Name: Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Découvrez un protocole d'enlisement pour visualiser et quantifier l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies dans le système nerveux central. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour étudier l'élagage synaptique.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Afin de mesurer avec précision la phagocytose, matériel englouti doit être étiqueté de manière à ce que le chercheur peut visualiser une fois la dégradation lysosomale s&#39;est produite. En outre, l&#39;imagerie haute résolution est nécessaire, suivie par l&#39;utilisation d&#39;un logiciel qui va permettre au chercheur de visualiser le volume de la cellule entière et quantifier son contenu. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode très fiable et quantitative pour mesurer l&#39;engloutissement de phagocyte médiati...

<html> Circuits synaptiques remodeler tout au long de la vie d&#39;un animal. Dans le développement du cerveau, les synapses se forment dans l&#39;excès et doivent subir l&#39;élagage synaptique qui implique l&#39;élimination sélective d&#39;un sous-ensemble de synapses et le maintien et le renforcement de ces synapses qui restent 8-10. Ce procédé est nécessaire pour réaliser la connectivité caractéristique précise du système nerveux adulte. Chez l&#39;adulte, les synapses peuvent également être en plastique, en particulier dans le contexte de l&#39;apprentissage et de la mémoire. Les corrélats structurels de cette plasticité sont pensés pour inclure l&#39;ajout et / ou l&#39;élimination des épines dendritiques et boutons présynaptiques 11-13. En plus de ces rôles dans le système nerveux sain, remodelage synaptique est également impliqué dans une maladie du système nerveux / blessures 12,14,15. Par exemple, suite à une blessure de la moelle épinière, les axones sectionnés doivent ensuite remodeler et former de nouvelles synapses pour atteindre fonctionnelle 16-19 de récupération. nt &quot;&gt; émergents comme un aspect important de la plasticité synaptique est le processus de phagocytose ou l&#39;engloutissement des synapses destinés à l&#39;élimination 3,5,20. Nous avons récemment montré ce phénomène dans le contexte de l&#39;élagage synaptique dans le, cerveau de souris postnatale sain 7. précisément , les microglies, les cellules résidentes et les phagocytes immunitaires du système nerveux central, ont été présentés à engloutir entrées synaptiques au cours d&#39;une période de pointe et dans une région de la taille synaptique développement, la dorsale postnatale latérale corps genouillé (dLGN) du thalamus. blocus génétique ou pharmacologique de cette immersion entraîné des déficits soutenus dans la connectivité synaptique. Dans ce protocole, nous décrivons un test fiable et hautement quantitative pour mesurer l&#39;engloutissement de phagocyte médiation d&#39;entrées synaptiques. Pour les besoins de cet article, ce dosage sera présentée dans le contexte du système retinogeniculate développement, qui comprend des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) résidant dans la rétine quiINVESTISSEMENTS présynaptiques à la dLGN (figure 1A). Pour commencer, une stratégie d&#39;étiquetage antérograde résistant à la dégradation lysosomale sera décrite, qui est utilisé pour visualiser les entrées synaptiques RGC-spécifiques dans le dLGN (Figure 1) 7,21. Après cette description, une méthodologie détaillée pour l&#39;imagerie et la mesure quantitative de l&#39;engloutissement utilisant la microscopie confocale combinée à 3 dimensions (3D) surface rendu de volume sera donnée. Cette méthodologie est basée sur la préparation de tissu fixe mais peut aussi être adaptée pour être utilisée dans des études d&#39;imagerie en direct. Fait important, alors que le dosage a été validé dans le contexte du système de retinogeniculate sain, postnatal, on pourrait appliquer les mêmes techniques pour évaluer d&#39;autres interactions phagocyte des neurones dans tout le cerveau et pendant la maladie, ainsi que la fonction des phagocytes dans les autres systèmes de l&#39;organisme.

