les cellules sur une plaque de kanamycine LB. Ensuite, incuber la plaque du jour au lendemain (16-18 h) à 37 ° C.</li>
		<li>Prélever des colonies simples et bien séparées et les ensemencer des tubes de culture de cellules de 14 mL avec 3 mL de milieu LB. Leur culture pendant une nuit à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min (rotation par minute).</li>
		<li>Effectuer miniprep utilisant un kit commercial miniprep après son instruction manuel17.</li>
		<li>Séquence 3-4 plasmides avec Sanger séquençage d’identifier positive pDONR221-ASAP1 clones en utilisant des amorces de séquençage de M13F et M13R.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Créer la construction Tol2 de microinjection : pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Choisissez que le séquençage vérifiée mesure et pDONR221-ASAP1 clone sa concentration d’ADN utilisant un spectrophotomètre qui suit l’instruction de logiciels utilisant l’eau comme un blanc de contrôle15.</li>
		<li>Prendre 100 µg de pDONR221-ASAP1 et mélangez-le avec 100 µg de plasmide de Tol2 kit 5-fin (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) et 150 µg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajuster le volume total à 8 µL tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) dans un microtubes de 1,5 mL tube et bien mélanger en un tourbillon brève de 2-5 s. Ensuite, ajouter 2 µL de LR Clonase II plus et incuber la réaction à la température ambiante pendant la nuit.</li>
		<li>Le deuxième jour, ajouter 1 µL de protéinase K dans la réaction à l’aide d’une pipette µL 10 et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.</li>
		<li>Exécuter la transformation et identifier les clones positifs tel que décrit ci-dessus (pas 1.1.7-11).</li>
		<li>Mesure la concentration d’ADN de séquençage vérifié pDestTol2-ubi-ASAP1 clone (Figure 1 b) à l’aide d’un spectrophotomètre à15. La concentration est généralement autour de 200ng/µL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparer Tol2 Transposase ARNm et Solution injectable
<ol><li>Strie e. coli glycérol stock du plasmide pCS2FA-transposase (Tol2 kit #396) sur un plat de livre (avec 100 ampicilline µg/mL) en utilisant une boucle de l’inoculation stérilisé. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur pendant la nuit. Le lendemain, prélever une colonie unique et ensemencer il dans 3 mL de LB (ampicilline 100 µg/mL) à l’aide d’une pointe de pipette 10 µL stérilisé. Culture du jour au lendemain à 37 ° C dans un shaker avec une vitesse de rotation de 250 tr/min.</li>
	<li>Effectuer miniprep sur la culture d’e. coli en utilisant un kit commercial miniprep suivant le mode d’emploi. Éluer l’ADN de plasmide dans 30 à 50 µL de tampon TE en 1 minute centrifuger à 14 000 tr/min et mesurer la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre.</li>
	<li>Linéariser 1 à 2 µg de plasmide avec pas j’ai endonucléase et purifier l’ADN avec un ADN kit pas j’ai après son mode d’emploi de nettoyage digestion. Éluer l’ADN dans 5 µL d’eau par centrifugation à 14 000 tr/min pendant 1 minute. La concentration prévue est d’environ 200-300 ng/µL.</li>
	<li>Effectuer en vitro transcription avec Not je linéarisé pCS2FA-transposase comme une matrice d’ADN à l’aide d’une trousse commerciale de transcription SP6.</li>
	<li>Une fois la réaction terminée, purifier Tol2 transposase ADN messagère utilisant un nettoyage commercial de RNA kit suivant les instructions du fabricant. Enfin, éluer les ARNm dans l’eau sans ARNase 20 µL et mesurer la concentration d’ARN dans un spectrophotomètre. La concentration prévue est d’environ 1 à 3 µg / µL. les échantillons peuvent être stockés dans un congélateur à-80 ° C si nécessaire.</li>
	<li>Préparer la solution de microinjection en mélangeant 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 et Tol2 transposase ARNm (100 ng/µL) dans un tube de microcentrifuge de pipetage. Pour prévenir la dégradation de l’acide nucléique provoquée par le dégel répétés et de regel, aliquote de 6 µL par tube et le stocker dans un congélateur à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
