Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

L’objectif global de cette plateforme de microréseaux cellulaires est de corréler les mesures de la différenciation cellulaire et des forces de traction en fonction du contexte microenvironnemental. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, permettant à la fois des investigations fondamentales de la biologie des cellules souches et l’optimisation des protocoles de différenciation. Les principaux avantages de cette technique comprennent son débit, sa capacité à faire varier les signaux biochimiques et biophysiques et les lectures des points finaux par immunofluorescences et par microscopie à force de traction, ou TFM.

Bien qu’ils aient utilisé ces méthodes, ceux qui comprennent la différenciation des progéniteurs hépatiques peuvent être facilement appliqués à d’autres types de cellules artérielles et contextes tissulaires. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le succès de l’expérience dépend de l’intégration du protocole de mise en réseau avec des substrats d’hydrogel de haute qualité et la microscopie à force de traction. Pour fabriquer une bille fluorescente contenant des hydrogels de polyacrylamide sur une boîte de Pétri à fond de verre silanisé de 35 mm pour l’évaluation en direct des interactions entre substrats cellulaires à l’aide de la TFM, il faut d’abord préparer des substrats de verre dans des solutions comme décrit dans le protocole de texte.

Placez des boîtes de Pétri à fond en verre silanisé de 35 mm dans un plateau de séchage en verre et pipetez 20 microlitres de perle de prépolymère 9 pour 1 dans une solution photo-initiatrice au centre de chaque plat. Recouvrez délicatement chaque plat d’une lamelle circulaire de 12 mm tout en évitant la création de bulles. Afin de répartir les billes fluorescentes à la surface de l’hydrogel, retournez les plats et laissez-les à température ambiante pendant 20 minutes.

Toujours inversé, exposez le plat à 365 nanomètres UVA pendant 10 minutes. Optimisez le temps de polymérisation au besoin. Ensuite, plongez les hydrogels dans 1 tampon HEPES molaire et laissez-les à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit.

Retirez soigneusement les lamelles à l’aide d’un rasoir, en prenant soin de ne pas endommager les hydrogels polymérisés. Déshydratez les hydrogels à 50 degrés Celsius sur une plaque chauffante jusqu’à ce qu’ils soient secs. Les hydrogels peuvent être conservés à température ambiante dans l’obscurité pendant trois mois.

Préparez des tampons pour imprimer les biomolécules et pour la plaque source comme décrit dans le protocole texte. Après avoir chargé les broches propres comme décrit dans le protocole texte, préparez le microarrayer et programmez-le à l’aide du logiciel du fabricant. Ensuite, allumez l’humidificateur.

Réglez le point de consigne à 65 % d’humidité relative et attendez que le rhéomètre corresponde au point de consigne. Placez la plaque source dans l’adaptateur approprié. Placez ensuite les substrats d’hydrogel déshydratés dans l’adaptateur approprié.

Ajustez les paramètres du programme pour refléter avec précision la disposition de la plaque source, la conception du réseau et le format souhaité. Lancez la fabrication du réseau. Vérifiez au moins une fois par heure que l’humidité n’est pas descendue en dessous de 65 % d’humidité relative et que les broches ne sont pas bouchées.

Si l’humidité a chuté de manière inattendue, faites une pause pour remplir l’humidificateur et dégagez les tubes associés de la condensation. Si les broches sont bouchées, interrompez le réseau pour nettoyer les broches ou remplacez-les par des broches pré-nettoyées. Une fois le programme terminé, placez les réseaux fabriqués dans une boîte à diapositives ou une microplaque recouverte de papier d’aluminium.

Laissez les matrices à température ambiante à 65 % d’humidité relative pendant la nuit. D’après notre expérience, les difficultés les plus courantes sont liées à la fabrication de réseaux. Nous recommandons de confirmer la qualité technique et la robustesse des réseaux fabriqués à l’aide de molécules marquées par fluorescence, de colorants protéiques généraux et d’immunofluorescences.

Le lendemain de la fabrication, immerger les boîtes de Pétri de 35 mm dans 3 ml de pénicilline-streptomycine à 1 % de volume par volume de PVS. Exposez les substrats en réseau dans UVC pendant 30 minutes. Remplacez ensuite la solution de pénicilline-streptomycine par un milieu de culture cellulaire.

Après avoir recueilli et compté les cellules, ensemencez-les dans des matrices à raison de 3 mL par boîte de Pétri de 35 mm. Incuber les cultures en réseau à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant deux à 24 heures, ou jusqu’à la formation d’îlots cellulaires bien peuplés. La densité et le temps de semis peuvent être ajustés en fonction des cellules et de l’application particulière.

