Une méthode rapide et Quantitative pour Modification post-traductionnelle et variante compatible cartographie des Peptides aux génomes

L’objectif global de ce protocole logiciel est de démontrer l’utilisation de PoGo pour cartographier les peptides avec les modifications post-traductionnelles associées et les informations quantitatives provenant d’expériences de spectrométrie de masse pour référencer les génomes et permettre l’intégration et la visualisation avec des données génomiques orthogonales. Cet outil peut aider à ajouter des informations génomiques aux listes de peptides générées par les recherches protéomiques par spectrométrie de masse, de sorte que l’intégration avec les données de séquençage de l’ARN peut être facilitée. Le principal avantage de cet outil est qu’il est simple à utiliser, rapide et qu’il prend en charge des informations supplémentaires telles que les modifications post-traductionnelles, la quantification et la variance des acides aminés.

Pour commencer, téléchargez et installez le logiciel présenté dans cette vidéo, comme décrit dans le protocole texte ci-joint. Une fois installé, accédez au dossier des exécutables de l’interface graphique PoGo et démarrez le programme en double-cliquant sur l’icône de l’interface graphique PoGo. Utilisez le bouton de sélection à côté de l’exécutable PoGo.

Ensuite, naviguez dans le dossier exécutables jusqu’au sous-dossier du système d’exploitation approprié et sélectionnez le fichier PoGo exécutable. Confirmez sa sélection en cliquant sur le bouton d’ouverture. Ensuite, sélectionnez le fichier d’entrée de référence pour les séquences de protéines en cliquant sur Sélectionner.

Accédez au dossier data et sélectionnez le fichier translation fast day. Confirmez sa sélection en cliquant sur Ouvrir. Sélectionnez le fichier d’annotation de transcription à l’aide du bouton de sélection.

Naviguez ensuite vers le dossier data, sélectionnez le fichier GTF d’annotation et cliquez sur ouvrir. Ajoutez le fichier d’identification du peptide à l’aide du bouton Ajouter à côté des fichiers de peptides. Ici, sélectionnez le fichier au format pris en charge MZ Tab, MZ Ident ML ou MZ ID, ou au format à quatre colonnes séparées par des tabulations.

De plus, décochez les cases à côté de BED NGTF dans la sélection du format de sortie. Ne laissez que PTM BED et GCT cochés. Sélectionnez ensuite l’espèce appropriée pour les données dans la sélection déroulante et lancez la cartographie en cliquant sur Démarrer.

Tout d’abord, chargez le fichier de sortie PoGo se terminant par _ptm. lit dans la visionneuse de génomique intégrative. Répétez l’opération pour charger également le fichier se terminant par _noptm.bed.

Ce fichier contient tous les peptides trouvés sans aucune modification. Réorganisez les pistes en les faisant glisser et en les déposant à la position souhaitée dans la liste. Chaque fichier sera affiché sous forme de pistes distinctes avec le nom du fichier identifiant la piste.

Chaque piste est initialement affichée de manière réduite. Pour les développer, faites un clic droit sur le nom de la piste et sélectionnez développé pour une vue complète des peptides, y compris les séquences. Chargez maintenant le fichier se terminant par gct.

Ce fichier contient les informations de quantification des peptides. Contrairement aux fichiers précédemment chargés, chaque échantillon annoté sera chargé en tant que piste distincte. Réorganisez les échantillons à l’aide d’opérations de glisser-déposer.

Naviguez dans le génome en sélectionnant un chromosome dans le menu déroulant, en cliquant et en maintenant une section d’un chromosome sur laquelle zoomer ou en tapant les coordonnées génomiques. Le mappage PoGo peut être effectué à l’aide de l’interface utilisateur graphique ou de l’interface de ligne de commande. Dans cette partie du protocole, l’interface de ligne de commande est utilisée pour mettre en évidence l’interchangeabilité.

Afin de mapper les peptides variants obtenus par les étapes précédentes du protocole texte au génome de référence, ouvrez une invite de commande et naviguez jusqu’au dossier des exécutables de PoGo. Tapez ensuite la commande indiquée ici. Confirmez l’exécution en appuyant sur la touche Entrée et attendez qu’elle soit terminée avant de continuer.