</ol>3. microinjection
<ol><li>Mettre en place les 4-6 réservoirs d’élevage au moins 2 mâles et 2 femelles l’après-midi avant l’injection. Ces poissons ne doivent pas être nourris dans l’après-midi. Cette étape va réduire la quantité de déchets de poisson et gagnez du temps à les nettoyer le lendemain matin, tout en aidant à induire une réponse de la reproduction.</li>
	<li>Le lendemain matin, enlever la solution injection préparés (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construct et Tol2 mRNA) du congélateur à-80 ° C et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Tirez les séparateurs dans les réservoirs de pisciculture et laisser le poisson s’accoupler. En général, poissons pondent dans 20 à 30 minutes après avoir tiré sur le diviseur. Si non, attendre 1 à 2 heures de plus. Certains poissons ne peuvent pas du tout pondent des œufs. Dans ce cas, répéter cette expérience de collecte d’embryons de poissons.</li>
	<li>En attendant, assurez-vous qu’il y a des aiguilles préparés avec le bout cassé à un angle créant un bord biseauté avec une pince ou en cassant sur un essuie-glace de tâche délicate.<ol>
<li>Tirer des aiguilles de verre capillaire sur un micropipettes utilisant les paramètres suivants : chauffer 545 ; tirer 60 ; Vitesse 80 ; temps 250 ; pression 500. Casser l’aiguille avec une pince sous une étendue de dissection (avec oculaire règle pour l’estimation de diamètre) en tenant la pince sous l’angle environ 45 °. Diamètre désiré de l’aiguille peut être variable selon les paramètres de microinjector, mais plus petit diamètre est préférable pour diminuer la mortalité des embryons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois que les poissons ont pondu, les recueillir dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri et apportez-les à l’étendue de la dissection. Supprimer tous les embryons anormaux et des déchets de poissons.</li>
	<li>Pipette les embryons fécondés dans le prêt d’agarose à 3 % d’injection moule. Enlever l’excès d’eau pour aider à garder les embryons en place.</li>
	<li>Une fois que toutes les lignes sont remplis d’embryons viables, organisez-les afin que les cellules individuelles toutes face à la même direction vers l’aiguille, qui est un angle de 45° horizontalement. Cela facilitera injection beaucoup plus tard.</li>
	<li>Avec des gants, utiliser une pipette de 20 chargement µL Astuce et retirer 5 µL de la construction prête du tube sur la glace.</li>
	<li>Insérez soigneusement la pointe à l’extrémité arrière du tube capillaire rompu complètement vers où il commence à tapper, pour obtenir le réactif que près de la pointe. S’il y a toujours des bulles d’air, secouez l’aiguille, en veillant à ne pas casser la pointe.</li>
	<li>Insérez l’aiguille vers le porte-aiguille de microinjection et serrer avec précaution jusqu'à ce que l’aiguille reste en place. Ajuster l’angle à 45° environ.</li>
	<li>Une fois que l’aiguille est préparé et attaché, allumez le réservoir sous pression de microscope et de gaz. Commercial CO2 réservoirs sont généralement bonnes à cet effet. Le volume d’injection est réglé par la pression d’exploitation et d’éjection : environ 0,5 lb/po2 pour tenue et 30 lb/po2 pour l’éjection. N’oubliez pas de vérifier que la solution sort lorsque vous appuyez sur la pédale.</li>
	<li>À l’aide d’un micromètre avec une goutte d’huile minérale, régler le volume et l’écoulement de la solution à ~ 150 µm de diamètre (environ 2 nL). Veiller à ce que la contre-pression permettra une petite quantité de s’écouler hors de l’aiguille. S’il n’y a pas assez de contre-pression, capillarité provoquera liquide entrer dans l’aiguille et détruire l’ARNm.</li>
