Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

L'objectif général de cette plateforme de microréseau cellulaire est de corréler les mesures de la différenciation cellulaire et des forces de traction en fonction du contexte microenvironnemental. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire, permettant à la fois des études fondamentales en biologie des cellules souches et l'optimisation de protocoles de différenciation. Les principaux avantages de cette technique incluent son débit, sa capacité à faire varier les indices biochimiques et biomécaniques, ainsi que ses lectures finales par immunofluorescence et microscopie de forces de traction, ou TFM.

Bien que ces méthodes aient été utilisées, celles-ci pouvant être facilement appliquées à d'autres types cellulaires artériels et contextes tissulaires pour les chercheurs comprenant la différenciation des progéniteurs hépatiques. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la réussite expérimentale dépend de l'intégration du protocole de disposition avec des substrats hydrogels de haute qualité et la microscopie de force de traction. Pour fabriquer des hydrogels de polyacrylamide contenant des billes fluorescentes sur une boîte de Pétri de 35 mm à fond en verre silanisé afin d'évaluer en temps réel les interactions cellules-substrat à l'aide de la MFT, préparez d'abord les substrats en verre dans des solutions comme décrit dans le protocole textuel.

Placer des boîtes de Pétri de 35 mm à fond en verre silanisé dans un plateau de séchage en verre et pipeter 20 microlitres de solution de prépolymère à initiateur photochimique dans un rapport 9:1 au centre de chaque boîte. Recouvrir délicatement chaque boîte d’un couvre-objet circulaire de 12 mm en évitant la formation de bulles. Afin de répartir les billes fluorescentes à la surface de l’hydrogel, retourner les boîtes et les laisser à température ambiante pendant 20 minutes.

En maintenant toujours la boîte en position inversée, exposez-la à une lumière UVA de 365 nanomètres pendant 10 minutes. Ajustez le temps de polymérisation selon les besoins. Ensuite, immergez les hydrogels dans un tampon HEPES 1 M et laissez-les à température ambiante à l’abri de la lumière toute la nuit.

Retirer délicatement les lamelles avec un rasoir, en prenant soin de ne pas endommager les hydrogels polymérisés. Déshydrater les hydrogels à 50 degrés Celsius sur un bloc chauffant jusqu'à complète dessiccation. Les hydrogels peuvent être conservés à température ambiante à l'abri de la lumière pendant trois mois.

Préparez les tampons pour imprimer les biomolécules et pour la plaque source comme décrit dans le protocole écrit. Après avoir chargé les pointes propres comme indiqué dans le protocole écrit, préparez le microdispenseur et programmez-le à l’aide du logiciel du fabricant. Ensuite, allumez l’unité d’humidification.

Régler le point de consigne à 65 % d'humidité relative et attendre que le rhéomètre atteigne ce point de consigne. Placer la plaque source dans l'adaptateur approprié. Puis insérer les substrats hydrogels déshydratés dans l'adaptateur adéquat.

Régler les paramètres du programme afin de refléter précisément la configuration de la plaque source, la conception du réseau et le format souhaité. Démarrer la fabrication du réseau. Vérifier au moins une fois par heure que l'humidité relative n'est pas descendue en dessous de 65 % et que les pointes ne sont pas obstruées.

Si l'humidité a chuté de manière inattendue, interrompez le pipetage pour remplir l'humidificateur et évacuer la condensation des tubes associés. Si les pointes sont bouchées, interrompez le pipetage pour nettoyer les pointes ou les remplacer par des pointes préalablement nettoyées. Une fois le programme terminé, placez les matrices fabriquées dans une boîte à lames ou dans une microplaque recouverte de papier d'aluminium.

Laisser les puces à température ambiante et à 65 % d'humidité relative pendant la nuit. Selon notre expérience, les difficultés les plus fréquentes sont liées à la fabrication des puces. Nous recommandons de vérifier la qualité technique et la robustesse des puces fabriquées à l'aide de molécules marquées au fluorochrome, de colorations générales des protéines et d'immunofluorescences.

Le jour suivant la fabrication, immergez le réseau dans des boîtes de Pétri de 35 mm contenant 3 mL de pénicilline-streptomycine à 1 % volume par volume dans du PVS. Exposez les substrats disposés en réseau à la lumière UVC pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez la solution de pénicilline-streptomycine par du milieu de culture cellulaire.

Après avoir collecté et compté les cellules, ensemencez-les sur les matrices à raison de 3 mL par boîte de Pétri de 35 mm. Incubez les cultures sur matrices à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant deux à 24 heures, ou jusqu'à la formation d'îlots cellulaires bien peuplés. La densité d'ensemencement et la durée peuvent être ajustées en fonction des cellules et de l'application spécifique.

