Création et optimisation d'une installation à haut débit pour l'étude

L'objectif général de cette procédure est de produire un grand nombre d'embryons de poisson zèbre infectés pour des tests à haut débit de composés, permettant ainsi la découverte de médicaments. Cette étape est réalisée en utilisant d'abord un grand récipient d'accouplement afin d'obtenir un grand nombre d'œufs de poisson zèbre synchronisés lors d'un seul événement. Ensuite, les œufs sont alignés dans une grille aros et infectés avec des bactéries dans le jaune au moyen d'un micro-injecteur automatisé.

Lorsque l'infection s'est propagée dans les embryons, ceux-ci sont prétriés par cytométrie en flux à grosses particules avant d'être traités par des médicaments. Enfin, les niveaux de charge bactérienne dans les embryons infectés sont analysés après le traitement par le composé. En définitive, une analyse de haute résolution est réalisée par microscopie confocale de la vertèbre.

Le criblage automatisé et l'échantillonnage de particules de grande taille sont utilisés pour montrer de manière plus détaillée les effets des composés sur l'infection. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que les injections manuelles ou l'analyse par balayage PIX, réside dans la possibilité de générer un grand nombre d'embryons uniformément affectés, que l'on peut analyser de manière haut débit. Pour préparer l'inoculum de S epiderm, isolez plusieurs colonies individuelles à partir d'une plaque de la souche S epiderm O 47 contenant le vecteur d'expression M cherry dérivé de A PW VW 180 9, puis effectuez l'inoculation.

25 millilitres de LB supplémentés avec 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol, incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius jusqu'au stade de milieu de phase logarithmique le lendemain. Centrifuger un millilitre de la culture à 12 000 ×g pendant une minute et utiliser un millilitre de PBS stérile avec 0,3 % volume par volume de Tween 80 pour laver le culot trois fois. Mesurer la densité optique à OD 600 et utiliser 2 % poids par volume de polyvinylpyrrolidone 40 ou PVP 40 dans du PBS pour diluer la suspension bactérienne à une OD 600 égale à 0,3 ou à une concentration de un fois dix puissance huit UFC par millilitre.

Pour préparer l'inoculum d'aminum, isolez plusieurs colonies individuelles de la souche M Meum M ou E 11 exprimant de façon stable le vecteur PS MT 3M cherry à partir d'un milieu Middlebrook sept H 10, aérez-le et inoculez 10 millilitres de bouillon Middlebrook sept H neuf contenant 10 % volume par volume. Complétez avec l'enrichissement Middlebrook A DC supplémenté avec 50 microgrammes par millilitre d'hygromycine et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius. Le jour suivant, centrifugez un millilitre de la culture à 12 000 ×g pendant une minute et utilisez un millilitre de PBS stérile avec 0,3 % volume par volume entre 80 et 100 pour laver le culot trois fois.

Mesurez la DO à 600 nm de la suspension bactérienne à 2 % en poids par volume de PVP 40 dans du PBS, diluée à une DO à 600 nm de 0,3 ou 0,3 × 10⁸ UFC par millilitre, pour obtenir les œufs de poisson zèbre. La veille du prélèvement, placez un maximum de 50 femelles de poisson zèbre dans la chambre inférieure d’un grand récipient de reproduction et 70 mâles dans la partie supérieure du récipient. Le lendemain matin, retirez le séparateur du récipient. Après environ une heure, récupérez les œufs à travers le collecteur situé au fond du récipient de reproduction, puis transférez-les dans un tube de 50 millilitres rempli d’eau pour œufs.

Après avoir préparé les plaques d'injection, conformément au protocole indiqué dans le logiciel de fonctionnement du micro-injecteur automatisé, cliquez sur « calibrer la platine », puis sur la grille 10 24. Placez la plaque aros dans le micro-injecteur et étalonnez la plaque en cliquant à l'écran sur la position centrale du puits. Puis accédez au menu de l'aiguille et cliquez sur « calibrer le porte-aiguille ».

À l’aide d’une micro-pipette de chargement, remplir une aiguille d’injection de 10 micromètres de diamètre avec 10 microlitres de PVP 40 contenant 100 UFC par nanolitre de S epiderm, 30 UFC par nanolitre d’erum, ou du PVP 40 seul pour les injections témoins. Placer l’aiguille dans le micro-injecteur automatisé et calibrer la position XY en abaissant ou en déplaçant l’aiguille vers le haut, puis en cliquant à l’écran sur la position de l’aiguille. Ensuite, calibrer la position Z de l’aiguille en cliquant à l’écran sur la position de l’extrémité de l’aiguille. Puis, à l’aide d’une pipette plastique de transfert, répartir les œufs sur la grille aros et éliminer l’excès d’eau des œufs.