	<li>Une fois que l’aiguille est calibré, commencent à injecter la construction dans la cellule unique des embryons fécondés. Remarque : Cela prend une grande quantité de pratique, de patience et finesse, en raison de la membrane cellulaire étant difficiles à percer. Il est important d’injecter la solution dans la cellule, pas le jaune, pour générer des poissons zèbres transgéniques. Ceci est différent de l’injection morpholino. Il n’importe pas quel côté l’aiguille pénètre dans la cellule en tant que la construction se passe dans la cellule. La transgénèse aura un très faible taux de réussite s’il est injecté dans le jaune au lieu de la cellule. Injection de stade unicellulaire est aussi importante, ou poisson chimère somatique sera créé. Cela réduira les chances du transgène va dans les cellules germinales.</li>
	<li>Le bord de l’entaille de gel permet de fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille de pression sans bouger l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la même cellule, appuyer sur la pédale pour libérer la quantité désirée de solution. Répétez ce processus pour tous les embryons.</li>
	<li>Une fois terminé, transférer les embryons injectés dans une boite marquée en les rinçant hors de l’encoche d’agarose avec l’eau du système de poissons et une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Stocker les embryons dans un incubateur à 28,5 ° C pour les laisser se développer. Vérifiez retour toute la journée retirer les embryons de poissons morts et remplacez l’eau par 0,1 % de bleu de méthylène dans l’eau du poisson.</li>
	<li>Environ 6-8 heures après l’injection, prenez 10 personne injecté des embryons de poisson et préparer l’ADN génomique d’eux à l’aide de la méthode de Hotshot18.</li>
	<li>Le lendemain matin, utiliser un microscope à dissection avec une source de lumière de fluorescence à trier les embryons montrant GFP dans les tissus non-jaune d’oeuf. Ces embryons de poisson doivent contenir la construction injectée.</li>
	<li>Effectuer le test d’accise Tol2 pour vérifier l’activité de transposon comme décrit plus haut19. Si le plasmide excisée peut être détecté, garder l’injection des embryons de poissons et de les élever. Si aucun plasmide excisée ne peut être détecté, répétez le processus de synthèse et de microinjection Tol2 ARNm jusqu'à obtenir les résultats positifs du test de l’accise Tol2.</li>
</ol>4. établir des poissons transgéniques ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
<ol><li>Soulever le poisson injecté (génération de0 F) à l’âge adulte comme décrit précédemment dans le livre de poisson-zèbre20. Cela prend habituellement environ 4 mois.</li>
	<li>Prenez un seul adulte F0 poissons et traversez-la en un seul en face de poisson de type sauvage de sexe. Recueillir des embryons de poisson après reproduction plus tard dans la journée. Garder les embryons de poissons recueillis dans l’incubateur de 28,5 ° C chez les poissons de l’eau avec 0,1 % de bleu de méthylène.</li>
	<li>Le troisième jour, vérifier les embryons de poissons sous un microscope à dissection fluorescent avec un filtre GFP. Trier les embryons de poisson vert, s’il y en a et de les élever jusqu'à l’âge adulte comme F1 génération les poissons transgéniques, Tg (ubi: ASAP1). NOTE : Mendélienne ratio ne devrait pas puisque la plupart des poissons0 F parentales sont des chimères génétiques germinales.</li>
	<li>Traverser les poissons adultes isolés F1 avec les poissons de type sauvage et collecter des embryons de poisson. Trier les embryons de poisson vert et les élever jusqu'à l’âge adulte comme poisson de génération2 F. Remarque : Vert et des embryons de poisson non écologiques devraient être proche de 1:1 s’il y a un transgène unique.</li>
	<li>Pour afficher les changements de potentiel électrique dans la tumeur comme des tumeurs malignes de nerf périphérique gaine (MPNST), traverser la génération de2 F Tg (ubi: ASAP1) poisson poisson rpl35hi258/wt . On sait que les tumeurs visibles commencent à être trouvé dans les 6-8 mois vieux adultes21,22.</li>
