Microscopie à contraste de phase pour l’évaluation des mutants développementaux chez les streptomyces

Commencez par des plaques de gélose contenant des colonies de souches sauvages et mutantes de Streptomyces coelicolor, une bactérie filamenteuse du sol.

Placez une lamelle stérile sur une région de croissance dense de la colonie où les filaments aériens, qui sont des filaments s’étendant au-dessus de la surface de la colonie, sont clairement visibles.

Appuyez doucement sur la lamelle pour transférer les filaments aériens et les spores associées sur la surface de la lamelle.

Ensuite, prenez une lame de microscope avec un support de montage et montez la lamelle côté cellule vers le bas pour préserver les structures bactériennes.

Placez la lame sur une platine de microscope, ajoutez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle de recouvrement et alignez l’objectif.

À l’aide de la microscopie à contraste de phase, acquérez des images des filaments aériens de souches de type sauvage et mutantes.

Les filaments de type sauvage présentent des spores de taille uniforme et régulièrement espacées.

En revanche, les souches mutantes présentent des défauts, tels que des filaments bombés, des spores irrégulières ou des spores lysées, révélant des différences phénotypiques de développement entre le type sauvage et les mutants.

Pour préparer un soulèvement de la croissance bactérienne, utilisez une pince à épiler stérile pour ramasser une lamelle stérile et placez la lamelle sur une plaque de gélose MS où la croissance bactérienne est dense. À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur l’arrière de la lamelle pour assurer un transfert suffisant des spores bactériennes et du mycélium aérien. Prenez la lamelle de la plaque et placez-la à un angle de 45 degrés, le matériau de la cellule faisant face à la surface d’une lame de microscope contenant une goutte de 15 microlitres de glycérol à 50 %.

Laissez la lamelle tomber sur le glycérol, ce qui réduira les bulles d’air. Pour effectuer une microscopie à contraste de phase à différents intervalles de temps, placez la lame préparée sur la platine du microscope et ajoutez une goutte d’huile d’immersion au centre de la lamelle. Faites pivoter l’objectif de phase 100x en place et réglez la tourelle du condenseur sur le réglage de phase approprié.

Une fois que l’objectif est en contact avec l’huile, utilisez uniquement le bouton de réglage fin pour faire la mise au point de l’image. Examinez plusieurs champs de vision pour discerner des différences notables et constantes entre les souches mutantes et le type sauvage. Comme la capacité de former des spores, la taille et la forme des spores et le nombre total de spores.