Name: Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez les techniques de phénotypage visuel et microscopique de Streptomyces coelicolor pour la microbiologie. Ces protocoles accessibles permettent aux chercheurs débutants de manipuler et caractériser ces bactéries filamenteuses.

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Les auteurs aimerait remercier Otterbein University Undergraduate Student bourses de recherche et bourses de recherche fonds GVK et SGK ; et le Mémorial du professeur Gilbert E. Mills Otterbein doté de prix du programme sabbatique et le département de biologie et recherche de faculté de sciences de la terre et de bourses d’études doté Award à la Commission paritaire de recours. Le Bert et Jane corne doué étudiant fonds de recherche en Sciences a été décerné à GVK et SGK. Les auteurs tiens également à remercier sincèrement que l’Université Duquesne financé Undergraduate Research Programme bourses GVK et SGK. Étudiants-chercheurs premier cycle ancien Juniata College, Ryan Johnson et Lindsey Draper ont contribué les images de microscopie pour les Figures 2 et 3, respectivement.

1. préparer les Instruments, les milieux de Culture, des Solutions et Pétri
<ol><li>Cure-dents autoclave dans un bécher de 50 mL recouvert de papier d’aluminium pour garder stérile.</li>
	<li>Stériliser tous les marchandises sèches qui sera utilisé (conseils, bâtons, verrerie, etc.) dans un autoclave. Remarque : attention ! Suivez toutes les instructions de sécurité pour le modèle d’autoclave utilisé. Autoclaves présentent un risque d’explosions et les brûlures dues à la vapeur et le contact avec les surfaces chaudes, les matériaux et les médias. Pour la sécurité de l’autoclave, voir « Utilisation appropriée des Autoclaves »34.</li>
	<li>
Préparer la MS agar (farine de soja de Mannitol (GDF))14 à cultiver des cultures.
	<ol>
<li>Ajouter 5 g de farine de soja et 5 g d’agar dans ballon de 1 L.</li>
		<li>Dissoudre 5 g de mannitol dans 250 mL d’eau du robinet et verser dans le flacon contenant la farine de soja et de la gélose.</li>
		<li>Ajouter un bouchon de mousse et les feuilles à l’ouverture de la fiole et l’autoclave à 121 ° C, 15 lb/po2 pendant au moins 30 min. ATTENTION : Ce milieu se déborde facilement. Utilisez une fiole pouvant accueillir au moins quatre fois le volume réel d’agar MS être stérilisés à l’autoclave. Une marmite à pression standard peut être utilisé à la place de l’autoclave avec des considérations de sécurité similaires. Par ailleurs, un four à micro-ondes peut servir pour stériliser les médias et matériaux si accès à l’autoclave n’est pas possible de35,36. Enseignants du secondaire pouvez également collaborer avec les collèges locaux ou des universités à l’accès aux fournitures autoclavés.</li>
		<li>Cool media jusqu'à ce que suffisamment à l’aise à gérer. Soyez prudent pour le ne refroidir pas trop longtemps parce qu’agar se solidifie à une température inférieure à 50 ° C.</li>
		<li>Verser MS agar du flacon de Pétri stérile jusqu'à ce que le fond de chaque boîte de Pétri est environ la moitié plein (environ 25 mL de médias par boîte de Pétri). Laisser pour solidifier avant d’utiliser les boîtes de gélose. Stocker des boîtes de gélose dans un sac plastique à la température ambiante jusqu'à ce que nécessaire. Remarque : Des plaques de gélose peuvent également être stockés dans un réfrigérateur, surtout si les antibiotiques sont nécessaires dans les médias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. strie Streptomyces sur des plaques de multiplication
<ol><li>Souches de Streptomyces strie sur plaques de gélose MS pour les colonies individuelles à l’aide d’une méthode standard, comme le quadrant ensemencer méthode comme indiqué dans Sanders, 2012,37. Remarque : Une boucle d’inoculation ou cure-dents stériles peuvent être utilisés. Facultatif : Autres médias sont couramment utilisés pour les espèces de Streptomyces , tels que R2YE et milieu minimal14.</li>
	<li>Incuber à 30 ° C.</li>
	<li>Restreak plaques en choisissant une seule colonie tous les 4 à 6 jours. Comme âge de colonies qu’ils deviennent sujettes à des mutations aléatoires.</li>
</ol>3. créer des Stocks mycélienne de glycérol pour stockage bactérienne
NOTE : Les stocks de mycéliums peuvent être créées pour toutes les souches de Streptomyces , y compris whi bld souches et autres mutants du développement qui sont incapables de remplir la sporulation.
<ol><li>Macérer 15 – 20 colonies dans 200 – 500 µL de 20 % de glycérol à l’aide d’un applicateur stérile cheville en bois.</li>
	<li>Transférer la boue des colonies macérées dans un tube à culture 1,5 mL du congélateur, à l’aide d’une micropipette ou une pipette de transfert stérile. Remarque : Les bases de l’utilisation d’une micropipette sont couverts ailleurs38.</li>
	<li>Ajouter suffisamment 20 % de glycérol pour rendre le volume final 1 mL et mélanger doucement. Conserver les échantillons à-80 ° C. Remarque : attention ! Utiliser des gants de sécurité cryogénique et une blouse pour protéger la peau du contact avec le froid extrême. Alternativement, un congélateur à-20 ° C peut être utilisé avec possible réduction des durées de conservation à long terme. Éviter les excès de gel et de dégel pour prolonger la viabilité.</li>
</ol>4. créer les Stocks de Spore de glycérol pour les souches Capable de Sporulation
NOTE : Les stocks de spores sont préférables pour la viabilité à long terme mais sont uniquement possibles pour les souches qui sont capables d’achever la sporulation.
