Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier l’engloutissement des entrées présynaptiques par la microglie. Ceci est accompli en injectant d’abord les traceurs fluorescents de grade antérieur dans les yeux pour marquer les entrées présynaptiques des cellules ganglionnaires rétiniennes dans le noyau de genant latéral. La deuxième étape consiste à disséquer, réparer et équilibrer le cerveau.

Ensuite, le cerveau est sectionné. La dernière étape consiste à monter les sections cérébrales sur une lèvre de couverture pour l’imagerie et l’analyse. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour évaluer l’absorption des entrées présynaptiques par la microglie.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les sols phagocytaires contribuent à la plasticité et au remodelage des circuits synaptiques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du remodelage des circuits synaptiques dans le cerveau sain, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le remodelage des circuits synaptiques au cours d’une maladie du système nerveux. Chris Heller, un technicien, et Emily Laman, une étudiante diplômée du laboratoire Stevens, feront la démonstration de la procédure.

Commencez cette procédure en anesthésiant une souris avec 4 % de fluor ISO dans une chambre d’induction en plexiglas. Après une à trois minutes, assurez-vous d’obtenir un niveau d’anesthésie approprié en pinçant la queue. Placez ensuite la souris sur le côté sous le stéréomicroscope et placez le cône nasal, qui délivre de 3 à 4 % de fluor ISO sur le museau.

Pour exposer la sclère, utilisez une paire de petits ciseaux à ressort pour ouvrir la paupière et tirer la peau vers l’arrière. Pour les nouveau-nés, une autre incision perpendiculaire au coin de l’œil est parfois nécessaire. Soyez prudent lorsque vous coupez le coin de la paupière car il y a un vaisseau sanguin.

Utilisez une aiguille stérile de calibre 30,5 pour percer un petit trou sur le côté de l’œil où commence la sclérotique. Prenez soin de ne pas endommager la lentille en insérant l’aiguille juste assez loin pour que le biseau pénètre dans l’œil. Laissez le vitré s’écouler hors du trou et utilisez un applicateur stérile coupé et à pointe pour absorber le liquide.

Une fois que le vitré a cessé de s’écouler du trou, insérez lentement une aiguille à extrémité émoussée attachée à une seringue Hamilton qui a été préchargée avec un tracé de grade antérieur. Colorant dans le trou, injectez lentement le colorant dans l’œil. En règle générale, la sous-unité bêta de la toxine cholérique conjuguée à Alexa 5 94, 6 47 ou 4 88 est utilisée pour le grade antérieur.

Traces tardives R GC : laissez l’aiguille dans le trou pendant quelques secondes, puis retirez-la lentement. Utilisez un applicateur à embout en coton pour absorber l’excès de liquide et empêcher le colorant de s’échapper. Appliquez ensuite une petite quantité de pommade antibiotique sur l’œil.

Si l’œil a été ouvert chirurgicalement. Repositionnez doucement les paupières ensemble après l’injection. Laissez la souris sous une lampe chauffante ou sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle commence à se remettre de l’anesthésie.

Remettez la souris dans une cage propre et surveillez-la pour vous assurer qu’elle est complètement réveillée avant de la rendre à la colonie. Environ 24 heures après l’injection, sacrifiez la souris et disséquez le cerveau. Fixez le cerveau dans un tube Falcon rempli de 4 % de PFA pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Rincez le cerveau trois fois dans du PBS en versant d’abord le cerveau et le PFA dans un bateau de lactosérum vide, puis utilisez une spatule pour transférer le cerveau dans un autre bateau de lactosérum rempli de PBS. Lavez le cerveau deux fois de plus dans du PBS avant de le transférer dans un tube Falcon rempli d’une solution de saccharose à 30 %. Laissez-le dans du saccharose à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il coule au fond du tube.

Ensuite, retirez toutes les parties du cerveau qui ne sont pas nécessaires avec une lame de rasoir. Congelez le cerveau sur un morceau de papier d’aluminium sur de la glace sèche. Pendant ce temps, congelez l’étape du microtome et remplissez chaque puits d’une plaque de 24 puits avec un demi-millilitre de PP 0,1 molaire pour monter le cerveau congelé sur l’étape de congélation.

Appliquez une petite quantité d’OCT sur la scène. Une fois que l’OCT commence à geler, déposez-y le cerveau. Le côté du cerveau qui sera coupé doit être tourné vers le haut.

Ensuite, couvrez le cerveau et l’OCT avec de la glace sèche très finement concassée. Laissez la glace sèche sur le cerveau pendant environ 30 secondes. Utilisez ensuite un grand pinceau pour enlever la glace sèche.

Commencez à sectionner les tranches à 40 microns d’épaisseur. Ensuite, à l’aide d’un petit pinceau humide, vous enlevez les sections contenant la région d’intérêt de la lame et transférez-les sur la plaque à 24 puits contenant 0,1 molaire de pb. Une fois les coupes collectées, visualisez l’étiquetage du grade antérieur à l’aide d’un microscope à dissection fluorescente et choisissez des sections contenant la région d’intérêt pour les monter sur une lame.

Tout d’abord, appliquez un petit pool de 0,1 PB molaire à un microscope chargé. Glissez ensuite, transférez les sections de tissus dans la flaque de pb. Utilisez ensuite le pinceau pour orienter et étaler les tissus.

Utilisez une lingette Kim pour évacuer XSPB et veillez à ne pas évacuer la section. Laissez-les sécher complètement à l’air. Appliquez ensuite une petite goutte de support de montage sur chaque section et montez une lamelle de recouvrement sur le dessus à la fin.

Scellez les bords de la lame avec du vernis à ongles. Conservez la lame à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la séance d’imagerie s’affiche. Voici un schéma de la stratégie de traçage du grade antérieur.

Les entrées RGC de l’œil gauche et de l’œil droit sont tracées respectivement avec CTB 6 47 et CTB 5 94. L’engloutissement des intrants par la microglie est ensuite évalué. Voici une image représentative à faible grossissement de la souris DLGN du cinquième jour postnatal après le traçage intergrade des entrées de l’œil gauche et de l’œil droit.

Il s’agit d’une microglie échantillonnée dans la région frontalière des entrées de l’œil gauche et de l’œil droit. Toute la fluorescence CTB à l’extérieur du volume microglial a été soustraite, révélant les entrées RGC qui ont été englouties et le rendu de surface de la microglie et engloutie. Les entrées RGC sont illustrées ici.

Voici la surface représentative rendue par la microglie des souris P cinq, P neuf et P 30. DLGN L’absorption des intrants RGC est significativement augmentée lors de la taille maximale dans le DLGN par rapport aux âges plus avancés. La microglie des souris déficientes en complément trois absorbe beaucoup moins d’entrées RGC par rapport aux compagnons de portée de type sauvage Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’intergrader les neurones et d’évaluer les interactions entre les synapses microgliales.