À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

L’objectif global de cette procédure est de créer un réseau de protéines modulaire qui ne nécessite pas d’étape de purification, ce qui le rend compatible avec n’importe quelle bibliothèque de protéines. Ceci est accompli en générant d’abord des gènes synthétiques par PCR d’assemblage. Ensuite, les gènes synthétiques sont disposés sur des lames d’époxy.

Pour fabriquer le dispositif microfluidique, utilisez PDMS avec des moules de contrôle et d’écoulement en silicone. Ensuite, le dispositif microfluidique est aligné sur le réseau d’ADN tacheté. Enfin, le lysat de réticulocytes de lapin est acheminé dans le dispositif microfluidique et les protéines sont exprimées.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’expression de milliers de protéines par marquage par anticorps fluorescents. L’utilisation de la technique basée sur la microfluidique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes telles que les microréseaux de protéines. Nous microréseaux d’ADN, puis nous utilisons cellis pour fabriquer des protéines sur l’appareil.

Ainsi, nous n’avons pas besoin de purification des protéines et les protéines ne sèchent jamais. Ils restent frais tout au long de l’expérience. La technique microfluidique offre également une sensibilité plus élevée Pour fabriquer le dispositif microfluidique, exposez les moules de contrôle et d’écoulement en silicone à la vapeur de chloro triméthyl silène pendant 10 minutes pour favoriser la libération d’élastomère.

Après les étapes de cuisson, préparez un mélange d’élastomère à base de silicone et d’agent de durcissement dans deux rapports différents de cinq pour un et 20 pour un pour les moules de contrôle et d’écoulement respectivement. Versez le PDMS cinq contre un sur la couche de contrôle. Dégazez la couche de contrôle et faites-la cuire pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius.

Ensuite, enduisez le mélange PDMS à 20 pour un sur la couche d’écoulement à 2, 600 tr/min pendant 60 secondes, puis faites-le cuire à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Séparez lentement la couche de contrôle du moule, en faisant attention de ne pas décoller le motif SU huit. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, découpez l’appareil sur son pourtour et utilisez une aiguille émoussée pour percer des trous afin d’accéder aux canaux de contrôle sous un microscope.

Alignez manuellement les couches d’écoulement et de contrôle en commençant par le coin supérieur gauche et en positionnant la vanne à bouton sur la couche de contrôle au milieu de la chambre de réaction. Ensuite, alignez la première rangée et relâchez doucement la couche de contrôle rangée par rangée. Assurez-vous que toutes les vannes à bouton se trouvent au milieu des chambres de réaction et que les vannes d’adresse et d’entrée traversent les canaux d’écoulement à la bonne position.

Répétez le processus localement jusqu’à ce que toutes les rangées soient alignées. Lorsqu’il est complètement aligné, relâchez toute tension dans le PDMS en le soulevant avec précaution des côtés et des coins. Faites ensuite cuire l’appareil pendant deux heures à 80 degrés Celsius après la cuisson.

Coupez autour du périmètre et décollez le dispositif à deux couches des trous de perforation du moule d’écoulement pour accéder aux canaux d’écoulement afin de générer des constructions d’ADN pour le dispositif. Effectuer une PCR pour produire des gènes synthétiques composés d’un promoteur T sept, d’un site de liaison du ribosome, d’un cadre de lecture ouvert avec différentes étiquettes d’épitopes à chaque extrémité et d’un terminateur T sept. Pour préparer les gènes synthétiques à la mise en réseau, faites un mélange de polyéthylène glycol et de D triose dihydraté Distribuez deux microlitres par réaction dans les puits d’un 384.

Assiette de puits. Ajoutez les gènes synthétiques dans une plaque à 384 puits. Ajoutez ensuite de l’eau distillée jusqu’à un volume final de 20 microlitres.

Ensuite, à l’aide d’un spot de microréseau, une série de gènes synthétiques sur des substrats de verre revêtus d’époxy. Sous un stéréoscope, alignez manuellement le dispositif microfluidique sur le réseau de gènes avec la tache d’ADN positionnée au milieu des chambres d’ADN. Alignez ensuite le reste des rangs.

Finalement, l’ensemble de l’appareil est réglé avec précision afin d’alléger toute contrainte sur le PDMS et de s’assurer qu’il adhère bien à la puce à électricité. Levez-le localement. Enfin, collez l’appareil à la lame de verre en l’incubant pendant la nuit sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius.