<ol><li>
Propagation de 100 µL de matériau macérée (à l’étape 3.1) sur une boîte de gélose pour obtenir une pelouse confluente de croissance37. NOTE : Placage de propagation est illustré à la Sanders37 (Modification : une platine n’est pas obligatoire.). La plaque peut être tournée d’une main tout en utilisant l’autre main pour déplacer le séparateur dans une douce en arrière mouvement à travers les milieux gélosés.<ol>
<li>Ajouter 100 µL de mycélium macéré au centre d’un plat d’agar MS.</li>
		<li>Stériliser un verre ou en métal qui se propage outil par partiellement submergeant dans l’éthanol à 70 % et en passant la barre de flèche une fois lentement à travers une flamme de bec Bunsen pour accélérer l’évaporation de l’éthanol. ATTENTION : L’éthanol est hautement inflammable. Ne pas placer la barre de flèche enflammée en éthanol ou permettre la goutte enflammée d’éthanol de tomber dans le plat de l’éthanol. Alternativement, utilisez un coton-tige stériles jetables à transmettre la bactérie sur la plaque, qui ne nécessite pas l’éthanol ou la flamme.</li>
		<li>Tournez l’agar MS plaque d’une main, tout en utilisant un dos et mouvement de va-et-vient pour inoculer la plaque avec l’épandeur stérile.</li>
		<li>Incuber pendant 5 à 7 jours à 30 ° C jusqu'à ce que la souche est bien sporulése. Remarque : Temps d’Incubation varie selon les espèces et variétés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 2 mL de sérum physiologique stérile (0,8 % NaCl) au centre d’une pelouse confluente de cellules de Streptomyces qui a subi la sporulation.</li>
	<li>Récoltez les spores en frottant doucement la surface du mycélium avec un stérile inoculer lentement les boucle (ou un coton-tige), se déplaçant vers le bord de la pelouse.</li>
	<li>Pipette de la saline contenant des spores dans un tube conique de 15 mL. Vortex vigoureusement pour briser les chaînes de spores dans des cellules individuelles.</li>
	<li>Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à environ 2 500 x g.</li>
	<li>Pipette le surnageant et le jeter. Disperse le culot de spores par agitation vortex vigoureux dans la petite quantité de liquide restant.</li>
	<li>Remettre en suspension les spores dans 1 mL de 20 % de glycérol en dessinant la solution de haut en bas avec une pipette.</li>
	<li>Transférer le stock de spore de glycérol dans un tube de congélateur de 1,5 mL. Conserver à-80 ° C. ATTENTION : Utiliser des gants de sécurité cryogénique et une blouse pour protéger la peau du contact avec le froid extrême. Alternativement, un congélateur à-20 ° C est activable avec une réduction potentielle de la viabilité dans le temps de stockage à long terme. Éviter les excès de gel et de dégel pour prolonger la viabilité.</li>
</ol>5. effectuer la mutagénèse
<ol><li>Effectuer la mutagénèse basé sur les résultats escomptés, tel qu’indiqué dans l' Introduction et étudié récemment Baltz, 201639. Remarque : Certaines expériences de phénotypage n’exigera pas de mutagenèse, tels que l’intention d’identifier de nouvelles espèces de l’environnement. Méthodes de mutagénèse aléatoire incluent l’utilisation d’un transposon8,9,10,11,12,13, rayons UV ou produits chimiques14. Mutagenèse15,16,17,18,19,20 techniques peuvent servir à créer des mutations ponctuelles, délétions, dirigée ou autres types de mutations.</li>
</ol>6. comparer et noter l’apparence visuelle
<ol><li>Prendre note de la morphologie des colonies pour chaque mutant par rapport à la souche sauvage après étalement de toutes les souches comme à l’étape 2. Comparer l’isolat de nouveau à celle d’une espèce bien étudiée, comme s. coelicolor ou s. venezuelae, lorsque la caractérisation de nouvelles espèces de Streptomyces . Notez les caractéristiques (Figure 1) telles que la forme de base, surface de colonie (floue, chauve, ridée, etc.), opacité, l’altitude et la pigmentation (distinguer le mycélium végétatif, mycélium aérien et/ou milieu environnant).</li>
	<li>Étiqueter un agar MS plaques et strie sauvage et les souches mutantes structure du coin (Figure 1). Veillez à ce qu’aucune souche ne touche une autre souche afin d’éviter la contamination croisée. Notez la date et l’heure auxquelles les souches sont ensemencées sur la plaque. Incuber les plaques à 30 ° C.</li>
	<li>Placez Pétri cultivés sur la couleur ou du papier blanc à homogénéiser l’arrière-plan. Écrire sur le papier le nom de souche, date, température d’incubation et l’heure de la première plaque de stries. Prendre numérique (s) de la plaque avec la dernière information écrite sur le fond de papier afin que la confusion est réduit au minimum. Remarque : L’écriture peut être recadrée de la photographie à une date ultérieure s’il doit être utilisé pour la préparation de la figure.</li>
</ol>7. effectuer la microscopie en contraste de Phase
<ol><li>Stériliser les pincettes par lavage à l’éthanol à 70 % et puis en passant par la flamme d’un brûleur Bunsen s’évaporer de l’éthanol. Laisser refroidir.</li>
	<li>Stériliser les lamelles par lavage à l’éthanol à 70 % et permettant ensuite de les faire sécher dans une boîte de Petri stérile.</li>
	<li>
Préparer une levée de la lamelle couvre-objet de la croissance bactérienne à examiner.