Ensuite, placez la grille d'agros remplie d'œufs dans le micro-injecteur automatisé, dans le menu d'injection. Réglez la pression d'injection à 200 hectopascals, la durée d'injection à 0,2 seconde et la pression de compensation à 15 hectopascals, ce qui correspond à un nanolitre dans le menu de paramètres du Femtojet. Cliquez sur « Injecter tout » et injectez l'ensemble des embryons de la plaque. Récupérez les œufs en les rinçant dans une boîte de Pétri, puis incubez-les à 28 degrés Celsius.

Une fois le cytomètre de flux pour particules de grande taille configuré, accédez au menu PMT et réglez le canal rouge sur 650 volts, ainsi que les canaux vert et jaune sur zéro volt. Ensuite, dans le menu des seuils, réglez le signal de seuil de densité optique à 50, correspondant à 975 millivolts, et le temps minimal de vol à 800, correspondant à 320 microsecondes. Afin de réduire l'influence des débris, placez les embryons dans le récipient d'échantillonnage et, dans le menu de tri, sélectionnez un maximum de 70 embryons par plaque à trier en indiquant 70.

Placer une boîte de Petri vide sous le trieuse et cliquer sur tri manuel. Lorsque la boîte de Petri est pleine, enregistrer les données en cliquant sur stocker. Si une analyse ou une imagerie haute résolution est requise, les embryons peuvent être triés individuellement dans les puits d'une plaque de 96 puits.

Placez les embryons dans la cuve d'échantillon et définissez un maximum d'un embryon par puits à trier. Ensuite, positionnez une plaque 96 puits vide dans le support de plaque gauche et cliquez sur remplir la plaque. Une fois la plaque remplie, enregistrez les données en cliquant sur stocker afin d'analyser les embryons traités au médicament à trois jours post-injection avec erum.

Traitez un groupe d'embryons avec un composé d'intérêt dans un solvant et un deuxième groupe avec le solvant seul. Placez les embryons traités à quatre et cinq jours post-fécondation dans la cuve d'échantillon du cytomètre en flux et configurez le tri pour 70 embryons par plaque après avoir anesthésié les embryons dans du trica, puis configuré le système automatisé de dépistage des vertébrés et l'échantillonneur de particules de grande taille. Selon le protocole texte issu du menu de configuration de la détection d'objets en imagerie, sélectionnez les images de référence correspondant à l'âge des embryons dans le menu d'enregistrement automatique des images en imagerie, puis choisissez le nombre de clichés à effectuer ainsi que l'orientation à utiliser.

Placer une plaque de 96 puits remplie d'embryons dans le support de plaque gauche de l'échantillonneur de grandes particules et cliquer sur « exécuter la plaque ». Lorsqu'un embryon est correctement positionné, utiliser un objectif sec sec 10 x et acquérir séparément des images de la tête et de la queue. Ensuite, utiliser un logiciel de traitement d'images pour assembler les images afin d'évaluer quel stade de développement est le plus approprié pour l'infection du vitellus.

Des micro-injections de dermitis et de marum ont été réalisées à tous les stades différents, du stade uniloculaire au stade 512 cellules. Comme on le voit ici, les micro-injections de 100 UFC de dermitis effectuées entre le stade 16 cellules et le stade 128 cellules ont donné le meilleur profil d'infection. Les bactéries se sont multipliées à l'intérieur du vitellus pendant trois jours et se sont répandues dans l'organisme à partir du troisième jour post-infection.

La quantification à haut débit de la charge bactérienne a été réalisée par analyse de l'intensité de fluorescence à l'aide d'un cytomètre de flux à grosses particules. Comme illustré ici, la quantité de bactéries vivantes présentes à l'intérieur de l'embryon correspond très bien au signal fluorescent mesuré. Cette figure montre que le stade de développement optimal pour l'injection de 30 UFU d'aminum se situe entre le stade 16 et 128 cellules pour la souche E 11, et entre le stade 16 et 64 cellules.

Avec la souche EM plus virulente, les embryons injectés à ces stades présentaient une croissance bactérienne à l'intérieur du tissu et une propagation des bactéries à travers l'embryon. Après un traitement préalable d'embryons infectés par l'émerine avec différentes concentrations de rifampicine, on a observé une réduction de l'infection mycobactérienne de manière dépendante de la dose. L'utilisation du médicament à une dose de 200 micromolaire a démontré qu'il arrêtait efficacement la progression bactérienne de M. mein E 11, 24 heures et plus après le traitement, une fois son développement achevé.

Ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du test de composés et du développement de médicaments, à la recherche de nouveaux traitements contre les maladies infectieuses telles que la tuberculose ou les infections associées aux biomatériaux.