Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de l’ingénierie des cellules souches, telle que la façon dont le microenvironnement cellulaire modifie les phénotypes et la fonction cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit l’environnement multiple créé artificiellement pour les cellules dans une seule plaque, ce que vous ne pourriez pas réaliser avec une méthode conventionnelle en plaque de micro-contact, démontrant cette procédure par Koki Yoshimoto et Risako Sakai, techniciens de notre laboratoire. Après avoir créé des images 3D de masques pour des réseaux de nanofibres et des moules à partir de structures microfluidiques selon le protocole de texte.

Utilisez une imprimante 3D pour imprimer les masques et le moule. Pour préparer des solutions polymères pour l’électrofilage, diluez 13 % de liquide PMGI avec du tétrahydrofurane à neuf pour cent. Dissoudre 0,08 gramme de PS dans un rapport de volume de un pour un de THF à diméthylformamide et utiliser un régent liquide pour porter le volume jusqu’au millilitre final de huit pour cent de poids par volume de solution de PS.

Dissoudre 0,1 gramme de GT dans de l’eau, de l’acide acide et de l’acétate d’éthyle et utiliser la solution de solvant mixte pour porter le volume final à un millilitre de 10 pour cent en poids par volume de solution GT. Ensuite, à l’aide d’une machine à pulvérisation magnétron, déposez une couche de platine de cinq nanomètres d’épaisseur sur une plaque de base en polystyrène qui sert de cathode dans la configuration d’électro-filage. Chargez chaque solution polymère dans une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille émoussée en acier inoxydable de calibre 23.

Ancrez ensuite les seringues sur une pompe à seringue à 12 centimètres du collecteur de l’appareil d’électro-filage. Connectez l’aiguille de la seringue à une alimentation haute tension et réglez-la sur 11 kilovolts. Ensuite, réglez le taux de pompage à 20 millilitres par heure et maintenez la température et l’humidité à 30 degrés Celsius et à moins de 30 % en volume, respectivement.

Placez maintenant le masque sur la plaque de base. Ensuite, à travers les trous du masque, fabriquez des nanofibres sur la plaque de base avec des densités distinctes en modifiant le temps d’électro-filage. Retirez le masque de la plaque de base et répétez la fabrication de nanofibres.

Lorsque le réseau est terminé, placez-le dans un dessiccateur à 25 degrés Celsius pendant 16 heures pour évaporer le solvant restant. Pour réticuler les nanofibres GT, traitez-les avec 0,2 molaire EDC et 0,2 molaire NHS dans de l’éthanol. Et incubez les échantillons à 25 degrés Celsius pendant quatre heures.

Pour rincer les nanofibres GT, utilisez deux fois de l’éthanol à 99,5 % et séchez les plaques sous vide à 25 degrés Celsius pendant 16 heures. Pour fabriquer des structures microfluidiques, mélangez 2 grammes d’agent de durcissement PDMS et 20 grammes de base PDMS. Versez ensuite le mélange pré-PDMS dans le moule fabriqué.

Dans un dessiccateur, dégazez le mélange pré PDMS pendant 30 minutes. Ensuite, durcissez le mélange pré PDMS dans un four à 65 degrés Celsius pendant 16 heures. Pour assembler les réseaux Macme, décollez la structure PDMS durcie du moule et utilisez 70 % d’éthanol pour la nettoyer.

Déchargez ensuite la couronne atmosphérique sur la face inférieure de la structure PDMS. Assemblez rapidement la structure PDMS avec le réseau de nanofibres. Ensuite, faites cuire l’ensemble au four à 65 degrés Celsius pendant deux jours.

À l’aide de DPBS, laver les H9HESC cultivés sur un plat de 35 millimètres. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de trypsine légère protéase recombinante dans le plat et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant une minute. Aspirez soigneusement le mélange de protéase surnageant.

Ajoutez immédiatement le milieu HPSC et distribuez doucement le milieu contre la surface de la parabole à plusieurs reprises pour dissocier les cellules. Transférez ensuite les cellules détachées dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 200 fois la gravité pendant trois minutes.

Aspirez le surnageant et suspendez les cellules dans un milieu HPSC préchauffé. Ensuite, pipetez 12 microlitres de suspension cellulaire dans chaque chambre microfluidique. Après avoir marqué les cellules par fluorescence selon le protocole de texte, décollez la structure microfluidique PDMS du réseau Macme.

Ensuite, retirez le PBMS résiduel de la matrice Macme, ajoutez 90 pour cent de glycérol dans le PBS aux cellules colorées et appliquez une lamelle. Enfin, placez la plaque à l’envers sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée. Et utilisez le logiciel d’imagerie microscope pour acquérir des images couleur 12 bits.

On voit ici des images d’immunofluorescence de H9HPSC cultivées à haute densité d’ensemencement initial sur des nanofibres de gélatine et colorées avec 3 marqueurs phénotypiques cellulaires. L’analyse SOM a été utilisée pour convertir des ensembles de données multiparamétriques de grande dimension en cartes 2D de faible dimension afin de comparer l’homogénéité et l’hétérogénéité des niveaux d’expression pour les quatre marqueurs phénotypiques de chaque ensemble de données, et un regroupement hiérarchique non supervisé a été effectué pour les nœuds SOM. Comme indiqué ici, tous les groupes ont présenté une expression plus élevée d’OCT4 que celle observée sur la matrice de gel de la membrane basale, ou MG. Le premier groupe a montré des signaux EdU élevés, indiquant que la plupart des cellules proliféraient activement.

Ainsi, les microenvironnements du premier groupe étaient adaptés à la maintenance des HPSC, car les HPSC indifférenciés prolifèrent rapidement lorsque les phases d’écart du cycle cellulaire sont raccourcies. Le deuxième groupe comprenait des cellules ensemencées à une densité initiale insuffisante et des cellules cultivées sur des échafaudages GT 2D qui ne supportaient pas l’auto-renouvellement HPSC. Par exemple, le signal EdU de cet échantillon a été perdu et les niveaux d’annexine V ont légèrement augmenté, indiquant que les cellules avaient perdu leur souche et étaient progressivement devenues apoptotiques.

PMGI MidNF HighCD du groupe trois, qui représente les microenvironnements comprenant les matrices de nanofibres PMGI, a montré les plus grandes variations des signaux OCT4 et EdU par rapport aux autres conditions. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cellules STEM pour explorer l’ingénierie tissulaire et le dépistage avancé.