Microscopie à deux photons pour l’étude de l’attraction du processus microglial vers un composé dans une tranche de cerveau de souris

Placez une tranche de cerveau de souris dans une chambre de perfusion contenant du LCR a, sous un microscope à deux photons.

La souris est génétiquement modifiée pour exprimer la GFP dans la microglie, ce qui permet le suivi des mouvements microgliaux.

Fixez la tranche avec un support.

À l’aide d’un éclairage en fond clair, localisez la région d’intérêt.

Passez à l’éclairage par fluorescence pour visualiser la microglie.

Remplissez une micropipette avec le composé testé, montez-la sur un porte-seringue et abaissez-la pour toucher la tranche.

Activez le mode d’imagerie à deux photons, en concentrant la lumière proche infrarouge de faible énergie dans le tissu.

Au point focal du laser, deux photons combinent leur énergie pour exciter la GFP, émettant une fluorescence.

Capturez des images sur plusieurs plans Z pour vous concentrer sur les processus microgliaux.

Enregistrez l’activité de base, puis injectez le composé et poursuivez l’enregistrement.

Le composé se lie aux récepteurs microgliaux, déclenchant des voies de signalisation qui entraînent l’extension du processus microglial vers la source du composé.

Surveillez l’augmentation de la fluorescence près du site d’injection au fil du temps pour suivre le mouvement.

30 minutes avant de commencer l’enregistrement, connectez la pompe péristaltique à une chambre d’enregistrement personnalisée avec perfusion supérieure et inférieure pour optimiser l’oxygénation et la viabilité des tranches de tissu et nettoyez l’ensemble du système de perfusion avec 50 millilitres d’eau ultrapure. À la fin du cycle de nettoyage, commencez la perfusion de la chambre d’enregistrement avec 50 millilitres d’aCSF dans un bécher en verre sous carbogénation constante et utilisez une pipette de transfert jetable à large bouche pour transférer la première tranche à imager dans le bécher afin de retirer le papier de l’objectif.

Lorsque la section s’est enfoncée au fond du bécher, transférez la section dans la chambre d’enregistrement et positionnez le porte-tranche sur la tranche pour minimiser le mouvement induit par le flux de perfusion. Utilisez un éclairage en fond clair pour cibler la région cérébrale d’intérêt sous un grossissement de 5 à 10 fois. Utilisez ensuite un objectif 25 fois avec une lentille à immersion dans l’eau 0,35 fois pour ajuster la position du champ de vision.

Utilisez l’éclairage par fluorescence pour localiser les cellules microgliales fluorescentes et remplissez la pipette avec 10 microlitres d’aCSF contenant le composé d’intérêt à sa concentration finale. Pointez la pointe vers le bas en secouant doucement pour éliminer les bulles d’air emprisonnées dans la pointe et montez la pipette remplie dans un porte-pipette relié à une seringue de 5 millilitres, avec un piston positionné à la position 5 millilitres et monté sur un micromanipulateur à trois axes.

Abaissez doucement la pipette vers la tranche, en contrôlant et en ajustant l’objectif en même temps, jusqu’à ce que la pointe de la pipette touche légèrement la surface de la tranche. Réglez maintenant le laser et passez le microscope en mode multiphoton. Assurez-vous que la chambre est protégée de toute source lumineuse et allumez les détecteurs non désancrés. Réglez le gain et utilisez une table de correspondance avec une limite supérieure codée par couleur pour éviter de saturer les pixels de l’image.

puis commence l’enregistrement pour une durée totale d’au moins 30 minutes, en abaissant lentement le piston de la seringue de la position 5 à 1 millilitre après cinq minutes sur une période de 5 secondes pour appliquer le composé sur la section. Pour l’analyse d’images, effectuez d’abord la projection Z et la correction de dérive avec ImageJ sur le fichier qui vous intéresse. Ouvrez ensuite le fichier modifié dans Icy et dessinez une région d’intérêt circulaire de 35 micromètres de diamètre centrée sur le site d’injection.

Exécutez à nouveau le film avec le ROI pour vous assurer qu’il est bien positionné. Ensuite, utilisez le plugin Intensity Evolution de la région d’intérêt pour mesurer l’intensité moyenne au fil du temps dans la région d’intérêt et enregistrez les résultats dans un fichier .xls.