Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

L’objectif global de cette procédure est de créer une lignée de poisson-zèbre transgénique qui permet d’observer les changements électriques cellulaires pendant l’embryogenèse, le mouvement larvaire et la genèse tumorale. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement, de la physiologie et de la biologie des cellules cancéreuses, telles que quels sont les rôles fondamentaux de la signalisation électrique cellulaire au cours de l’embryogenèse et dans les cellules tumorales ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de suivre la signalisation électrique cellulaire in vivo et en temps réel.

Après avoir préparé l’ARNm de la transposase Tol2 et la solution d’injection selon le protocole textuel, l’après-midi précédant l’injection, mettez en place quatre à six bassins d’élevage avec au moins deux mâles et deux femelles. Pour réduire la quantité de déchets de poissons et induire une réponse de reproduction, évitez de nourrir les poissons l’après-midi. Le lendemain matin, retirez la solution d’injection préparée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-la sur de la glace.

Tirez les séparateurs dans les aquariums d’élevage de poissons et laissez les poissons s’accoupler. En général, les poissons pondent leurs œufs dans les 20 à 30 minutes. Pendant l’attente, à l’aide d’un extracteur de micropipette avec les paramètres suivants, retirez les aiguilles du verre capillaire.

Utilisez une lingette de laboratoire pour casser l’extrémité de l’aiguille et créer un bord biseauté. Un diamètre plus petit est préférable pour réduire la mortalité embryonnaire. Une fois que les poissons ont pondu leurs œufs, récupérez-les dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre.

Immédiatement sous le microscope de dissection, retirez tous les embryons anormaux et les déchets de poisson. Ensuite, pipetez les embryons fécondés dans un moule d’injection d’agarose préparé à 3 %. Retirez l’excès d’eau pour aider à maintenir les embryons en place.

Une fois que toutes les rangées sont remplies d’embryons viables, disposez-les de manière à ce que les cellules individuelles soient toutes orientées à un angle horizontal de 45 degrés par rapport à l’aiguille. Cela rendra l’injection beaucoup plus facile plus tard. Ensuite, tout en portant des gants, utilisez une pointe de pipette de chargement de 20 microlitres pour retirer cinq microlitres de la construction préparée du tube sur de la glace.

Insérez soigneusement la pointe de la pipette dans l’extrémité arrière du tube capillaire cassé jusqu’à ce qu’elle commence à se rétrécir pour amener le réactif aussi près que possible de la pointe et l’expulser dans le capillaire. S’il y a encore des bulles d’air, secouez l’aiguille en veillant à ne pas casser la pointe. Insérez l’aiguille directement dans le porte-aiguille de micro-injection et serrez soigneusement jusqu’à ce que l’aiguille reste en place.

Ajustez ensuite l’angle à environ 45 degrés. Une fois l’aiguille préparée et fixée, allumez le microscope et le réservoir de gaz sous pression. Ajustez le volume d’injection en utilisant environ 0,5 PSI pour le maintien et 30 PSI pour l’éjection.

Vérifiez que la solution s’éjecte de l’aiguille lorsque vous appuyez sur la pédale. À l’aide d’un micromètre platien avec une goutte d’huile minérale, ajustez le volume et le débit de la solution à environ 10 micromètres de diamètre. Assurez-vous que la contre-pression permet à une petite quantité de solution de s’écouler de l’aiguille.

S’il n’y a pas assez de contre-pression, l’action capillaire fera pénétrer du liquide dans l’aiguille et détruira l’ARNm. Une fois l’aiguille calibrée, insérez-la dans la cellule unique des embryons fécondés en utilisant le bord de l’encoche de gel pour fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille d’appliquer une pression sans déplacer l’embryon. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la cellule unique, appuyez sur la pédale pour libérer la quantité souhaitée de solution.