	<ol>
<li>Ramasser une lamelle stérile avec des pinces stériles et placez la lamelle sur une gélose au MS où la croissance bactérienne est dense. Appuyer sur le dos de lamelle doucement avec des pincettes pour assurer le transfert des spores bactériennes et mycélium aérien suffisant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ramasser la lamelle de la plaque et les placer de sorte que le côté avec le matériau à cellules est orienté vers la surface d’une lame de microscope, avec une baisse de 15 µL de 50 % de glycérol préparé dans de l’eau pour le montage. Réduire les bulles d’air en plaçant la lamelle à un angle de 45° à la diapositive et laissez-le tomber sur le glycérol à 50 %.</li>
	<li>(Facultatif) Joint avec clair vernis à ongles pour la préservation de la diapositive.</li>
	<li>
Effectuer la microscopie à contraste de phase comme décrit par Frohlich40 à divers intervalles de temps pendant les cycles de vie. Remarque : Imagerie répété permet une analyse plus complète et la capacité de détecter les retards dans le développement. Indépendamment de répéter les observations pour assurer l’exactitude et la reproductibilité.<ol>
<li>Placez la diapositive préparée sur la platine du microscope et ajouter une goutte d’huile à immersion au centre de la lamelle couvre-objet. Faire pivoter la phase X 100 objectif à placer et mettre la tourelle de condenseur réglage phase « correspondant ». Mettre l’image en utilisant uniquement le bouton de réglage fin, une fois que la lentille est en contact avec l’huile.</li>
		<li>Examiner plusieurs champs de vision pour discerner des différences perceptibles et cohérentes entre les souches mutantes et la souche sauvage, comme la possibilité de spores de forme, la dimension des spores et forme et nombre total de spores (voir Figure 2). Remarque : Des solutions de rechange à la microscopie à contraste de phase incluent interférence différentielle contraste (DIC) microscopie40 et des techniques de coloration simples pour utilisent avec microscopes champ lumineux41, telles que la coloration violette en cristal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. effectuer la microscopie en Fluorescence
<ol><li>Stériliser les pincettes de lavage dans l’éthanol à 70 % et en exécutant ensuite à travers une flamme du bec Bunsen.</li>
	<li>Ramasser une lamelle stérile avec des pinces stériles et placez-les sur une gélose au MS où la croissance bactérienne est évidente. Toucher doucement le dos de la lamelle avec la pince à épiler pour assurer le transfert des spores bactériennes et des filaments aériennes suffisant.</li>
	<li>Ramasser la lamelle de la plaque et les placer de sorte que le côté avec le matériel de la cellule vers le haut, sur papier cartonné pour faciliter la manipulation de la lamelle.</li>
	<li>Inonder la lamelle avec du méthanol glacee (~ 300 µL d’une lamelle de2 mm 20 x 20) et laisser complètement sécher à l’air. ATTENTION : Le méthanol est un mutagène. Évitez tout contact direct avec la peau.</li>
	<li>Laver trois fois à la lamelle dans la Saline tamponnée au Phosphate (PBS)42 en laissant couler doucement et retirer la solution.</li>
	<li>Ajouter 15 µL de 100 μg/ml d’iodure de Propidium et/ou 10 μg/mL agglutinine du germe de blé conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-WGA) faite à 50 % de glycérol à une lame de microscope étiquetée. NOTE : L’iodure de Propidium taches rouges pour détecter la localisation de l’ADN chromosomique tandis que WGA-FITC taches vertes de la paroi cellulaire d’ADN.</li>
	<li>Inverser la lamelle à l’envers sur la goutte de colorant fluorescent sur la lame de verre. Joint (en option) avec vernis à ongles transparent pour la préservation de la diapositive.  Comme les colorants sont sensibles à la lumière, incuber pendant 15 minutes dans une pièce sombre ou mal éclairée.</li>
	<li>Observer les diapositives sous un objectif 100 X à l’aide d’un contraste de phase ou microscope DIC avec cubes d’épifluorescence excitation pour l’iodure de propidium (« Texas Red » filtre défini ou maxima d’excitation/émission 535/617 nm) et FITC (FITC filter set ou 490/525 nm maxima d’excitation/émission).</li>
	<li>Placer la lame sur la scène et la mise au point en utilisant les boutons de réglage grossier et fin.</li>
	<li>Observer la fluorescence comme indiqué ailleurs43.</li>
	<li>Utiliser un image gratuit progiciel d’analyse qui peut aider à l’identification des spores avec plus faible fluorescence intensité44.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici des protocoles pour le début de Streptomyces chercheurs pour mener des études en incluant les étapes nécessaires pour propager des souches et de préparer des stocks pour le stockage à long terme. Nous décrivons ensuite les protocoles pour la caractérisation visuelle et microscopique de souches de Streptomyces . Des mesures initiales typiques chez les mutants du développement de phénotypage sont : 1) l’examen visuel des colonies mutantes par rapport au type sauvage colonies sur milieu gélosé ; 2) la microscopie contraste de phase ; et 3) microscopie de fluorescence des hyphes aériens sporogènes. D’après le phénotype affiché dans ces trois étapes, une variété de techniques peut-être être employée pour discerner davantage le phénotype d’une souche particulière.