<table><tbody><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Source d’eau chaude pour coussin chauffant</td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>DSC Microscope</td><td></td><td>chirurgical optique Zeiss Opmi -6</td></tr><tr><td>Microtome coulissant avec platine de congélation</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microtome</td><td>Leica</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection fluorescent</td><td>Nikon</td><td>SMZ800 avec Épi-fluorescence Microscope</td><td></td></tr><tr><td>confocal à disque rotatif</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; l Seringues étanches au gaz</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>80030</td><td>Utilisez une seringue différente pour chaque colorant/traceur de couleur</td></tr><tr><td>Aiguilles Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7803-05, spécifications : émoussée, 1,5</td><td></td></tr><tr><td>"Toxine cholérique conjuguée à Alexa &bêta ; sous-unité (CTB)</td><td>Invitrogen</td><td>488 : C22841</td><td>Reconstituer dans une solution saline stérile, 80 &micro ; l (488), 100 et micro ; l (594), 20 et micro ; l (647)</td></tr><tr><td>594 : C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647 : C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;( PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Sulfates de néomycine et de polymyxine B et bacitracine Zinc Pommade ophtalmique USP (pommade antibiotique)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 30,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur à embout en coton</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Diluer 16 % à 4 % dans PBS. Le paraformaldéhye est toxique, à utiliser dans une hotte et à porter un équipement de protection individuelle.</td></tr><tr><td>Outils de dissection &ndash ; ciseaux, pinces, spatule</td><td>Petits ciseaux : Fine Science Tools</td><td>Petits ciseaux : 14370-22</td><td></td></tr><tr><td>Grands ciseaux : Roboz</td><td>Grands ciseaux : RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 Pinces : Fine Science Tools</td><td>#55 pinces : 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatule : Ted Pella, Inc.</td><td>Spatule : 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>Produire 30 % de saccharose en PBS (poids/vol)</td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Weigh boat</td><td>USA Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma</td><td>S6566-500G</td><td>Produire 0,2 M de phosphate de sodium monobasique (PB-A) dans le ddH2O et 0,2 M de phosphate de sodium dibasique (PB-B) dans le ddH2O. Pour obtenir 0,1 M PB, mélanger 19 ml de PB-A et 81 ml de PB-B, remplir à 200 ml de ddH2O</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique.</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles, 22 X 50 mm, n° 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope chargée</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

un enlisement test: un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

La phagocytose est un procédé dans lequel une cellule engloutit matériau (cellule entière, des parties d&#39;une cellule, des débris, etc) dans son environnement extracellulaire environnant et digère ce matériau, généralement par suite, la dégradation lysosomale. Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) dont la fonction phagocytaire a été décrit dans une large gamme de conditions de maladie neuro-dégénérative (par exemple, la clairance de la bêta-amyloïde dans la maladie d&#39;Alzheimer) pour le développement du cerveau en bonne santé (par exemple, synaptique élagage) 1-6. Le protocole suivant est un test de l&#39;engloutissement développé de visualiser et de quantifier l&#39;engloutissement de la microglie médiation d&#39;entrées synaptiques dans le développement du système de retinogeniculate de la souris 7. Bien que cet essai a été utilisé pour évaluer la fonction de la microglie dans ce contexte particulier, une approche similaire peut être utilisée pour évaluer d&#39;autres phagocytes dans l&#39;ensemble du cerveau (par exemple, les astrocytes) et le reste du corps(par exemple, les macrophages périphériques) ainsi que d&#39;autres contextes dans lesquels remodelage synaptique se produit (par exemple, une lésion cérébrale / maladies).

Récemment, nous avons utilisé ce test de l&#39;engloutissement de visualiser et de quantifier l&#39;engloutissement de la microglie médiation d&#39;entrées synaptiques dans le système retinogeniculate développement (Figure 1) 7. CGR de souris hétérozygotes CX3CR1-EGFP ont été tracées avec antérograde CTB-594 et CTB-647 dans les yeux droit et gauche, respectivement. Après ce traçage, la microglie EGFP-positives dans le dLGN ont été imagées. Ces images ont ensuite été surface-rendus pour les me...