</ol>5. imagerie
<ol><li>Image des embryons de poisson-zèbre, prendre plusieurs fondateur de génération2 F poisson et croiser avec des poissons de type sauvage en paires individuelles. Recueillir des embryons de poissons à différents stades de développement désirés selon le poisson-zèbre, mise en scène de guide23.</li>
	<li>Pour les premiers stades des embryons de poisson, peler et retirer les chorions des embryons soigneusement à l’aide d’une paire de pinces sous une étendue de dissection dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri avec de l’eau système de poissons.</li>
	<li>Transférer quelques embryons de poisson sur une lame de verre concave avec 3 % de méthylcellulose à l’aide d’une pipette de transfert jetable 3,4 mL. Ajuster les embryons pour les positions souhaitées pour afficher l’activité cellulaire de la GFP en utilisant une aiguille sous une étendue de dissection fluorescent.</li>
	<li>Pour les stades mobiles des embryons de poisson (plus de 12 somite étape), utilisez mésylate de tricaïne 0.05 % pour anesthésier les embryons de poissons avant de les transférer aux diapositives. Brièvement, les embryons de poisson ont été a émergé dans mésylate de tricaïne 0.05 % dans l’eau du poisson jusqu'à ce qu’ils ont arrêté la natation et la balance du corps perte. En outre, ajouter une goutte de mésylate de tricaïne 0.05 % avec la méthylcellulose sur la diapositive.</li>
	<li>Pour les moins de 12 embryons poissons au stade somite, utiliser un microscope composé d’épifluorescente avec un appareil photo compatible et un logiciel d’imagerie. Pour plus de 12 embryons de poissons étape somite, utiliser un microscope à fluorescence dissection.</li>
	<li>À l’image de tension de la cellule tumorale, d’abord identifier les poissons atteints de tumeurs MPNST. Puis, anesthésier les poissons avec mésylate de tricaïne 0,05 %. Pour l’imagerie support entier, mettre le poisson dans un diamètre de 10 cm boîte de Pétri. Pour visualiser l’activité électrique de cellules de tumeur, tumeurs de poissons peuvent être disséqués dehors après l’imagerie support entier.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que les activités électriques niveau cellulaire et tissulaire au cours du développement embryonnaire et la maladie humaine ont été découverts il y a longtemps, en vivo électrique changements dynamiques et leurs rôles biologiques restent encore largement inconnus. Un des défis majeurs est de visualiser et de quantifier les variations électriques. Patch clamp technique est une brèche pour le suivi des cellules isolées, mais son application à des embryons de vertébrés est limitée car ils sont composés de plusi...

Bioélectricité se réfère à la signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane de la cellule1. Échanges ioniques à travers la membrane cellulaire et les changements actuels et potentiels électriques couplés, sont essentiels pour la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables. En outre, bioélectricité et gradients ioniques ont une variété d’autres fonctions biologiques importantes, y compris le stockage de l’énergie, la biosynthèse et transport de métabolite. Signalisation bioélectrique a également été découvert en tant que régulateur de la formation embryonnaire, tels que les axes du corps, le cycle cellulaire et la différenciation des cellules1. Ainsi, il est essentiel pour la compréhension de nombreuses maladies et malformations congénitales humaines résultant de la mauvaise régulation de ce type de signalisation. Patch clamp d’a été largement utilisé pour l’enregistrement des cellules isolées, mais il est loin d’être idéal pour la surveillance simultanée de plusieurs cellules au cours du développement embryonnaire in vivo. En outre, sensibles petites molécules de tension ne sont également pas idéales pour des applications in vivo en raison de leurs spécificités et sensibilités des toxicités.