Expériences de phénotypage initial sont couramment pour caractériser de nouvelles espèces, identifier des mutants d’intérêt, partiellement caractériser des mutants et commencer à discerner le rôle typique d’un gène particulier basé sur le phénotype d’un mutant identifié. Les méthodes décrites ici ont déjà été utilisés dans les laboratoires pour identifier et caractériser une grande variété de Streptomyces mutants, y compris ceux présentant des défauts dans la division cellulaire48,49, d’enseignement universitaire 50 , 51 , 52 , 53 , 54, la sporulation55,56, mycélium aérien formation57,,58,59de la production d’antibiotiques, second messager signalisation47et ségrégation des chromosomes 60. ces techniques sont les premières étapes essentielles à la détermination du phénotype des mutants en général et révèlent une grande quantité d’informations importantes concernant les rôles des gènes d’intérêt. Les méthodes peuvent facilement être étendus à d’autres espèces de Streptomyces et ont déjà été utilisés pour décrire des souches de S. griseus, S. venezuelae, S. scabieset nombreux autres streptomycètes. Vidéo protocoles décrits ici sont censés constituer une ressource importante pour les nouveaux chercheurs entrant dans le champs de recherche de Streptomyces , comme dans le domaine de découverte de médicaments. Cela inclut les nouveaux instructeurs qui travaillent pour lutter contre la crise de la résistance aux antibiotiques et à éduquer le nombre incalculable de nouveaux chercheurs étudiant en joignant les efforts de marketing participatif de l’Initiative mondiale petites.
Les techniques décrites ici peuvent être facilement adaptées pour utilisation en classe Collège et lycée en plus de laboratoires de recherche, en utilisant les modifications décrites dans la vidéo et le texte. Étudiants dans un module de microscopie première année dans un collège des arts libéraux petits ont pu ensemencer des souches, prendre des photographies numériques des souches cultivées sur milieu gélosé et effectuer la microscopie à contraste de phase et de la fluorescence, qui a abouti à la présentation d’un portefeuille des figures multiples lambrissées à la fin du module 3 semaines, ce qui représente 15 h de travail en laboratoire. Environ 160 étudiants de première année étaient responsables pour le phénotypage initiale de 320 mutants roman transposon. Stage de recherche élèves dans trois institutions ont participé le phénotypage initiale des mutants supplémentaires et la caractérisation subséquente de la plupart des souches. Les données complètes obtenues en une période relativement courte, illustrent l’intérêt des protocoles décrits ici. Des centaines d’autres mutants sont stockés comme des stocks mycélienne de glycérol pour la caractérisation des future.
Après les premières expériences décrites ici, diverses méthodes peuvent être utilisées pour étendre la qualité de l’information se rapportant aux souches d’intérêt. Si on ne connaît pas la mutation, une méthode de génotypage devrait être utilisée pour déterminer le type et/ou l’emplacement de la mutation. Par exemple, mutagénèse du transposon aléatoire des chromosomes sauvage6,7,8,9,10,11,12,13 se traduit par des colonies qui devraient faire l’objet initiales écrans phénotypiques telles que celles décrites ci-dessus. Puis l’emplacement du transposon doit être identifié à l’aide d’une technique comme inverse polymérase PCR (iPCR)61. Déterminer le génotype de mutants nouvellement découverts est une étape importante après la caractérisation initiale.
Certaines méthodes avancées couramment utilisés pour l’analyse de phénotypage ultérieure qui peut être repris en classe explorées dans le cadre de recherches plus poussées incluent protéine fluorescente verte (GFP) marquage afin de déterminer les schémas de localisation de la protéine d’intérêt, analyses d’expression génique comme real time PCR quantitative (qPCR) et profils d’expression génique global de type sauvage contre mutant par séquençage de l’ARN (RNA-seq). Phénotypage compétences sont également nécessaires pour l’analyse génétique de complémentation. Dans une expérience de complémentation, la copie sauvage d’un gène est introduite dans une souche mutée pour déterminer si l’allèle nouvellement ajouté peut compenser la perte de fonction de l’allèle muté. En comparant le phénotype de la souche complétée à celle de l’original mutant et parental, souche sauvage est requise.

Streptomycètes sont des bactéries Gram-positives, filamenteux sol connues pour leur capacité à produire une variété de métabolites secondaires, dont plus des deux tiers des antibiotiques disponibles dans le commerce, aussi bien comme anti-tumorales, médicaments anti-VIH et anti-parasitaires 1. S. coelicolor est le membre le plus génétiquement caractérisé du genre2,3 et est l’espèce utilisée dans les méthodes décrites ici. S. coelicolor a un cycle de vie complexe qui commence par la germination d’une spore unique, évoluant vers un mycélium végétatif extensive, ramification qui grandit dans le milieu gélosé. Comme le cycle de vie produit, aerial filaments sont forment qui casser la tension superficielle du mycélium substrat et sont enfin divisées en de longues chaînes de cellules qui sont finalement convertis en spores matures gris pigmentée. Dispersion de ces spores nouvellement formés constitue le début du prochain cycle de vie4.
En raison de son schéma complexe de différenciation, S. coelicolor sert un excellent modèle pour l’étude de développement bactérien. Historiquement, les mutations transformés en blocs de deux grandes étapes du développement et produisent des phénotypes visuels distincts. Les mutants (chauve) bld bloqués pour formation de mycélium aérien et se traduire par l’absence d’un mycélium aérien flou, conférant un aspect de la colonie « chauve ». Mutants inhibent dans la formation de spores et de maturation sont appelés des mutants whi (blanc) parce que généralement, ils ne parviennent pas à produire des niveaux de type sauvage du pigment gris spores et le mycélium aérien reste blanc. D’autres mutants intéressants sont inhibés dans la production d’antibiotiques, la division cellulaire, ségrégation des chromosomes ou autres processus importants4,5.