Après avoir permis la formation d’îlots cellulaires, laver les cultures en réseau deux fois avec 3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé. À ce stade, les contrôles et les traitements d’intérêt appropriés peuvent être ajoutés au système biologique. Changez le média des matrices tous les un à deux jours pour maintenir la concentration de tous les traitements.

Dans les cinq jours suivant le lancement des cultures en réseau, effectuez une évaluation en direct des interactions entre les substrats cellulaires à l’aide de la TFM. Déplacez les boîtes de Pétri de 35 mm contenant les cultures en réseau vers un microscope à fluorescence inversée incubé avec une platine robotisée pour les mesures TFM. Dans une boîte, marquez les positions et les plans de mise au point de chaque îlot cellulaire à l’aide de la microscopie à contraste de phase.

Passez à la microscopie fluorescente rouge lointain pour visualiser les billes. Revenez ensuite à chacune des positions enregistrées à l’étape précédente et corrigez la coordonnée z du plan de mise au point, de sorte que seule la première couche de billes sous l’îlot de cellule soit nette. Enregistrez les nouvelles coordonnées et procédez à l’imagerie automatisée de tous les îlots cellulaires pour capturer le contraste de phase de pré-dissociation et les images fluorescentes rouge lointain

Ensuite, ajoutez soigneusement 150 microlitres de solution BSA/SDS dans la boîte et attendez cinq minutes pour permettre une dissociation complète de la cellule du substrat. Surveiller la dissociation cellulaire à l’aide de la microscopie à contraste de phase. Une fois les îlots cellulaires dissociés du substrat, revenez aux positions marquées et vérifiez que la première couche de billes est toujours nette.

Si ces billes sont hors plan en raison d’une déformation induite par la traction générée par la cellule, corrigez la coordonnée z du plan focalisé afin qu’elles soient à nouveau nettes. Enregistrez les coordonnées z corrigées et répétez l’imagerie automatisée de toutes les îles pour capturer les images fluorescentes rouge lointain post-dissociation. Répétez ces étapes pour les plats restants.

Les ligands d’encoche conjugués aux protéines A/G ont montré une meilleure rétention dans les hydrogels. La présentation du ligand de l’encoche a également conduit à la différenciation des progéniteurs hépatiques vers un destin cellulaire des voies biliaires, comme l’indique la présence du marqueur des cellules des voies biliaires vertes. La réponse aux ligands de l’encoche a été quantifiée pour cinq protéines de la matrice extracellulaire, ou ECM, et a montré que la réponse des progéniteurs hépatiques aux ligands dépend du contexte de la ECM.

Un petit knockdown d’ARN en épingle à cheveux a été utilisé pour générer des progéniteurs sans les ligands delta comme un et déchiquetés. Les cellules ont ensuite été présentées avec les ligands de l’encoche déchiquetés un et delta comme un et delta comme quatre. La réponse au ligand à encoche en réseau variait en fonction de l’expression intrinsèque de la cellule de l’un ou l’autre ligand.

Ces images montrent que la différenciation des progéniteurs hépatiques dépend à la fois de la rigidité du substrat et de la composition de l’ECM. L’analyse quantitative a révélé que le collagène quatre favorise la différenciation sur les substrats mous et rigides, tandis que la fibronectine ne soutient la différenciation que sur les substrats rigides. Les cartes thermiques représentatives suggèrent qu’un stress de traction soutenu à une faible rigidité du substrat sur le collagène quatre favorise la différenciation en cellules des canaux biliaires.

Ce résultat a été confirmé par la quantification des valeurs quadratiques moyennes de la contrainte de traction. Cette vidéo et le protocole qui l’accompagne ont fourni les principales étapes de la fabrication d’hydrogels et de réseaux pour effectuer la culture cellulaire sur les substrats en réseau et pour mesurer les interactions entre les substrats cellulaires à l’aide de la microscopie à force de traction. Une fois familiarisé avec les techniques, chaque expérience peut être terminée en aussi peu qu’une à deux semaines si elle est effectuée correctement.

En plus de cette méthode, les cultures cellulaires doivent être utilisées pour valider les conditions de puce à score élevé en utilisant la PCR qualitative, l’immuno-blot, les axes de mécanobiologie à l’échelle standard ou d’autres techniques complémentaires de biologie moléculaire. Cette plateforme polyvalente peut être appliquée à l’étude à haut débit des fonctions cellulaires dans un grand nombre de contextes cellulaires et tissulaires, y compris la différenciation des cellules souches et la biologie des cellules cancéreuses.