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l&#39;engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies. Cela est réalisé en injectant d'abord des traceurs fluorescents antérogrades dans les yeux afin de marquer les entrées présynaptiques des cellules ganglionnaires de la rétine dans le noyau géniculé latéral. La deuxième étape consiste à disséquer, fixer et équilibrer le cerveau.Ensuite, le cerveau est sectionné. La dernière étape consiste à monter les sections cérébrales sur une lame couvre-objet pour l'imagerie et l'analyse. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour évaluer l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme la manière dont les microglies phagocytaires contribuent à la plasticité et au remodelage des circuits synaptiques. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur le remodelage des circuits synaptiques dans le cerveau sain, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que le remodelage des circuits synaptiques au cours des maladies du système nerveux. La procédure sera démontrée par Ch

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Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l'analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l'analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l'évaluation de la neurotoxicité.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

Cette étude décrit les procédures de mise en place d'un axone des neurones et roman (astro) glie plate-forme de co-culture. Dans ce système de co-culture, la manipulation de l'interaction directe entre un axone unique (et unique cellule gliale) devient possible, ce qui permet une analyse mécaniste du neurone mutuelle à la signalisation gliales.

Analyse en Imagerie du Neuron à l&#39;interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Dans cette vidéo, nous effectuons le test de phagocytose microgliale pour le neuroblastome en utilisant des cellules souches pluripotentes induites. Le test permet d’évaluer l’altération de la fonction microgliale dans les maladies neurodégénératives.

Dosage de la phagocytose microgliale : un test in vitro pour établir un modèle de phagocytose microgliale pour les cellules de neuroblastome à l’aide de macrophages iPSC

Dans cette vidéo, nous évaluons la capacité phagocytaire d’astrocytes purifiés in vitro par un test d’imagerie en direct. Le test sert de plate-forme de criblage efficace pour identifier les composés chimiques qui peuvent améliorer ou inhiber la capacité phagocytaire des astrocytes.

Dosage de la phagocytose in vitro : une méthode basée sur l’imagerie en direct pour étudier la phagocytose des synaptosomes médiée par les astrocytes en temps réel

Source : Funes, S., et. al., Cellules de type microglie humaine : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et test de phagocytose in vitro sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo présente un test permettant d’étudier la capacité phagocytaire des cellules microgliales à l’aide de synaptosomes marqués à un colorant fluorescent sensibles au pH.

Dosage de la phagocytose sur cellules vivantes de cellules de type microglie à l’aide de synaptosomes humains

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie.

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Ce protocole présente un test in vitro d’imagerie live phagocytose pour mesurer la capacité phagocytaire des astrocytes. La microglie et les astrocytes purifiée de rat sont utilisées avec synaptosomes conjugué indicateur de pH. Cette méthode peut détecter la cinétique de dégradation et d’une durée de temps réel et fournit une plate-forme de dépistage approprié pour identifier les facteurs modulant la phagocytose astrocyte.

Un pH de Novel In Vitro Live-imagerie phagocytose médiée par dosage de l’Astrocyte utilisant Synaptosomes indicateur conjugué

Les maladies neurodégénératives sont associées à des fonctions microgliales dérégulées. Cet article décrit un test in vitro de phagocytose des cellules de neuroblastome par les macrophages iPSC. Les lectures de microscopie quantitative sont décrites à la fois pour l’imagerie time-lapse sur cellules vivantes et l’imagerie à haut contenu à cellules fixes.

Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages

Nous présentons ici deux protocoles pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses vGLUT1-positives et des synaptosomes bruts marqués en rouge pHRodo à l’aide de la cytométrie en flux.

Quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique à l’aide de la cytométrie en flux

Découvrez un protocole d'enlisement pour visualiser et quantifier l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies dans le système nerveux central. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour étudier l'élagage synaptique.

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

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