Malgré la découverte de nombreux gènes chez les espèces de Streptomyces , il y a beaucoup plus censé exister basé sur l’absence de saturation des écrans de mutant. Nos laboratoires de continuent à identifier de nouveaux gènes du développement, en utilisant un système de transposon mini que nous avons construit. Nouvelles souches mutantes isolés dans des expériences de mutagenèse aléatoire avec notre transposon subissent un dépistage phénotypique afin d’identifier le rôle possible de chaque nouveau gène découvert6,7. Les méthodes de phénotypage bactérienne décrites ici concernent des mutants de Streptomyces isolées par transposon mutagénèse8,9,10,11,12, 13 et autres méthodes aléatoires, tels que chimique et rayons ultraviolets (UV) mutagénèse14, ainsi que la construction dirigée de mutations comme les destructions de gène à l’aide de recombineering15,16 ou CRISPR-Cas9 (Clustered régulièrement entrecoupées court palindromique répète) génome édition technologie17,18,19 et mutations ponctuelles20.
Comme la résistance aux antibiotique chez les agents pathogènes est de plus en plus répandu, le besoin de nouveaux antibiotiques devient de plus en plus urgent de21,22. Le « Petit monde Initiative » (ou SWI) est un efficace Science, technologie, ingénierie et mathématiques (STEM) apprentissage23 et la recherche de stratégie24 pour lutter contre la résistance aux antibiotique par le crowdsourcing des étudiants du Collège, etc. récemment des lycéens. Prise en charge de cours de travail comprend l’identification de nouveaux microorganismes du sol qui produisent de nouveaux antibiotiques (http://www.smallworldinitiative.org). On croit qu’une source majeure d’antibiotiques non découvertes continueront d’être des espèces de Streptomyces trouvent dans un large éventail de sols et de l’eau des habitats25,26,27,28, 29,31. Récemment, le travail des autres et notre laboratoire ont découvert et caractérisé les gènes signalisation chez les espèces de Streptomyces qui régulent la morphologie et le développement, y compris la production d’antibiotiques7,32, 33. Changements dans l’expression de ces gènes entraînent un changement dans le montant et le calendrier des antibiotiques produites. Phénotypage qualifié de nouvelles espèces et de nouveaux mutants productrices d’antibiotiques continuera d’être important. Comme nouveaux instructeurs et leurs élèves deviennent des contributeurs majeurs dans le domaine de découverte de médicaments, formation en phénotypage bactérienne est nécessaire pour la réussite de ces personnes de novice. En outre, ces expériences sont faciles à aborder pour lycée tige ou les laboratoires de l’enseignement de microbiologie Université. Ils représentent une démonstration des principes fondamentaux de génétiques microbiennes dans un laboratoire d’enseignement définissant.

<table><tbody><tr><td>50 % Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’Immersion (Type DF)</td><td>Cragille&nbsp ;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Papier pour lentille</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>cure-dents (plat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1 250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs en bois 6''</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>cotons-tiges</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Farine de soja&nbsp ;</td><td>Le moulin rouge de Bob</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol 100 %</td><td>VWR amresco life science&nbsp ;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0,8 % NaCl (salin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1,2 mL tube de congélation</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra faible (-80 &deg ; C) congélateur</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Gants de sécurité</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Lames</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biologique 706706</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (tampon phosphate salin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL bécher</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L bécher</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flacon</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flacon</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL cylindre gradué</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué de 500 mL</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Caméra pour microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Gants d’examen en nitrile (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation visuelle et microscopique de streptomyces mutants du développement

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycètes sont des bactéries du sol filamenteux appartenant au phylum Actinobacteria qui sont trouvent dans le monde entier et de produisent un large éventail d’antibiotiques et autres métabolites secondaires. Streptomyces coelicolor est une espèce bien caractérisée, non pathogène qui se prête à une variété d’analyses en laboratoire. Les méthodes de phénotypage décrites ici servir de S. coelicolor un modèle streptomycète ; Cependant, les méthodes sont applicables à tous les membres de ce genre, mais aussi certains actinomycètes étroitement apparentées. Phénotypage est nécessaire pour caractériser les nouvelles espèces de Streptomyces identifiés dans l’environnement, et c’est aussi un premier pas essentiel pour la caractérisation des souches mutantes nouvellement isolés de Streptomyces. Maîtrise de phénotypage est important pour les nombreux nouveaux chercheurs qui entrent dans le champ de recherche de Streptomyces , qui comprend l’étude de développement bactérien, division cellulaire, ségrégation des chromosomes et second messager de signalisation. Le crowdsourcing récente d’antibiotiques découverte grâce à l’isolement de nouveaux microorganismes du sol a entraîné un besoin accru de formation dans le phénotypage des instructeurs de nouveau dans le domaine de la recherche de Streptomyces et leur collège ou le lycée étudiants. Ce manuscrit décrit des méthodes de propagation de la souche bactérienne, le stockage et caractérisation par examen visuel et microscopique. Après avoir lu cet article, les nouveaux chercheurs (laboratoires de microbiologie éducation et chercheurs bénévoles) devraient être capables de manipuler des souches de Streptomyces et commencer les expériences de caractérisation visuelle.

