Création et optimisation d'une installation à haut débit pour l'étude Staphylococcus epidermidis Et Mycobacterium marinum Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

L’objectif global de cette procédure est de générer un grand nombre d’embryons de poisson-zèbre infectés pour des tests de composés à haut débit afin de permettre la découverte de médicaments. Ceci est accompli en utilisant d’abord un grand récipient d’élevage pour obtenir un grand nombre d’œufs de poisson-zèbre synchrones en un seul événement. Ensuite, les œufs sont alignés dans une grille aros et infectés par des bactéries dans le jaune à l’aide d’un micro-injecteur automatisé.

Lorsque l’infection s’est propagée à travers les embryons, ceux-ci sont pré-triés par cytométrie à grand flux de particules avant d’être traités avec des médicaments. Enfin, les niveaux de charge bactérienne dans les embryons infectés sont analysés après le traitement composé. En fin de compte, l’analyse à haute résolution par microscopie confocale des vertèbres.

Le dépistage automatisé et l’échantillonnage de grandes particules sont utilisés pour montrer plus en détail les effets des composés sur l’infection. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes telles que les injections manuelles ou l’analyse par balayage PIX, est qu’elle permet de générer une grande quantité d’embryons uniformément affectés, que nous pouvons analyser à haut débit. Pour préparer l’inoculum de l’épiderme S, isolez plusieurs colonies individuelles à partir d’une plaque de souche de l’épiderme S, O 47 contenant un vecteur d’expression de la cerise M dérivé de P VW VW 180 9, et inoculez.

25 millilitres de LB complétés par 10 microgrammes par millilitre. Le chloramphénicol incube toute la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’au stade midlock le lendemain, centrifuge un millilitre de la culture à 12 000 GS pendant une minute et utilise un millilitre de PBS stérile avec 0,3 % de volume par volume entre 80 pour laver la pastille trois fois. Mesurez la densité optique à OD 600 et utilisez 2 % en poids par volume, du polyvinyle péronné 40 ou du PVP 40 dans du PBS pour diluer la suspension bactérienne à un DO 600 égal à 0,3 ou un fois 10 à la puissance huit UFC par millilitre.

Pour préparer l’inoculum aminum, isolez plusieurs colonies individuelles de la souche M Meum M ou E 11 exprimant de manière stable le vecteur cerise PS MT 3M d’un Middlebrook sept H 10, aérez et inoculez 10 millilitres de bouillon Middlebrook sept H neuf contenant 10 % de volume par volume. Middlebrook Un enrichissement DC complété par 50 microgrammes par millilitre d’hygromycine incube pendant la nuit à 28 degrés Celsius le lendemain. Centrifugez un millilitre de culture à 12 000 GS pendant une minute et utilisez un millilitre de PBS stérile avec 0,3 % de volume par volume entre 80 pour laver la pastille trois fois.

Mesurer la DO 600 de la suspension bactérienne et avec 2 % de poids par volume. PVP 40 dans du PBS dilué à une DO 600 de 0,3 ou 0,3 fois 10 à la huitième UFC par millilitre pour obtenir des œufs de poisson zèbre la nuit précédant la collecte, placez un maximum de 50 poissons zèbres femelles dans la chambre inférieure d’un grand récipient d’élevage et 70 mâles dans la partie supérieure du récipient. Le lendemain matin, retirez le séparateur du récipient Après environ une heure à travers le collecteur d’œufs au fond du récipient d’élevage, recueillez les œufs dans un tube de 50 millilitres rempli d’eau d’œuf.

Après avoir préparé les plaques d’injection, selon le protocole textuel du logiciel d’exploitation du micro-injecteur automatisé, cliquez sur l’étape d’étalonnage, puis cliquez sur 10 24. Grille de puits et placez la plaque aros dans le micro injecteur, calibrez la plaque en cliquant sur l’écran en position centrale du puits. Allez ensuite dans le menu des aiguilles et cliquez sur calibrer le porte-aiguille.

À l’aide d’une pointe de micro-chargeur, remplissez une aiguille d’injection de 10 microns de diamètre avec soit 10 microlitres de PVP 40 contenant 100 UFC par nanolitre d’épiderme S, 30 UFC par nanolitre d’érum ou PVP 40 seul pour les injections fictives, placez l’aiguille dans le micro-injecteur automatisé et calibrez la position XY en abaissant ou en déplaçant l’aiguille vers le haut et en cliquant sur l’écran à la position de l’aiguille. Calibrez ensuite la position Z de l’aiguille en cliquant sur l’écran à la position de la pointe de l’aiguille. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, répartissez les œufs sur la grille d’aros et retirez tout excès d’eau d’œuf.