La création d’une variété de génétiquement encodé tension fluorescent indicateurs (GEVIs) propose un nouveau mécanisme pour régler ce problème et permet une application à l’étude du développement embryonnaire, même si elles étaient initialement destinées à surveillance neurale les cellules2,3. D'entre les GEVIs actuellement disponibles est le capteur accélération de potentiels d’Action 1 (ASAP1)4. Il est composé d’une boucle extracellulaire d’un domaine de détection de tension de phosphatase sensibles de tension et une protéine fluorescente verte circulairement permutée. Par conséquent, ASAP1 permet la visualisation des changements de potentiel électrique cellulaires (polarisation : vert vif ; dépolarisation : vert foncé). ASAP1 a 2 ms et-marche cinétique et peut suivre une éventuelle variation4. Ainsi, cet outil génétique permet à un nouveau niveau d’efficacité en temps réel de surveillance bioélectriques dans des cellules vivantes. Mieux comprendre les rôles de la bioélectricité dans le développement embryonnaire et de nombreuses maladies humaines, comme le cancer, mettra en lumière nouvelle sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est essentiel pour la prévention et le traitement de la maladie.
Poisson zèbre ont fait leurs preuves un puissant modèle animal pour étudier la biologie du développement et des maladies humaines, y compris le cancer5,6. Ils partagent des gènes orthologues 70 % avec les humains, et ils ont biologie vertébrée similaire7. Poisson zèbre fournir relativement facile d’entretien, une grande couvée de œufs, tractable génétique, transgénèse facile et le développement embryonnaire externe transparent, qui en font un système supérieur pour in vivo d’imagerie5,6. Avec une source importante de lignées de poisson mutant déjà présentes et un génome entièrement séquencé, zebrafish fournira une gamme relativement illimitée de la découverte scientifique.
Pour étudier l’in vivo en temps réel l’activité électrique des cellules, nous profitons du système de modèle de poisson-zèbre et ASAP1. Dans cet article, nous décrivons comment incorporer le biocapteur de tension fluorescent ASAP1 dans le génome de poisson-zèbre à l’aide de Tol2 transposon transgénèse et visualiser l’activité électrique cellulaire durant le développement embryonnaire, mouvement larves de poisson et dans la tumeur direct .

<table><tbody><tr><td>Tubes de culture cellulaire de 14 ml</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>Culture E.Coli</td></tr><tr><td>Réservoir d’électrophorèse d’agarose Thermo</td><td>Scientific</td><td>Owl B2</td><td>Élétrophorèse de l’ADN</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Pour la fabrication des gels d’injection</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F amorce</td><td>IDT ADN</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>Amplification de la région codante ASAP1 pour le sous-clonage</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R amorce</td><td>IDT ADN</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTCTGTGAAGCCA</td><td>ASAP1 Amplification de la région codante pour le sous-clonage</td></tr><tr><td>Lunette de dissection en fond clair</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Déchorionation, microinjection, montage</td></tr><tr><td>Caméra couleur</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Embryon de poisson Enregistrement d’images</td></tr><tr><td>Lame concave</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Pour maintenir les embryons de poissons pendant le processus d’imagerie</td></tr><tr><td>Pipette de transfert jetable 3,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Embryons de poissons et transfert d’eau</td></tr><tr><td>Enzyme endonucléase, Not I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>Pour la linéarisation de l’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>Portée composée épifuorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Poisson Imagerie embryonnaire</td></tr><tr><td>Oscilloscope de dissection stéréo épifuorescente</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Imagerie d’embryons</td></tr><tr><td>de poisson Source de lumière</td><td>fluorescente Dynamique</td> lumineuse <td>X-cite seris 120</td><td>Source lumineuse pour microscopes à fluorescence</td></tr><tr><td>Forceps #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Déchorionnation et rupture d’aiguille</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Mélange d’enzymes</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP recombinaison clonage</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR clonage par recombinaison</td></tr><tr><td>Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>Purification de gel d’ADN</td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles capilaires</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Montage