Une stratégie d’enrichissement spin-tip pour l’analyse simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides des tissus pancréatiques humains

Les modifications post-traductionnelles (PTM) modifient les structures et les fonctions des protéines. Les méthodes d’enrichissement simultané de plusieurs types de PTM peuvent maximiser la couverture dans les analyses. Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie d’affinité métallique immobilisée Ti(IV) double fonctionnelle suivie d’une spectrométrie de masse pour l’enrichissement et l’analyse simultanés de la protéine N-glycosylation et de la phosphorylation dans les tissus pancréatiques.

La stratégie de chromatographie d’affinité des métaux immobilisés à double fonction titane peut enrichir à la fois les N-glycopeptides et les phosphopeptides dans le même flux de travail, augmentant ainsi les informations biomoléculaires provenant de la même analyse. Le principal avantage de cet enrichissement est deux mécanismes de séparation, qui permettent la séparation simultanée des N-glycopeptides et des phosphopeptides en fractions séparées pour l’analyse par spectrométrie de masse en aval. L’utilisation de cette méthode d’enrichissement peut améliorer la détection de la glycosylation et de la phosphorylation dans des échantillons biologiques complexes comme les tissus pancréatiques vers la découverte de biomarqueurs de maladies tels que le diabète et le cancer.

Étant donné que cette méthode repose sur les pointes de rotation et la centrifugation, il est important de contrôler la vitesse de centrifugation et de s’assurer que les échantillons sont exempts de particules pour éviter tout colmatage. Pour commencer, pré-refroidissez les parties du pulvérisateur tissulaire qui entreront en contact avec les tissus pancréatiques, à savoir la chambre, le pulvérisateur et la cuillère de récupération, ainsi que toutes les spatules, dans un récipient en polystyrène. Ensuite, transférez les morceaux de tissu dans le porte-échantillon pré-réfrigéré et ajoutez un azote liquide au tissu jusqu’à ce qu’ils soient congelés.

Après avoir placé le pulvérisateur dans la chambre, frappez-le à l’aide d’un maillet cinq à dix fois pour écraser l’échantillon, puis retirez le pulvérisateur de la chambre et grattez la poudre et les morceaux de tissu adhérents. Ensuite, ajoutez une cuillerée d’azote liquide dans la chambre si les tissus commencent à fondre, et répétez le processus de pulvérisation jusqu’à ce qu’une poudre fine soit obtenue et répartissez les échantillons en aliquotes d’environ 100 milligrammes dans des tubes pré-réfrigérés. Après avoir préparé le tampon de lyse, dissoudre un comprimé de protéase et d’inhibiteur de phosphatase dans 500 microlitres d’eau, pour un stock de 20 fois la concentration finale souhaitée, et ajouter le volume requis de stock de chaque inhibiteur au tampon de lyse pour atteindre les concentrations finales d’inhibiteur.

Après avoir ajouté 600 microlitres de tampon de lyse au tube, incuber à 95 degrés Celsius dans le bloc chauffant pendant 10 minutes en agitant à 800 tr / min, puis retirez les échantillons du bloc chauffant et laissez-les refroidir à température ambiante. Ensuite, soniquez les échantillons à une énergie de 60 watts pendant 45 secondes, en utilisant des impulsions de 15 secondes avec un repos de 30 secondes entre les deux, et abattez les échantillons à 3000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ajouter le surnageant à cinq fois son volume de solvant de précipitation.

Par exemple, 300 microlitres de tampon de lyse à 1,5 millilitre de solvant de précipitation contenant 50% d’acétone, 49,9% d’éthanol et 0,1% d’acide acétique, puis refroidir pendant la nuit à 80 degrés Celsius. Abattez à nouveau les échantillons à 3000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, et retirez le surnageant, puis lavez le granulé en le cassant avec une spatule et mélangez avec la même quantité de solvant de précipitation. Après la centrifugation, sécher à l’air libre l’échantillon de granulés dans une hotte pendant 15 minutes et conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à continuer.

Tout d’abord, remettez en suspension la pastille de protéine dans 300 microlitres de tampon de digestion fraîchement fabriqué contenant 50 millimolaires tampon de bicarbonate de triéthylammonium et huit molaires d’urée. À la protéine en solution, ajouter le dithiothréitol à une concentration finale de cinq millimolaires, mélanger et réduire à température ambiante pendant une heure, puis ajouter l’iodoacétamide à une concentration finale à 15 millimolaires. Mélanger et alkyler à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité.

