Antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des Applications de bio-ingénierie

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie des matériaux, telles que les propriétés antimicrobiennes, qui sont très souhaitables pour de nombreuses applications de bio-ingénierie. Cette technique peut être utilisée comme protocole cohérent dans tous les laboratoires pour aider les chercheurs moins expérimentés qui ont besoin de procédures approfondies étape par étape à suivre pour obtenir des résultats précis. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à chercher des protocoles antimicrobiens, et nous nous sommes rendu compte qu’il n’y avait pas de protocoles détaillés sur celui-ci dans la littérature.

Dans cette étude, quatre matériaux avancés de natures chimiques différentes et un matériau de contrôle seront testés pour leur activité antimicrobienne. Préparez chaque matériau en le découpant en disques de 10 mm de diamètre. Ensuite, stérilisez chaque échantillon par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes, puis par rayonnement ultraviolet pendant une heure de chaque côté.

Trois micro-organismes différents seront utilisés pour tester l’activité antimicrobienne des matériaux avancés. Les bactéries à Gram positif, Staphylococcus aureus, les bactéries à Gram négatif, Escherichia coli, et les levures, Candida albicans. À l’aide d’un coton-tige stérile, remettre en suspension quelques colonies de chaque micro-organisme dans 25 ml de bouillon de soja tryptique, ou TSB, contenu dans un tube à centrifuger stérile.

Agitez pendant une minute pour obtenir un mélange uniforme. Mesurer l’absorbence à 540 nm pour chaque culture de micro-organismes à l’aide d’un spectrophotomètre. Ajustez la concentration de chaque micro-organisme à un nombre approprié d’unités formant colonies, ou UFC par millilitre.

Agitez la suspension microbienne pendant cinq secondes pour améliorer la dispersion des micro-organismes, et immergez brièvement un coton-tige stérile dans cette suspension microbienne. Retirez l’excès de liquide de l’écouvillon en pressant l’écouvillon contre la paroi du tube contenant la culture. Étalez uniformément chaque suspension de bouillon microbien avec le coton-tige stérile sur la surface d’une gélose de soja tryptique, ou plaque TSA, sur trois plans pour couvrir toute la surface avec le micro-organisme.

Laissez sécher les plaques pendant cinq minutes après l’inoculation. Laissez les suspensions de bouillon microbien sur la paillasse pour une utilisation ultérieure afin de vérifier la concentration et la pureté de la suspension microbienne. Stérilisez une pince à épiler en l’immergeant dans un bécher avec de l’éthanol à 96 %, puis en l’enflammant avec un brûleur à alcool.

À l’aide de la pince à épiler stérile, placez les disques d’échantillon à tester au centre des plaques TSA. Incuber les plaques TSA en position inversée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour analyser les résultats du test de diffusion, mesurez le diamètre de la zone d’inhibition et le diamètre du disque d’échantillon à l’aide d’un pied à coulisse numérique, ou en prenant une photo et en utilisant un logiciel de traitement d’image approprié.

Cette procédure est nécessaire pour vérifier que les concentrations microbiennes déterminées précédemment sont correctes et pour s’assurer de l’absence de contamination microbienne de l’environnement. À l’aide d’une micropipette avec des pointes autoclavées appropriées et dans des conditions aseptiques, distribuez le TSB stérile dans des tubes de microcentrifugation stériles. Incluez un échantillon qui sera utilisé comme témoin négatif.

Effectuez des dilutions en série de six décimales avec les suspensions de bouillon microbien utilisées précédemment pour le stries des plaques TSA. À l’aide d’une spatule Drigalski pré-stérilisée, étaler 100 l de chaque dilution sélectionnée sur une plaque TSA. Étaler 100 l de milieu TSB sans micro-organisme sur une plaque TSA comme témoin négatif.

Incuber les plaques TSA à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour vérifier que l’UFC par millilitre est similaire à celle déterminée précédemment. Vérifiez la plaque de contrôle négative pour confirmer qu’il n’y a pas de contamination microbienne de l’environnement.

Commencez cette procédure par la culture des différents micro-organismes à tester dans le TSB, dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mesurer la DO 540 de chaque culture de nuit, puis diluer chaque culture dans 20 mL de BST dans un tube à centrifuger pré-stérilisé de 50 mL jusqu’à une concentration d’environ dix à six UFC par millilitre. Placez quatre disques de chaque type de matériau et quatre disques de contrôle dans des puits séparés d’une plaque stérile à 48 puits.

Pipeter 150 l de la suspension microbienne sur chaque surface du disque. Incuber la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation de la plaque à 48 puits pendant 24 heures, pipetez 850 l de PBS stérile sur la surface de chacun des quatre disques d’échantillon et des quatre disques de contrôle, et mélangez-le avec la suspension microbienne.

Prélever chaque mélange de suspension microbienne PBS et chaque disque de la plaque à 48 puits, puis transférer dans un tube pré-stérilisé de 15 ml. Vortex les mélanges et disques de suspension microbienne PBS pendant une minute. Sonicer à 50 Hz pendant cinq minutes et agiter à nouveau pendant une minute pour s’assurer qu’aucun micro-organisme viable n’adhère à la surface du matériau.

Effectuer des dilutions décimales en série des cultures soniquées et des tubes de microcentrifugation stériles contenant du BST. Étalez 100 l de chaque dilution sur une plaque TSA et incubez les plaques en aérobie à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, comptez le nombre de colonies et exprimez ce nombre en UFC par millilitre.

Les résultats de la méthode de contact sont ensuite analysés comme décrit dans le protocole texte. Les résultats des tests de diffusion sur disque de gélose montrent une activité non antimicrobienne pour le premier matériau et une activité antibactérienne croissante contre S. aureus et E. coli pour les trois autres matériaux. Ce graphique montre le halo normalisé de chaque disque de matériau contre S. aureus et E. coli après 24 heures d’incubation.

Les résultats de la méthode de contact indiquent également une activité non antimicrobienne pour le premier matériau et une activité antibactérienne accrue contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif pour les trois autres matériaux. C est la bactérie viable récupérée du disque témoin après 24 heures d’incubation. Ce graphique montre le pourcentage de perte de viabilité des quatre matériaux contre S. aureus et E. coli à la surface des matériaux.

L’échantillon M1 n’a montré aucune activité antimicrobienne. Bien que cela ne soit pas montré ici, aucun des quatre matériaux n’est capable d’inhiber la croissance de la levure, Candida albicans, par d’autres méthodes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer l’activité antimicrobienne par ces deux méthodes complémentaires.