Expériences de phénotypage initiales sont nécessaires pour caractériser les souches et les nouvelles espèces et peuvent être utilisés comme une approche gratuite à la phylogénie et les expériences d’hybridation ADN-ADN qui sont utilisées pour caractériser les nouvelles espèces. Des mutants de Streptomyces résultant des méthodes de mutagénèse aléatoire chimique, UV, ou mutagénèse du transposon sont identifiés à travers des écrans directs, visuels sur milieu gélosé. Colonies de Streptomyces sont examinés pour des changements dans le phénotype par rapport à la souche sauvage, parentale. Par exemple, un mycélium aérien coloré plus léger peut indiquer un niveau inférieur de pigment gris causée par un défaut de la sporulation, ou l’absence d’une apparence floue est indicative d’un bloc dans la formation de mycélium aérien (Figure 1). Streptomycètes beaucoup produisent des antibiotiques pigmentées dans le mycélium végétatif ou gélose environnante. S. coelicolor produit deux antibiotiques pigmentés ainsi que deux de ceux non pigmentées. Actinorhodine est un antibiotique de pigmentation bleu et undecylprodigiosine est un antibiotique pigmentation rouge45. Les souches qui ont subi des écrans de colonie visuel initial sont ensuite propagées en ensemençant des colonies individuelles.
Suite à l’identification visuelle de potentiellement intéressant des mutants, souches sont soumis à l’examen microscopique. Contraste de phase microscopie est particulièrement adaptée à l’examen des mutants de Streptomyces pour défauts de développement, à l’aide de la souche sauvage comme un contrôle (Figure 2). Colonies de S. coelicolor de type sauvage produisent généralement un mycélium aérien par environ deux jours de croissance à 30 ° C sur gélose de MS et de longues chaînes de spores par trois jours de croissance. Le cycle de vie va progresser légèrement plus lent ou plus rapide sur d’autres types de médias. Il est impératif que les mutants soit analysé dans les mêmes conditions de croissance comme le type sauvage quand tirer des conclusions sur les anomalies du développement et les retards. Mutants chauves peuvent produire des spores après une croissance prolongée sur milieu gélosé. Une classe de mutants dénommé mutants blancs peuvent soit être retardées pour la formation de spores, montrent une réduction de l’abondance des spores produites, les spores de produits présentant des défauts de forme ou de taille, ou tout simplement produire des niveaux inférieurs du pigment spore mature, gris46 . Autres mutants étudiés jusqu’ici peuvent être retardées ou accélérés dans la progression de cycle de vie comme les mutants affectés pour l’accumulation de molécules (par exemple, GMP cyclique-di47) de signalisation.
Un simple suivi de la technique de microscopie photonique décrite ci-dessus est microscopie de fluorescence à l’aide de l’iodure de propidium à tache nucléoïdes de l’ADN chromosomiques et agglutinine du germe de blé fluorescent étiquetés pour colorer la paroi cellulaire de septum de sporulation. Les spores manque un chromosome sera dépourvu de l’iodure de propidium rouge coloration, tandis que les spores qui contiennent l’ADN moins que d’habitude peut-être être identifiés s’ils semblent avoir diminué de coloration (Figure 3). Agglutinine du germe de blé peut être utilisé pour colorer la paroi cellulaire et différences dans la coloration des modèles (c'est-à-dire, les défectuosités de la division cellulaire) de la paroi cellulaire peuvent être observés. En Figure 4 le sauvage-type de souche de S. venezuelae, une espèce qui a récemment servie un autre modèle streptomycètes en raison de son cycle de vie et sa capacité à sporuler dans liquide45, plus rapide a été teint avec WGA-FITC à élucider le tableau d’échelle des cloisons de division qui sont généralement vus très tôt au cours de la sporulation.
Les stratégies de phénotypage initiale décrites ici devraient se traduire par ce qui suit : 1) Identification des souches mutantes d’intérêt pour complément d’étude ; 2) acquis des connaissances sur le mutant nouvellement identifié et le rôle potentiel du gène qui a été muté ; 3) la formulation d’une série ultérieure des prochaines étapes expérimentales qui peuvent servir à clarifier le rôle du gène en question. Dans le cas d’un streptomycète nouvellement identifié dans l’environnement, le chercheur va acquérir des connaissances des nouvelles espèces potentielles par rapport aux déjà caractérisé de Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> Figure 1 : Photo d’une gélose représentatives démontrant des phénotypes macroscopiques colonie de S. coelicolor. La gélose présente les flous, gris aspect visuel du mycélium aérien pour sauvage S. coelicolor souche MT1110 (WT) par rapport aux différents mutants d’insertion de transposon aléatoire avec des phénotypes du développement. Des mutants ne manquent soit un mycélium aérien [chauve (bld)] ou un mycélium aérien avec pigmentation réduite spore [blanc (whi)]. Des mutants de transposon ont été générés à l’aide de mini-Tn5 pour insertion mutagénèse6,7. Les souches sont cultivées sur gélose MS pendant 5 jours à 30 ° C. Boîte de Pétri diamètre 100 mm.