Visualisez les peptides cartographiés sans discordance et avec discordance dans le visualiseur de génomique intégrative. Dans le logiciel d’interface utilisateur graphique PoGo, ajoutez les fichiers d’identification des peptides à l’aide du bouton Ajouter à côté des fichiers peptidiques et sélectionnez un ou plusieurs fichiers ainsi que glissez-déposez dans le champ vide sous les fichiers peptidiques. Décochez ensuite les cases à côté de PTM BED, GTF et GCT dans la section du format de sortie et ne laissez BED coché que dans la case.

De plus, sélectionnez l’option Fusionner plusieurs fichiers d’entrée en une seule sortie. Cela se traduira par un seul fichier de sortie combinant tous les peptides des fichiers d’entrée. Si vous ne sélectionnez pas cette option, le programme sera exécuté de manière séquentielle pour chaque fichier d’entrée séparément.

Ensuite, sélectionnez l’espèce appropriée pour les données dans la liste déroulante qui est cohérente avec les fichiers NGTF de jour rapide. Une fois sélectionné, lancez le mappage en cliquant sur le bouton de démarrage. Pour générer un moyeu de suivi à partir de peptides mappés, ouvrez une fenêtre de terminal et tapez la commande suivante dans l’invite de commande.

Confirmez l’exécution en appuyant sur la touche Entrée. L’exécution ne prendra que peu de temps pour se terminer. Une fois terminé, transférez le hub de suivi généré avec tout son contenu vers un serveur FTP accessible sur le Web ou GitHub.

Dans un navigateur Web, accédez au navigateur UCSC Genome et sélectionnez My Data Track Hubs. Cliquez ensuite sur l’onglet Mes Hubs. Copiez l’URL du hub de suivi dans le champ de texte, puis chargez le hub de suivi en cliquant sur Ajouter un hub.

Enfin, sélectionnez le navigateur du génome pour accéder à la vue du navigateur. Le moyeu de piste personnalisé sera affiché en haut de la liste. Si plusieurs fichiers BED ont construit la base du moyeu de piste, chacun des fichiers sera représenté comme une piste distincte dans le moyeu.

PoGo et deux autres outils de cartographie protéogénomique sont comparés ici pour leur utilisation globale de la mémoire et leur temps d’exécution analytique. PoGo surpasse considérablement les autres outils en termes de vitesse et de mémoire, et il est capable de cartographier les modifications post-traductionnelles et les informations quantitatives associées aux peptides sur le génome. PoGo utilise l’option de coloration pour fournir une aide visuelle facile en ce qui concerne l’unicité de la cartographie peptidique dans le génome.

Les mappages en rouge indiquent l’unicité d’un seul transcrit, tandis que les blocs mettent en évidence le mappage d’un seul gène. Les cartographies grises montrent des peptides partagés entre plusieurs gènes. L’option PTM BED de PoGo redéfinit le code couleur pour s’adapter à différents types de modifications post-traductionnelles, en indiquant l’emplacement de la modification avec un bloc épais au niveau du résidu d’acide aminé modifié.

Dans les données protéographiques présentées ici représentant celle du cancer colorectal, seuls deux peptides avaient été identifiés, chacun montrant une seule phosphorylation. Les informations contenues dans le fichier GCT de sortie fournissent des valeurs quantitatives pour les régions génomiques couvertes par les peptides. Les peptides s’étendant sur les jonctions d’épissage sont divisés en leurs parties sans se connecter.

Pour plus d’informations sur l’épissage, le fichier GTF de sortie est également requis. Une fois que les séquences et l’annotation de la protéine de référence sont téléchargées et configurées, des milliers de peptides peuvent être cartographiés sur les coordonnées génomiques en moins de cinq minutes sans permettre les incohérences de séquence. Lorsque vous tentez de cartographier des peptides sur des génomes de référence à l’aide de PoGo, il est important de ne pas oublier d’utiliser des séquences traduites de transcriptions codant pour des protéines et l’annotation de transcription associée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation de PoGo et de l’interface graphique PoGo pour cartographier les peptides des expériences de spectrométrie de masse protéomique avec les informations associées sur les génomes référencés et les visualiser.