d’embryons de poissons</td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Supprime les épidémies fongiques dans les boîtes de Pétri</td></tr><tr><td>Moule de micro-injection</td><td>Outils de science adaptative</td><td>TU-1</td><td>Pour préparer un plateau de moule d’agaorse pour contenir les embryons de poisson pendant l’injection</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>WPI</td><td>Picopompe pneumatique PV820</td><td>Injecteur de micro-injection</td></tr><tr><td>Micro-manipulateur</td><td>WPI</td><td>Micro-injecteur MM3301R</td><td>Opération de micro-injection</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-1000</td><td>Pour la préparation de l’aiguille</td></tr> capillaire <tr><td>Huile minérale</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Pour l’étalonnage du volume d’injection</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>Transcription in vitro de l’ARNm</td></tr><tr><td>Caméra monocolore</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Enregistrement d’images d’embryons de poisson</td></tr><tr><td>Plasmide Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Préparer une petite quantité d’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en plastique</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Pour tenir des poissons ou des embryons de poisson pendant le processus d’imagerie</td></tr><tr><td>ARN Propre & Concentrateur-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Nettoyage de l’ARNm après transcription in vitro</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Pour la mesure des concentrations d’ADN et d’ARN</td></tr><tr><td>Micromètre d’étape</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Étalonnage du volume de micro-injection</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>Amplification de l’ADN pour le clonage de gènes</td></tr><tr><td>Paroi mince capillaires en verre</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Verre brut pour la fabrication de l’aiguille cappilaire</td></tr><tr><td>Amorce Tol2-exL1</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Essai d’accise Tol2</td></tr><tr><td>Amorce Tol2-exR</td><td>Amorce IDT ADN</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Essai d’accise Tol2</td></tr><tr><td>TOP10 E. coli chimiquement compétent</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Utilisé pour la transformation lors du clonage de gènes</td></tr><tr><td>Mésylate de tricaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Pour anesthésier des poissons ou des embryons de poissons</td></tr><tr><td>Trans-illuminateur UV 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>Visualisation de l’ADN</td></tr><tr><td></td><td>Bain-marie Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Pour le processus de transformation du clonage de gènes</td></tr></tbody></table>

visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioélectricité, signalisation électrique endogène véhiculée par les canaux ioniques et pompes situées sur la membrane cellulaire, joue un rôle important dans la signalisation des processus des cellules neuronales et musclés excitables et nombreux autres processus biologiques, tels qu’embryonnaire structuration du développement. Toutefois, il est nécessaire de in vivo , activité électrique suivi dans l’embryogenèse vertébré. Les avancées des indicateurs de tension fluorescents génétiquement encodé (GEVIs) ont permis d’apporter une solution à ce défi. Nous décrivons ici comment créer un zebrafish indicateur de tension transgéniques à l’aide de l’indicateur de tension établie, ASAP1 (accélération capteur de potentiels d’Action 1), à titre d’exemple. Le kit Tol2 et un promoteur omniprésent zebrafish, ubi, ont été choisis dans cette étude. Nous expliquons aussi les procédés de clonage à des fins spécifiques au site passerelle, transgenèse zebrafish axée sur le transposon Tol2 et le processus d’imagerie des tumeurs embryons et poisson poisson précoce, à l’aide de microscopes ordinaires épifluorescente. En utilisant cette ligne de poissons, nous avons constaté qu’il y a des variations de tension électrique cellulaire durant l’embryogenèse de poisson-zèbre et mouvement larves des poissons. En outre, il a été observé que dans les tumeurs de la gaine de nerf périphérique malin zebrafish quelques, la tumeur des cellules ont été généralement polarisées par rapport aux tissus normaux environnants.

En une injection réussie, plus que des embryons de poisson 50 % injecté affiche une certaine fluorescence verte dans les cellules somatiques et la plupart d'entre eux seront positif par le test de Tol2 transposon d’accise (Figure 2). Après que 2 à 4 générations de out-croix avec poissons de type sauvage (jusqu'à ce que le poisson fluorescent atteint 50 %, le ratio mendéliens prévues), les poissons transgéniques ont été utilisés pour l’expérimentation d’imager...