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> Figure 2 : Microscopie à contraste de Phase montrant un représentant aériennes filament pour S. coelicolor blanc mutant souches contenant aléatoire transposon insertion mutations. (A) affichée est un filament aérienne représentant type sauvage qui a fait l’objet de divisions cellulaires synchrones et régulièrement espacées, produisant uniformément en forme et taille des spores (MT1110). (B–F) Les panneaux restant montrent nettement différents phénotypes microscopiques de différents mutants blancs qui ont été isolés par mutagenèse aléatoire transposon. Panneau B montre un filament aérienne qui n’a pas subi la sporulation, mais au contraire a produit des zones bombés dans le filament. Flèches longues en C, Det F indiquent anormalement grandes spores qui sont caractéristiques des mutants MIC42, MIC43 et TH49. La flèche courte en panneau D indique un exemple d’un compartiment de spore lysés. Panneau E montre les partie rétrécies compartiments plus petits qui sont typiques des chaînes de spores produites par mutant TH10. Les souches sont cultivées sur gélose MS pendant 5 jours à 30 ° C. Les mutants ne sont pas liés à celles indiquées à la Figure 1. Une spore de type sauvage est environ 1,1 µm sur l’axe longitudinal. Echelle = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> Figure 3 : Représentant micrographies montrant S. coelicolor mutant chromosomique des phénotypes ségrégation. (A) A diagramme représentation montre l’aspect coloration typique sauvage et régulièrement espacées pour une chaîne de spores (chaque spore contient l’ADN chromosomique) contre le patron de coloration intermittent pour un mutant qui affiche un chromosome défaut d’isolement. (B) chaque paire de panneaux montre la spore même chaîne observée par image contraste d’interférence différentielle (DIC) sur la gauche et une image de fluorescence colorés à l’iodure de propidium est indiquée à droite. Le phénotype sauvage (a, b) est comparé à deux mutants d’insertion du transposon aléatoire (c, d et e, f). Les flèches indiquent les spores dépourvues de l’ADN. Les souches sont cultivées sur gélose MS pendant 5 jours à 30 ° C. Les mutants montrés ne sont pas liés à ceux de la Figure 1 et Figure 2. Echelle = 1 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> Figure 4 : Micrographie de Fluorescence de la souche sauvage S. venezuelae colorées avec WGA-FITC. (A) A diagramme d’un filament aérienne apparaît lisse avec aucun indentations et aucun signe visible de la sporulation au microscope à contraste de phase en comparaison avec le tableau d’échelle de coloration de la paroi cellulaire qui indique à un stade précoce de la sporulation n’a commencé dans cette même filament utilisant WGA-FITC sous fluoroscopie. (B) les micrographies de type sauvage S. venezuelae. (un) filaments aériennes lisse sont présents parmi les chaînes de spores. (b) dans le mycélium sur panneau, un filament aérienne à un stade précoce de développement possède un tableau de l’échelle des dépôts pariétaux. Les flèches indiquent la formation régulièrement espacées de parois transversales colorées par WGA-FITC qui se développent de façon synchrone au sein d’un seul filament aériens qu’elle subit la sporulation développemental associée à. La souche a été cultivée sur gélose MYM MYM (Maltose, extrait de YOrient, Malt extrait) pour 38 h à 30 ° C. Echelle = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici des protocoles pour les novices chercheurs pour lancer phénotypage du genre bactérien important sur le plan pharmacologique Streptomyces.

Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

L’objectif général des techniques suivantes est de former des chercheurs débutants pour travailler avec Streptomyces et d’autres espèces apparentées dans les laboratoires d’enseignement universitaire et les salles de classe des écoles secondaires. L’observation phénotypique est importante pour les nombreux chercheurs qui entrent dans le domaine de la recherche sur les streptomyces. Cette vidéo décrit les méthodes de propagation bactérienne, d’entreposage et d’examen visuel et microscopique.Les méthodes de phénotpy décrites ici utilisent Streptomyces coelicolor comme modèle. Cependant, les méthodes sont applicables à tous les membres du grand genre ainsi qu’aux Actinomyces étroitement apparentés. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont conçues pour être accessibles aux chercheurs novices dans une salle de classe de lycée ou un laboratoire d’enseignement de premier cycle, ainsi qu’au personnel de laboratoire expérimenté.Après avoir regardé cette vidéo et lu le protocole qui l’accompagne, les nouveaux chercheurs devraient être en mesure de manipuler leurs souches de Streptomyces, de les stocker correctement et de commencer des expériences de caractérisation visuelle. Garret Kandell et Sean Kirk, étudiants de premier cycle en recherche de mon laboratoire à l’Université Otterbein, feront la démonstration des procédures. Pour commencer, il faut utiliser une méthode standard, comme la méthode des traînées de quadrants démontrée dans Saunders (2012), qui consiste à tracer des souches de Streptomyces sur des plaques de gélose MS et à les cultiver en colonies individuelles.Tous les quatre à six jours, choisissez une seule colonie et réinstallez-la sur une assiette fraîche. Au fur et à mesure que les colonies vieillissent, elles deviennent sujettes à des mutations aléatoires. Après avoir effectué la mutagénèse selon le protocole de texte, notez la morphologie de la colonie pour chaque mutant par rapport à la souche parentale de type sauvage.Lors de la caractérisation de nouvelles espèces de Streptomyces, comparez le nouvel isolat à celui d’une espèce bien étudiée en notant la forme de base, la surface de la colonie, l’opacité, l’élévation et la pigmentation. Étiquetez une plaque de gélose MS et striez les souches de type sauvage et mutantes en coins. Veillez à ce qu’aucune souche ne touche une autre souche pour éviter la contamination croisée.Notez la date et l’heure auxquelles les souches sont striées sur la plaque. Ensuite, incubez les plaques à 30 degrés Celsius. N’oubliez pas qu’il est extrêmement important de toujours protéger votre échantillon de Streptomyces de la contamination.Utilisez votre meilleure technique stérile pour toutes les étapes, en ouvrant les plaques et les tubes le moins de temps possible. Placez des boîtes de Pétri cultivées sur du papier coloré ou blanc pour homogénéiser l’arrière-plan. Écrivez sur le papier le nom de la souche, la date, la température d’incubation et le temps écoulé depuis la première traînée de plaques.Prenez des photos numériques de la plaque avec les