Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies. Cela est réalisé en injectant d'abord des traceurs fluorescents antérogrades dans les yeux afin de marquer les entrées présynaptiques des cellules ganglionnaires de la rétine dans le noyau géniculé latéral. La deuxième étape consiste à disséquer, fixer et équilibrer le cerveau.

Ensuite, le cerveau est sectionné. La dernière étape consiste à monter les sections cérébrales sur une lame couvre-objet pour l'imagerie et l'analyse. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour évaluer l'englobement des entrées présynaptiques par les microglies.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme la manière dont les microglies phagocytaires contribuent à la plasticité et au remodelage des circuits synaptiques. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur le remodelage des circuits synaptiques dans le cerveau sain, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que le remodelage des circuits synaptiques au cours des maladies du système nerveux. La procédure sera démontrée par Chris Heller, technicien, et Emily Laman, étudiante en cycle supérieur du laboratoire Stevens.

Commencez cette procédure en anesthésiant une souris avec 4 % d'ISO fluoré dans une chambre d'induction en plexiglas. Après une à trois minutes, vérifiez qu'un niveau approprié d'anesthésie est atteint en pinçant la queue. Ensuite, placez la souris sur le côté sous le microscope stéréo et positionnez le cône nasal, qui délivre de 3 à 4 % d'ISO fluoré sur le museau.

Pour exposer la sclérotique, utilisez une petite paire de ciseaux à ressort pour ouvrir la paupière et tirer la peau vers l'arrière. Chez les nouveau-nés, une autre incision perpendiculaire à l'angle de l'œil est parfois nécessaire. Soyez prudent lors de la coupe à l'angle de la paupière, car un vaisseau sanguin s'y trouve.

Utilisez une aiguille stérile de calibre 30,5 pour percer un petit trou sur le côté de l’œil, là où commence la sclérotique. Veillez à ne pas endommager le cristallin en insérant l’aiguille juste assez profondément pour que la biseau pénètre dans l’œil. Laissez le vitré s’écouler par le trou et utilisez un applicateur stérile coupé et arrondi pour absorber le liquide.

Une fois que le vitré a cessé de s'écouler, insérez lentement une aiguille à extrémité émoussée fixée à une seringue Hamilton préchargée avec un traceur antérograde dans le trou, puis injectez lentement la teinture dans l'œil. Généralement, la sous-unité bêta de la toxine cholérique conjuguée à l’Alexa 5 94, 6 47 ou 4 88 est utilisée pour le traçage antérograde.

Conserver l'aiguille dans le trou pendant quelques secondes, puis la retirer lentement. Utiliser un applicateur en coton pour absorber le liquide en excès et empêcher le colorant de s'écouler. Ensuite, appliquer une petite quantité de pommade antibiotique sur l'œil.

Si l’œil a été ouvert chirurgicalement, repositionner délicatement les paupières ensemble après l’injection. Laisser la souris sous une lampe chauffante ou sur un tapis chauffant jusqu’à ce qu’elle commence à se réveiller de l’anesthésie.

Replacer la souris dans une cage propre et la surveiller pour s'assurer qu'elle est complètement réveillée avant de la retourner à la colonie. Environ 24 heures après l'injection, sacrifier la souris et disséquer le cerveau. Fixer le cerveau dans un tube Falcon rempli de PFA à 4 % pendant une nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant.

Rincez le cerveau trois fois dans du PBS en versant d'abord le cerveau et le PFA dans un bateau à lactosérum vide. Utilisez ensuite une spatule pour transférer le cerveau vers un autre bateau à lactosérum rempli de PBS. Lavez le cerveau deux fois supplémentaires dans du PBS avant de le transférer dans un tube Falcon rempli d'une solution de saccharose à 30 %. Laissez-le dans le saccharose à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'il coule au fond du tube.

Ensuite, retirez avec une lame de rasoir les parties du cerveau qui ne sont pas nécessaires. Congelez le cerveau sur un morceau de papier d'aluminium placé sur de la glace sèche. Pendant ce temps, faites refroidir la platine du microtome et remplissez chaque puits d'une plaque à 24 puits avec un demi-millilitre de PP 0,1 M afin de monter le cerveau congelé sur la platine réfrigérante.

Appliquez une petite quantité de OCT sur le plateau. Une fois que le OCT commence à geler, placez-y le cerveau. Le côté du cerveau qui sera coupé doit être orienté vers le haut.

Ensuite, recouvrez le cerveau et le OCT de dioxyde de carbone solide finement broyé. Laissez le dioxyde de carbone solide sur le cerveau pendant environ 30 secondes. Utilisez ensuite un grand pinceau pour enlever le dioxyde de carbone solide.

Commencez la sectionnement des tranches à une épaisseur de 40 micromètres. Utilisez ensuite un petit pinceau humide pour retirer les sections contenant la région d'intérêt de la lame et transférez-les dans la plaque 24 puits contenant du tampon phosphate 0,1 molaire. Une fois les sections recueillies, visualisez le marquage antérograde à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence et sélectionnez les sections contenant la région d’intérêt afin de les monter sur une lame.

Tout d'abord, appliquez une petite goutte de PBS à 0,1 M sur une lame de microscope chargée. Ensuite, transférez les sections de tissu dans la goutte de PBS. Puis, utilisez le pinceau pour orienter et étaler les tissus.

Utilisez un essuie-tout Kim pour absorber le XSPB en veillant à ne pas absorber la section. Laissez-les sécher complètement à l'air. Ensuite, appliquez une petite goutte de milieu de montage sur chaque section et posez une lamelle par-dessus à la fin.

Sceller les bords de la lame avec du vernis à ongles. Conserver la lame à moins 20 degrés Celsius jusqu'à la séance d'imagerie indiquée. Voici un schéma de la stratégie de traçage antérograde.

Les entrées des CBR de l'œil gauche et droit sont tracées respectivement avec le CTB 647 et le CTB 594. L'englobement des entrées médié par les microglies est ensuite évalué. Voici une image représentative, à faible grossissement, du DLGN de souris au cinquième jour postnatale, après le traçage intergrade des entrées des yeux gauche et droit.

Il s'agit d'une microglie prélevée dans la région frontalière des entrées de l'œil gauche et droit. Toute la fluorescence CTB située à l'extérieur du volume de la microglie a été soustraite, révélant les entrées des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) qui ont été englobées, ainsi que la représentation en surface de la microglie et des entrées englobées. Les entrées des CGR sont montrées ici.

Voici les microglies représentatives en rendu de surface provenant de souris P cinq, P neuf et P 30. L'englobement par la LGNd des entrées des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) augmente significativement pendant la période de taille maximale dans la LGNd par rapport aux âges plus avancés. Les microglies provenant de souris déficientes en récepteur du complément trois englobent significativement moins d'entrées RGC par rapport aux souris témoins de la même portée, une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment marquer les neurones de manière intégrée et évaluer les interactions entre les microglies et les synapses.