Les colorants alimentaires sont utilisés dans cette section à des fins de visualisation. Les vannes de la couche de contrôle sont actionnées à partir de l’ordinateur à l’aide de la vue laboratoire. Le script de vue de laboratoire contrôle une série de microvannes électromagnétiques via un boîtier de commande électronique.

Le collecteur d’électrovanne est connecté à l’air comprimé, qui contrôle le débit d’air et la pression dans les vannes de régulation de l’appareil. À l’aide d’un tube en plastique flexible d’un diamètre intérieur de 0,02 pouce et d’une goupille en acier inoxydable, connectez l’appareil au collecteur d’électrovannes. Remplissez les tubes avec de l’eau distillée deux fois et insérez la goupille dans les trous d’accès de la couche de contrôle.

Assurez-vous que chaque tube est connecté à son canal de commande correspondant. Pour activer les canaux de contrôle, exécutez l’application lab view, réglez la pression atmosphérique sur cinq PS. J’applique ensuite une pression d’air en activant la vanne à partir du script de la vue laboratoire. Cela poussera l’eau dans les canaux de contrôle PDMS pour identifier la diaphonie potentielle entre les canaux de contrôle des appareils défectueux.

Remplissez d’abord le sandwich et les vannes d’adressage. Après tout, les canaux de régulation et les vannes sont pleins d’eau, amorcez les vannes pour bloquer les canaux d’écoulement en dessous. En augmentant d’abord la pression d’air à 15 PSI, puis dans le programme de vue en laboratoire grâce à un ensemble d’interrupteurs de marche et d’arrêt connectés à des électrovannes individuelles.

Activez toutes les vannes en activant tous les boutons de l’interrupteur pour vous assurer que toutes les vannes sont ouvertes. Connectez un tube à l’une des entrées de débit et, à quatre à cinq PSI, faites circuler de l’air dans l’appareil. Cela libérera toutes les vannes collantes de la glissière de verre.

L’appareil est maintenant amorcé et prêt pour la visualisation. Le colorant alimentaire jaune est utilisé pour visualiser les réactifs dans cette section et la solution incolore représente les hippies pour faciliter l’auto-assemblage d’un réseau de protéines à la surface et empêcher l’absorption non spécifique dans le dispositif microfluidique, modifier chimiquement la surface en connectant d’abord un nouveau tube avec la solution requise à l’un des canaux d’écoulement du dispositif. Connectez ensuite le côté libre du tube au collecteur manuel et ouvrez le flux de pression d’air.

Chargez 40 microlitres de BSA exalté en biotine dans un nouveau tube et faites-en passer environ la moitié à travers l’appareil pendant 20 minutes. Utilisez des hippies de 50 millimolaires pour éliminer tout substrat non réactif entre chacune des étapes. Ensuite, versez 25 microlitres de streptavidine pendant 20 minutes.

En plus de la biotine exaltée BSA, lavez-la avec des hees pendant cinq minutes pour manger la surface entourant le bouton, fermez la valve à bouton et versez le reste de la BSA biotinylée, puis lavez à nouveau avec le pois pendant cinq minutes. Enfin, pour créer un réseau d’étiquettes anti-sifflement sous le bouton, relâchez la valve à bouton et versez 30 microlitres de biotine Penta Hiss pendant 20 minutes pour créer un réseau de protéines sur l’appareil. Ouvrez les valves du cou et faites couler le réticulocyte de lapin.

Solution de réaction de transcription et de traduction à couplage rapide à travers l’appareil dans la chambre d’ADN. Ensuite, fermez les vannes sandwich pour séparer chaque gène de son environnement et incubez l’appareil sur une plaque chauffante pendant 2,5 heures à 30 degrés Celsius. Marquez ensuite l’extrémité terminale des protéines avec l’anticorps C mix SI trois.

Enfin, à l’aide d’un scanner à microréseaux avec un laser de 532 nanomètres et un filtre d’émission de 575 nanomètres. Déterminez les niveaux de protéines. Cette figure montre les différents niveaux d’expression des protéines sur un réseau de protéines.

Habituellement, 20 % d’une bibliothèque de gènes ne parvient pas à s’exprimer à des niveaux détectables. Les niveaux de fond ont été déterminés à l’aide de chambres qui n’ont pas été repérées avec de l’ADN. Ainsi, les signaux provenant des chambres protéiques correspondantes sont dus soit au bruit, soit à l’absorption non spécifique des anticorps de marquage.

Si elle est effectuée correctement, la vérification de l’appareil prend quatre heures et l’expérience de la puce cinq heures.