informations de déformation écrites sur le fond du papier afin que la confusion soit minimale. Stérilisez les pinces à épiler en les lavant avec de l’éthanol à 70 %, puis en les passant à travers une flamme de bec Bunsen pour évaporer l’éthanol. Stérilisez les lamelles en les lavant dans de l’éthanol à 70 %, puis en les laissant sécher dans une boîte de Pétri stérile.Ensuite, pour préparer un soulèvement de la croissance bactérienne, utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser une lamelle stérile et placez la lamelle sur une plaque de gélose MS où la croissance bactérienne est dense. À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur l’arrière de la lamelle pour assurer un transfert suffisant des spores bactériennes et du mycélium aérien. Prenez la lamelle de la plaque et placez-la à un angle de 45 degrés, le matériau de la cellule faisant face à la surface d’une lame de microscope contenant une goutte de 15 microlitres de glycérol à 50 %.Laissez la lamelle tomber sur le glycérol, ce qui réduira les bulles d’air. Pour effectuer une microscopie à contraste de phase à différents intervalles de temps, placez la lame préparée sur la platine du microscope et ajoutez une goutte d’huile d’immersion au centre de la lamelle. Faites pivoter l’objectif de phase 100x en place et réglez la tourelle du condenseur sur le réglage de phase approprié.Une fois que l’objectif est en contact avec l’huile, utilisez uniquement le bouton de réglage fin pour faire la mise au point de l’image. Examinez plusieurs champs de vision pour discerner des différences notables et constantes entre les souches mutantes et le type sauvage. Comme la capacité de former des spores, la taille et la forme des spores et le nombre total de spores.À l’aide d’une pince à épiler stérile, préparer un soulèvement de lamelle à partir d’une plaque de gélose MS comme précédemment où la croissance bactérienne est évidente, touchant doucement l’arrière de la lamelle avec la pince à épiler pour assurer un transfert suffisant de spores bactériennes et de filaments aériens. Ramassez la lamelle de la plaque et placez-la sur du papier cartonné de sorte que le côté avec le matériau de la cellule soit vers le haut pour faciliter la manipulation de la lamelle. Avec du méthanol glacé, inondez la lamelle et laissez-la reposer pendant cinq minutes.À l’aide de PBS, lavez la lamelle deux fois en distribuant doucement et en retirant la solution. Ajoutez 15 microlitres d’une solution d’iodure de propidium de 10 microgrammes par millilitre et/ou 10 microgrammes par millilitre de WGA-FITC sur une lame. Placez la lamelle face vers le bas sur une goutte de colorant fluorescent.Incuber les échantillons dans une pièce sombre ou faiblement éclairée pendant 15 minutes. Les stocks de colorants fluorescents et les échantillons de colorants doivent être protégés de la lumière. Il est recommandé aux chercheurs d’utiliser des conditions de faible luminosité lors de la préparation des échantillons et d’utiliser une boîte sombre pour conserver les échantillons une fois qu’ils sont préparés.Observez les lames sous une lentille d’objectif 100x à l’aide d’un microscope à contraste de phase ou DIC équipé de cubes d’excitation d’épifluorescence pour l’iodure de propidium et le FITC. Analysez les images selon le protocole texte. Voici des exemples de mutants de Streptomyces résultant de la mutagenèse par transposon.Un mycélium aérien de couleur plus claire peut indiquer un niveau plus faible de pigment gris causé par un défaut de sporulation. Ou l’absence d’apparence floue est indicative d’un blocage dans la formation du mycélium aérien. Comme le montre la microscopie à contraste de phase, les colonies sauvages de S. coelicolor produisent généralement un mycélium aérien environ deux jours de croissance.Et de longues chaînes de spores par trois jours de croissance. Les mutants blancs peuvent soit retarder la formation des spores, soit montrer une réduction de l’abondance des spores produites, soit produire des spores avec des défauts de forme et/ou de taille, soit simplement produire des niveaux plus faibles de pigment de spores matures et grises. Montré ici à l’aide de la microscopie DIC et de la microscopie à fluorescence avec coloration PI, la coloration régulièrement espacée d’une chaîne de spores dans un échantillon de type sauvage est comparée au modèle de coloration intermittente de deux mutants d’insertion de transposons qui présentent un défaut de ségrégation chromosomique.L’utilisation de WGA-FITC pour colorer la paroi cellulaire de la souche sauvage S. venezuelae est présente sous forme de filaments aériens lisses parmi les chaînes de spores. Et présente l’ensemble latéral de septa de division que l’on observe généralement lors de la sporulation. Travailler avec un organisme filamenteux est très différent de travailler avec une bactérie bien connue, en forme de bâtonnet.Les protocoles vidéo présentés ici devraient servir de ressource importante pour les nouveaux chercheurs qui entrent dans le domaine de la recherche sur les streptomyces. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de commencer à étudier les espèces de Streptomyces et d’autres bactéries apparentées. À la suite de ces premières expériences, diverses techniques peuvent être utilisées dans un laboratoire de recherche pour en savoir plus sur vos souches de Streptomyces.Par exemple, certaines des techniques avancées peuvent être le marquage de protéines ou l’analyse de l’expression génique telle que la PCR en temps réel et le séquençage de l’ARN. Les expériences initiales de phénotypage sont utilisées pour identifier et caractériser de nouvelles souches et discerner le rôle typique d’un gène particulier. Ces méthodes ont déjà été utilisées dans des laboratoires d’enseignement universitaire pour identifier et caractériser une grande variété de souches de Streptomyces.

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