Après avoir permis la formation d'îlots cellulaires, laver les cultures sur puces deux fois avec 3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé. À ce stade, les contrôles appropriés et les traitements d'intérêt peuvent être ajoutés au système biologique. Changer le milieu des puces tous les un à deux jours afin de maintenir la concentration des traitements éventuels.

Entre un et cinq jours après l'initiation des cultures sur réseau, effectuez une évaluation en temps réel des interactions entre les cellules et le substrat à l'aide de la microscopie de force tractionnelle (TFM). Transférez les boîtes de Pétri de 35 mm contenant les cultures sur réseau vers un microscope fluorescent inversé équipé d'une chambre d'incubation et d'un plateau robotisé pour les mesures de TFM. Dans une boîte, repérez les positions et les plans de focalisation des îlots cellulaires individuels à l'aide de la microscopie en contraste de phase.

Passez à la microscopie de fluorescence en lumière rouge éloignée pour visualiser les billes. Ensuite, retournez à chacune des positions enregistrées à l'étape précédente et corrigez la coordonnée z du plan de mise au point, de sorte que seule la première couche de billes située sous l'îlot cellulaire soit nette. Enregistrez les nouvelles coordonnées et passez à l'acquisition automatisée d'images de tous les îlots cellulaires afin de capturer les images de contraste de phase et de fluorescence en lumière rouge éloignée préalables à la dissociation.

Ensuite, ajoutez soigneusement 150 microlitres de solution BSA/SDS dans la boîte et attendez cinq minutes pour permettre une dissociation complète des cellules du substrat. Surveillez la dissociation cellulaire à l’aide de la microscopie en contraste de phase. Une fois que les îlots cellulaires ont été dissociés du substrat, retournez aux positions marquées et vérifiez que la première couche de billes est toujours au point.

Si ces billes sont hors du plan en raison d'une déformation induite par la traction générée par la cellule, corrigez la coordonnée z du plan focalisé afin qu'elles soient à nouveau au point. Enregistrez les coordonnées z corrigées et répétez l'acquisition d'images automatisée de toutes les îlots pour capturer les images fluorescentes en rouge éloigné après dissociation. Répétez ces étapes pour les autres boîtes.

Les ligands de la voie Notch conjugués à la protéine A/G, jagged un et delta comme un, ont montré une rétention améliorée dans les hydrogels. La présentation des ligands de la voie Notch a également induit la différenciation de progéniteurs hépatiques vers un destin de cellule de canal biliaire, comme en témoigne la présence du marqueur vert des cellules des canaux biliaires. La réponse aux ligands de la voie Notch a été quantifiée pour cinq protéines de la matrice extracellulaire, ou MEC, et a montré que la réponse des progéniteurs hépatiques aux ligands dépend du contexte de la MEC.

L'ARNi en épingle à cheveux a été utilisée pour générer des progéniteurs dépourvus des ligands delta comme un et jagged un. Les cellules ont ensuite été exposées aux ligands notch jagged un, delta comme un et delta comme quatre. La réponse au ligand notch disposé en réseau variait selon l'expression intrinsèque de l'un ou l'autre ligand dans la cellule.

Ces images montrent la différenciation des progéniteurs hépatiques dépendant à la fois de la rigidité du substrat et de la composition de la MEC. Une analyse quantitative a révélé que le collagène IV favorise la différenciation sur des substrats mous comme rigides, tandis que la fibronectine ne soutient la différenciation que sur des substrats rigides. Des cartes thermiques représentatives suggèrent qu'une contrainte de traction prolongée à faible rigidité du substrat sur le collagène IV favorise la différenciation en cellules des canaux biliaires.

Cette observation a été confirmée par la quantification des valeurs moyennes quadratiques moyennes des contraintes de traction. Cette vidéo et le protocole associé ont décrit les étapes principales pour la fabrication de gels hydrogels et de réseaux afin de réaliser des cultures cellulaires sur des substrats en réseau et pour mesurer les interactions cellules-substrat à l'aide de la microscopie des forces de traction. Une fois les techniques maîtrisées, chaque expérience peut être réalisée en aussi peu qu'une à deux semaines si elle est effectuée correctement.

Contrairement à cette méthode, les cultures cellulaires doivent être utilisées pour valider les conditions performantes du tableau à l’aide de PCR qualitative, de transfert immunoblot, d’axes mécanobiologiques à l’échelle standard ou d’autres techniques complémentaires de biologie moléculaire. Cette plateforme polyvalente peut être appliquée à l’analyse à haut débit des fonctions cellulaires dans un large éventail de contextes cellulaires et tissulaires, notamment la différenciation des cellules souches et la biologie des cellules cancéreuses.