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

L’objectif global de cette procédure est de créer une lignée de poisson-zèbre transgénique qui permet d’observer les changements électriques cellulaires pendant l’embryogenèse, le mouvement larvaire et la genèse tumorale. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement, de la physiologie et de la biologie des cellules cancéreuses, telles que quels sont les rôles fondamentaux de la signalisation électrique cellulaire au cours de l’embryogenèse et dans les cellules tumorales ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de suivre la signalisation électrique cellulaire in vivo et en temps réel.Après avoir préparé l’ARNm de la transposase Tol2 et la solution d’injection selon le protocole textuel, l’après-midi précédant l’injection, mettez en place quatre à six bassins d’élevage avec au moins deux mâles et deux femelles. Pour réduire la quantité de déchets de poissons et induire une réponse de reproduction, évitez de nourrir les poissons l’après-midi. Le lendemain matin, retirez la solution d’injection préparée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-la sur de la glace.Tirez les séparateurs dans les aquariums d’élevage de poissons et laissez les poissons s’accoupler. En général, les poissons pondent leurs œufs dans les 20 à 30 minutes. Pendant l’attente, à l’aide d’un extracteur de micropipette avec les paramètres suivants, retirez les aiguilles du verre capillaire.Utilisez une lingette de laboratoire pour casser l’extrémité de l’aiguille et créer un bord biseauté. Un diamètre plus petit est préférable pour réduire la mortalité embryonnaire. Une fois que les poissons ont pondu leurs œufs, récupérez-les dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre.Immédiatement sous le microscope de dissection, retirez tous les embryons anormaux et les déchets de poisson. Ensuite, pipetez les embryons fécondés dans un moule d’injection d’agarose préparé à 3 %. Retirez l’excès d’eau pour aider à maintenir les embryons en place.Une fois que toutes les rangées sont remplies d’embryons viables, disposez-les de manière à ce que les cellules individuelles soient toutes orientées à un angle horizontal de 45 degrés par rapport à l’aiguille. Cela rendra l’injection beaucoup plus facile plus tard. Ensuite, tout en portant des gants, utilisez une pointe de pipette de chargement de 20 microlitres pour retirer cinq microlitres de la construction préparée du tube sur de la glace.Insérez soigneusement la pointe de la pipette dans l’extrémité arrière du tube capillaire cassé jusqu’à ce qu’elle commence à se rétrécir pour amener le réactif aussi près que possible de la pointe et l’expulser dans le capillaire. S’il y a encore des bulles d’air, secouez l’aiguille en veillant à ne pas casser la pointe. Insérez l’aiguille directement dans le porte-aiguille de micro-injection et serrez soigneusement jusqu’à ce que l’aiguille reste en place.Ajustez ensuite l’angle à environ 45 degrés. Une fois l’aiguille préparée et fixée, allumez le microscope et le réservoir de gaz sous pression. Ajustez le volume d’injection en utilisant environ 0,5 PSI pour le maintien et 30 PSI pour l’éjection.Vérifiez que la solution s’éjecte de l’aiguille lorsque vous appuyez sur la pédale. À l’aide d’un micromètre platien avec une goutte d’huile minérale, ajustez le volume et le débit de la solution à environ 10 micromètres de diamètre. Assurez-vous que la contre-pression permet à une petite quantité de solution de s’écouler de l’aiguille.S’il n’y a pas assez de contre-pression, l’action capillaire fera pénétrer du liquide dans l’aiguille et détruira l’ARNm. Une fois l’aiguille calibrée, insérez-la dans la cellule unique des embryons fécondés en utilisant le bord de l’encoche de gel pour fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille d’appliquer une pression sans déplacer l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la cellule unique, appuyez sur la pédale pour libérer la quantité souhaitée de solution.Il est important d’injecter la solution dans la cellule, et non le jaune, pour générer du poisson-zèbre transgénique. Répétez ce processus pour tous les embryons. Une fois terminé, utilisez une pipette de transfert de 3,4 millilitres et de l’eau du système de poisson pour transférer les embryons injectés dans une boîte étiquetée en les rinçant de l’encoche d’agarose.Conservez les embryons dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pour les laisser se développer. Revenez tout au long de la journée pour éliminer les embryons de poissons morts et remplacez l’eau par 0,1 % de bleu de méthylène dans l’eau des