Visualisation de la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre à l’aide de l’imagerie multiphotonique en accéléré

Commencez avec un embryon de poisson-zèbre transgénique vivant et déchorionné incorporé dans de l’agarose à bas point de fusion et placé dans une chambre remplie de milieux embryonnaires.

L’embryon exprime des cellules de crête neurale marquées à la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP).

Positionnez la chambre sur la platine du microscope. À l’aide d’un éclairage en fond clair, ajustez l’objectif pour qu’il fasse la mise au point et centre l’embryon dans le champ de vision.

Passez à l’objectif d’immersion dans l’eau et recentrez sur l’embryon.

Ajustez les paramètres d’imagerie pour acquérir des images de la pile Z du bord latéral au bord médial, en capturant la largeur de l’œil.

Désactivez l’éclairage en fond clair, couvrez la scène et lancez l’imagerie en accéléré.

Remplissez la chambre de média au besoin pendant l’imagerie.

Sous éclairage laser, les cellules de la crête neurale deviennent fluorescentes.

Visualisez la migration de ces cellules du tube neural vers les régions craniofaciales, autour de l’œil en développement pour peupler le mésenchyme périoculaire et le processus fronto-nasal, et ventralement pour former les arcs pharyngiens.

Après avoir placé l’ensemble de l’installation sur la platine du microscope, conformément au protocole de texte, utilisez l’objectif cinq fois pour localiser l’embryon. Ensuite, soulevez manuellement la platine à la position la plus haute et utilisez la mise au point fine pour positionner l’embryon au milieu de la portée du microscope.

Abaissez manuellement la platine et remplacez l’objectif par cinq par l’objectif d’immersion dans l’eau 25. Soulevez soigneusement la scène pour ramener l’embryon au point. Dans le logiciel, cliquez sur le mode xyzt pour obtenir plusieurs images à des intervalles de temps ou t dans le plan xy sur une profondeur de z.

Utilisez la vue épifluorescence ou en fond clair pour trouver la profondeur de champ dans la zone d’intérêt, ce qui délimitera la pile z. Pour ces expériences, le bord latéral de l’œil est le début de la pile z. Lorsque vous êtes sélectionné ici dans le logiciel, cliquez sur le bouton Commencer. Après avoir fait la mise au point sur la ligne médiane de l’embryon, qui est la fin de la pile z, cliquez sur le bouton Fin.

Une étape essentielle consiste à s’assurer que l’étape z englobe la zone d’intérêt. Dans notre cas, nous voulons capturer la largeur de l’œil des bords latéraux aux bords médiaux.

Cliquez sur le menu permettant de régler le temps d’acquisition et la fréquence d’imagerie. Pour une récupération adéquate du fluorophore et la survie de l’embryon, prévoyez un rapport d’au moins 1 à 3 entre l’acquisition de la pile z lorsque le laser est allumé et le temps de récupération lorsque le laser est éteint. Avec un temps approprié pour la récupération de l’embryon, réglez le temps entre les piles z et la fenêtre désignée. Définissez ensuite la durée totale de l’expérience dans la fenêtre appropriée.

Activez maintenant le paramètre d’image en direct pour effectuer les derniers ajustements des paramètres laser. Ajustez la transmission laser, le gain et les barres de défilement de décalage dans le logiciel pour optimiser l’image de fluorescence. Ajustez également l’orientation de l’embryon au besoin en fonction de la durée de l’expérience, de la croissance prévue de l’embryon, etc. Assurez-vous que la zone d’intérêt reste dans le cadre pendant toute la durée de l’expérience.

Pendant l’acquisition en accéléré, éteignez la source lumineuse d’épifluorescence. Couvrez la scène avec le boîtier de sécurité laser, qui est adéquat pour la protection contre la lumière de fond. Appuyez ensuite sur Démarrer.

Accédez à la chambre de bain ouverte par les portes coulissantes du boîtier de sécurité laser pour la remplir de milieu embryonnaire time-lapse toutes les 8 à 12 heures. Après l’acquisition de l’image, ouvrez les fichiers dans le logiciel de traitement d’image. Mettez en surbrillance la série d’images correcte.

Dans le logiciel, choisissez le menu Processus. Cliquez sur Déconvolution 3D et appliquez pour déconvolverver chaque pile z. Importez des fichiers TIFF individuels dans un logiciel de traitement vidéo. Sélectionnez ensuite tous les fichiers TIFF et faites-les glisser dans l’éditeur vidéo. Ajustez la durée de chaque image de la vidéo à 0,1 seconde. Enfin, exportez la vidéo sous forme de fichier MOV ou MP4.