Placez ensuite la grille agros remplie d’œufs dans le micro-injecteur automatisé dans le menu d’injection, ajustez le réglage de la pression d’injection à 200 hectares de pascals, le temps d’injection à 0,2 seconde et la pression de compensation à 15 Hector pascals, ce qui correspond à un nanolitre dans le menu de réglage du jet Femto. Cliquez sur injecter tout et injectez toute la plaque d’embryons après l’injection. Récupérez les œufs en les lavant dans une boîte de Pétri et incubez-les à 28 degrés Celsius.

Une fois le cytomètre à grand flux de particules configuré, entrez dans le menu PMT et réglez le canal rouge sur 650 volts et les canaux vert et jaune sur zéro volts. Ensuite, dans le menu des seuils, réglez le signal de seuil de densité optique sur 50, ce qui correspond à 975 millivolts et le temps de vol minimum à 800, ce qui correspond à 320 microsecondes. Afin de réduire l’influence des débris, placez les embryons dans le gobelet d’échantillonnage et dans le menu de tri pour trouver le maximum de 70 embryons par plaque à trier en entrant 70.

Placez une boîte de Pétri vide sous le trieur et cliquez sur tri manuel. Lorsque la boîte de Pétri est remplie, enregistrez les données en cliquant sur stocker. Si une analyse ou une imagerie à haute résolution est nécessaire, les embryons peuvent être triés individuellement dans des puits d’une plaque de 96 puits.

Placez les embryons dans le gobelet d’échantillonnage et définissez le maximum d’un embryon par puits à trier. Placez ensuite une plaque vide à 96 puits dans le support de plaque gauche et cliquez sur la plaque de remplissage. Lorsque la plaque est remplie, enregistrez les données en cliquant sur stocker pour analyser les embryons traités par médicament trois jours après l’injection d’erum.

Traitez un groupe d’embryons avec un composé d’intérêt dans le solvant et un deuxième groupe avec du solvant seul. Placez les embryons traités quatre et cinq jours après la fécondation dans le gobelet d’échantillonnage du cytomètre en flux et réglez le tri à 70 embryons par plaque après avoir anesthésié les embryons dans les triques et mis en place le système de dépistage automatisé des vertébrés et l’échantillonneur de grandes particules. Selon le protocole texte du menu de configuration de la détection d’objets d’imagerie, sélectionnez les images de référence correspondant à l’âge des embryons dans le menu de stockage automatique des images d’imagerie, sélectionnez le nombre d’images à créer et l’orientation à utiliser.

Placez une plaque de 96 puits remplie d’embryons dans le support de plaque gauche de l’échantillonneur de grosses particules et cliquez sur la plaque d’essai. Lorsqu’un embryon est correctement positionné, utilisez un objectif sec 10 x et imagez la tête et la queue séparément. Ensuite, utilisez un logiciel de traitement d’images pour assembler les images afin d’évaluer quel stade de développement est le meilleur pour l’infection par le vitellin.

Des injections de dermite et de marum ont été réalisées à tous les différents stades entre le stade d’une cellule et le stade 512. Comme on le voit ici, les injections de 100 UFC de dermite effectuées entre le stade 16 et 128 cellules ont fourni le meilleur profil d’infection. La bactérie a proliféré à l’intérieur du jaune pendant trois jours et s’est propagée dans le corps à partir de trois jours après l’infection.

La quantification à haut débit de la charge bactérienne a été réalisée par analyse de l’intensité de fluorescence à l’aide du cytomètre à grand flux de particules. Comme le montre ici, la quantité de bactéries vivantes présentes à l’intérieur de l’embryon correspond très bien au signal fluorescent mesuré. Cette figure démontre que le stade de développement optimal pour l’injection de 30 UFC d’aminum se situe entre le stade 16 et 128 cellules pour la souche E 11 et entre le stade 16 et 64 cellules.

Avec la souche EM plus virulente, les embryons injectés à ces stades ont montré une croissance bactérienne à l’intérieur du chêne et une propagation de la bactérie à travers l’embryon. Après le traitement préliminaire des embryons infectés par l’émerine avec différentes concentrations de rifampicine a montré une réduction de l’infection mycobactérienne de manière dose-dépendante. L’utilisation du médicament à une dose de 200 micromolaires a démontré qu’il arrêtait efficacement la progression bactérienne de M mein E 11, 24 heures et plus après le traitement après son développement.

Ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des tests de composés et du développement de médicaments, à la recherche de nouveaux traitements pour des maladies infectieuses telles que la tuberculose ou les infections associées aux biomatériaux.