Il est important d’injecter la solution dans la cellule, et non le jaune, pour générer du poisson-zèbre transgénique. Répétez ce processus pour tous les embryons. Une fois terminé, utilisez une pipette de transfert de 3,4 millilitres et de l’eau du système de poisson pour transférer les embryons injectés dans une boîte étiquetée en les rinçant de l’encoche d’agarose.

Conservez les embryons dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pour les laisser se développer. Revenez tout au long de la journée pour éliminer les embryons de poissons morts et remplacez l’eau par 0,1 % de bleu de méthylène dans l’eau des poissons. Environ six à huit heures après l’injection, utilisez 10 embryons de poisson injectés et la méthode hotshot pour préparer l’ADN génomique.

Le lendemain matin, utilisez un microscope de dissection avec une source de lumière fluorescente pour trier les embryons présentant une GFP dans les tissus non vitellins. Ces embryons doivent contenir la construction injectée. Effectuez un test d’accise Tol2 pour vérifier l’activité du transposon comme décrit précédemment.

Si du plasma excisé peut être détecté, conservez les embryons de poisson injectés et élevez-les. Sinon, répétez le processus de synthèse de l’ARNm de Tol2 et de micro-injection jusqu’à ce que vous obteniez des résultats positifs du test d’accise de Tol2. Pour imager les embryons de poisson-zèbre, croisez plusieurs poissons fondateurs de la génération F2 avec des poissons sauvages par paires individuelles.

Prélever des embryons de poissons à différents stades de développement souhaités selon le guide de stadification du poisson zèbre. Pour les embryons de poissons à un stade précoce dans l’eau du système piscicole, sous une portée de dissection, utilisez une paire de pinces pour peler et retirer soigneusement les chorions. À l’aide d’une pipette de transfert d’élimination, transférez quelques embryons dans une lame de verre concave contenant 3 % de méthylcellulose.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille sous un endoscope de dissection, ajustez les embryons aux positions souhaitées pour voir l’activité cellulaire de la GFP. Pour les embryons au stade inférieur à 12 somites, utilisez un microscope composé d’épifluorescence avec une caméra compatible et un logiciel d’imagerie. Pour les embryons au-delà du stade 12 somite, utilisez un microscope à dissection par fluorescence.

Pour imager la tension des cellules tumorales, identifiez d’abord les poissons atteints de tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique ou MPNST. Placez le poisson dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre et effectuez l’imagerie de l’ensemble du support. Enfin, après l’imagerie, disséquez la tumeur avant de visualiser l’activité électrique des cellules tumorales.

Lors d’une injection réussie, plus de 50 % des embryons injectés présenteront un certain degré de GFP dans les cellules somatiques et la plupart d’entre eux présenteront un résultat positif au test d’accise du transposon Tol2. Ici, les changements de potentiel membranaire ont été examinés tout au long du cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce du poisson-zèbre. Comme on le voit dans cette vidéo timelapse, les cellules se sont hyperpolarisées avant la formation du sillon de clivage.

De plus, différents tissus ont montré une variété de potentiels membranaires chez des embryons de poissons âgés d’un à trois jours. Par exemple, le somite et le notocord étaient généralement hyperpolarisés par rapport aux tissus et organes adjacents. Chez cet embryon de poisson âgé de deux jours, des activités électriques neuromusculaires sont montrées pendant le mouvement avec des changements de densité de couleur correspondant à la transduction de la signalisation électrique.

Les propriétés bioélectriques des cellules cancéreuses ont été examinées chez des embryons issus de croisements de poissons rapporteurs ASAP1 avec un mutant RPL35 sujet à la MPNST spontanée. Par rapport aux tissus environnants, les cellules tumorales étaient plus polarisées. Une fois maîtrisée, cette technique de micro-injection peut être réalisée en environ trois heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les embryons de poisson-zèbre doivent être au stade d’une cellule pour des résultats idéaux. Avec son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement et de la biologie cellulaire pour explorer les changements de signalisation électrique in vivo chez le poisson-zèbre et d’autres organismes modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une lignée de poisson-zèbre transgénique par micro-injection.