Ensuite, ajoutez Lys-C / trypsine à un rapport enzyme-protéine de 1 à 100 et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant quatre heures, puis ajoutez un tampon de bicarbonate de triéthylammonium de 50 millimolaires pour diluer les huit molaires d’urée utilisées dans moins d’une molaire. Après avoir ajouté de la trypsine à un rapport enzyme-protéine de 1 à 100, incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant la nuit, puis éteindre la digestion avec l’ajout d’acide trifluoroacétique. Pour chaque milligramme de protéine de départ, conditionnez une cartouche de dessalement avec un millilitre d’acétonitrile et trois fois avec un millilitre d’acide trifluoroacétique à 0,1 %, puis chargez le mélange digéré sur la cartouche de dessalement et lavez le mélange trois fois en utilisant un millilitre d’acide trifluoroacétique à 0,1 %.

Ensuite, éluez les peptides en utilisant un millilitre de solution d’acide formonique à 60% d’acétonitrile et de 0,1%, puis des peptides élués à sec à environ 35 degrés Celsius à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide jusqu’à ce que le solvant se soit complètement évaporé. Après avoir remis les peptides en suspension dans l’eau, estimez les concentrations de peptides à l’aide d’un test peptidique selon le protocole du fabricant, puis divisez les peptides en aliquotes de 500 microgrammes et séchez complètement. Pesez environ trois milligrammes de coton et emballez-le dans une pointe d’essorage vide.

Après avoir transféré un gramme de matériau de chromatographie d’affinité métallique immobilisée en titane dans un tube, ajoutez 0,1% d’acide trifluoroacétique à une concentration connue de matériau. Après avoir ajouté suffisamment de boue à une pointe de spin pour transférer 20 milligrammes de matériau, lavez la pointe de spin en centrifugant avec 200 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1%. Remettez les échantillons en suspension dans 200 microlitres de solvant de chargement/lavage et circulez à travers la pointe de rotation.

Après avoir lavé la pointe de spin par centrifugation avec un solvant de chargement / lavage, lavez la pointe de spin avec 200 microlitres de solution d’acide formique 0,1 acétonitrile 80%, puis éluez les peptides avec 200 microlitres de E1 et E2 et analysez chaque élution séparément. Répétez le processus d’élution à l’aide de solvants E3 et E4 et combinez les fractions d’élution appropriées avant l’analyse en aval. Avant d’effectuer les élutions au pH de base, conditionnez le matériau trois fois en utilisant 200 microlitres d’acétonitrile à 90% dans de l’hydroxyde d’ammonium à 2,5%, puis éluez les peptides avec 200 microlitres de solvants E5 et E6, et analysez ces élutions séparément après dessalement à l’aide d’une pointe emballée.

Ensuite, éluez les peptides avec 200 microlitres de différentes concentrations d’acétonitrile et d’hydroxyde d’ammonium. Ensuite, combinez ces élutions et analysez-les en un seul échantillon, E7, après dessalement à l’aide d’une pointe emballée. Les spectres MS/MS annotés à haut niveau de confiance à partir de peptides N-glycosylés et phosphorylés ont été obtenus avec une riche fragmentation des précurseurs, augmentant ainsi la confiance dans l’identification, telle qu’assignée par le logiciel de recherche dans la base de données.

Des identifications peptidiques ont été trouvées à partir d’échantillons enrichis à l’aide de la méthode de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée en titane à double fonction sur chaque fraction d’élution. La majorité des glycopeptides éluent dans les quatre premières fractions, tandis que la majorité des phosphopeptides éluent dans les trois dernières fractions, réduisant ainsi les interférences potentielles dans l’ionisation. Les résultats glycoprotéomiques de la méthode du double titane ont été comparés à un enrichissement Ehrlich-glycopeptide uniquement, démontrant que les proportions de chaque type de glycane après avoir été regroupées en six catégories en fonction de leurs compositions, sont similaires entre les deux méthodes.

Les résultats phosphoprotéomiques de la méthode du double titane ont été comparés à un enrichissement conventionnel par chromatographie d’affinité métallique immobilisée à phosphopeptide uniquement ou en utilisant les deux méthodes. La majorité des acides aminés phosphorylés ont été identifiés comme étant de la sérine et de la thréonine, avec environ 1% de tyrosine phosphorylée. Il est important de bien construire la pointe de rotation pour assurer une élution en douceur.

Branchez fermement le coton dans la pointe, de sorte que le matériau d’enrichissement puisse être emballé sur le coton. Nous avons utilisé la méthode IMAC en titane à double fonction pour la caractérisation simultanée de la glycosylation et de la phosphorylation dans la plupart des tissus et de la protéine de pointe du SARS-CoV-2.