poissons. Environ six à huit heures après l’injection, utilisez 10 embryons de poisson injectés et la méthode hotshot pour préparer l’ADN génomique.Le lendemain matin, utilisez un microscope de dissection avec une source de lumière fluorescente pour trier les embryons présentant une GFP dans les tissus non vitellins. Ces embryons doivent contenir la construction injectée. Effectuez un test d’accise Tol2 pour vérifier l’activité du transposon comme décrit précédemment.Si du plasma excisé peut être détecté, conservez les embryons de poisson injectés et élevez-les. Sinon, répétez le processus de synthèse de l’ARNm de Tol2 et de micro-injection jusqu’à ce que vous obteniez des résultats positifs du test d’accise de Tol2. Pour imager les embryons de poisson-zèbre, croisez plusieurs poissons fondateurs de la génération F2 avec des poissons sauvages par paires individuelles.Prélever des embryons de poissons à différents stades de développement souhaités selon le guide de stadification du poisson zèbre. Pour les embryons de poissons à un stade précoce dans l’eau du système piscicole, sous une portée de dissection, utilisez une paire de pinces pour peler et retirer soigneusement les chorions. À l’aide d’une pipette de transfert d’élimination, transférez quelques embryons dans une lame de verre concave contenant 3 % de méthylcellulose.Ensuite, à l’aide d’une aiguille sous un endoscope de dissection, ajustez les embryons aux positions souhaitées pour voir l’activité cellulaire de la GFP. Pour les embryons au stade inférieur à 12 somites, utilisez un microscope composé d’épifluorescence avec une caméra compatible et un logiciel d’imagerie. Pour les embryons au-delà du stade 12 somite, utilisez un microscope à dissection par fluorescence.Pour imager la tension des cellules tumorales, identifiez d’abord les poissons atteints de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique ou MPNST. Placez le poisson dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre et effectuez l’imagerie de l’ensemble du support. Enfin, après l’imagerie, disséquez la tumeur avant de visualiser l’activité électrique des cellules tumorales.Lors d’une injection réussie, plus de 50 % des embryons injectés présenteront un certain degré de GFP dans les cellules somatiques et la plupart d’entre eux présenteront un résultat positif au test d’accise du transposon Tol2. Ici, les changements de potentiel membranaire ont été examinés tout au long du cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce du poisson-zèbre. Comme on le voit dans cette vidéo timelapse, les cellules se sont hyperpolarisées avant la formation du sillon de clivage.De plus, différents tissus ont montré une variété de potentiels membranaires chez des embryons de poissons âgés d’un à trois jours. Par exemple, le somite et le notocord étaient généralement hyperpolarisés par rapport aux tissus et organes adjacents. Chez cet embryon de poisson âgé de deux jours, des activités électriques neuromusculaires sont montrées pendant le mouvement avec des changements de densité de couleur correspondant à la transduction de la signalisation électrique.Les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses ont été examinées chez des embryons issus de croisements de poissons rapporteurs ASAP1 avec un mutant RPL35 sujet à la MPNST spontanée. Par rapport aux tissus environnants, les cellules tumorales étaient plus polarisées. Une fois maîtrisée, cette technique de micro-injection peut être réalisée en environ trois heures si elle est correctement exécutée.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les embryons de poisson-zèbre doivent être au stade d’une cellule pour des résultats idéaux. Avec son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement et de la biologie cellulaire pour explorer les changements de signalisation électrique in vivo chez le poisson-zèbre et d’autres organismes modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une lignée de poisson-zèbre transgénique par micro-injection.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Source : Williams, A. L., et al. Imagerie multi-photonique Time Lapse pour visualiser le développement en temps réel : visualisation des cellules de la crête neurale en migration dans les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un protocole d’imagerie time-lapse multiphotonique permettant de visualiser la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre en temps réel avec une haute résolution.

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poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

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