Name: Antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des Applications de bio-ingénierie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez la caractérisation antimicrobienne de matériaux avancés pour la bio-ingénierie en utilisant les tests de diffusion sur gélose et ISO 22196:2007. Ce protocole systématique évalue l'activité contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli.

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Les auteurs aimerait remercier la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir pour le soutien financier pour ce travail à travers le 001UCV-231-2017 et 2018-231-001UCV subventions.

1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Couper les échantillons de matériaux en disques de diamètre 10 mm avec un diamètre de 10 mm poinçon cylindrique. Remarque : Matériaux fragiles peuvent être ramollies dans les solvants qui conviennent stériles pendant 1 h et ensuite coupés en disques. Par exemple, les matériaux hydrophiles comme alginate de zinc ont été analysés selon ce protocole et ont été imbibés dans l’eau autoclavé avant de les couper afin d’éviter la rupture de l’échantillon. Toutefois, autres matériaux hydrophobes tels que les poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) n’ont pas besoin n’importe quel genre de gonflement précédent afin d’être correctement coupé.</li>
	<li>Sécher les disques matérielles de l’échantillon à 60 ° C dans une étuve à vide (&lt; 10-2 Torr) pendant 24 h. Remarque : Certains matériaux peut-être besoin une haute température de séchage. Toutefois, il est important de ne pas atteindre une température qui pourrait dégrader thermiquement le matériel.</li>
	<li>Mesurer les épaisseurs de matériel film avec un pied à coulisse numérique. Remarque : Ce protocole recommande l’utilisation de matériels films avec une épaisseur constante et analogue lors de la comparaison de l’activité antimicrobienne de différents matériaux.</li>
	<li>Stériliser à chaque spécimen par immersion dans de l’éthanol 70 % pendant 10 min et les rayons ultraviolets (UV) pendant 1 h par chaque côté. NOTE : Rayonnement UV peut être effectuée en plaçant chaque spécimen dans une boîte de Petri stérile à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avec une lampe de 12,0 W de rayonnement UV-C. ATTENTION : Chercheurs ne devraient pas s’exposer aux rayons ultraviolets, parce qu’il est mutagène.</li>
	<li>Effectuez les étapes 1.1, 1.2, 1.3 et 1.4. avec les disques de matériel de contrôle. Remarque : Le polyéthylène téréphtalate (PET) ou des matériaux non antimicrobiens alternatifs pourraient servir comme un disque de contrôle dans la méthode de diffusion et contact. Plus, lorsque la caractérisation nanocomposites ou matériaux traités, le matériau de base devrait être utilisé comme matériel de contrôle.</li>
</ol>2. recommandée de micro-organismes
Remarque : Nous recommandons l’utilisation de 3 différents microorganismes pour étudier la capacité antimicrobienne du matériau testé contre un large éventail de microorganismes.
<ol><li>Utiliser des cultures pures de 3 microorganismes : les bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus, Escherichia coliles bactéries à Gram négatif et la levure Candida albicans. Remarque : Autres espèces de micro-organismes aussi peuvent être testés avec ce protocole en modifiant les conditions d’incubation si nécessaire. ATTENTION : Les mesures de biosécurité requises doivent être suivies selon le type de micro-organisme employée dans le présent protocole.</li>
	<li>Travailler avec du matériel préalablement stérile ou autoclavé et utiliser un brûleur Bunsen pendant tout le processus de la manipulation microbienne ou une enceinte de sécurité biologique (si nécessaire) afin d’assurer des conditions d’asepsie. Remarque : Des conditions recommandées autoclave sont 121 ° C pendant 15 min pour les milieux de culture et 121 ° C pendant 20 min. pour le matériel de travail et les résidus biologiques.</li>
</ol>3. agar disque Diffusion Test (méthode de Diffusion)
Remarque : Lorsqu’une liquide diffusion de composés antimicrobiens pourrait être le principal mécanisme antimicrobien des matériaux avancés, la méthode de diffusion peut fournir des informations très utiles quant à la capacité antimicrobienne de ces matériaux. Le disque de matière situé au centre de la gélose peut former une zone d’anneau transparent (halo) où une inhibition de la croissance de microorganismes se produit après 24 h de culture (voir Figure 1).
<ol><li>
Procédure d’essai de diffusion
	<ol>
<li>Préparer et autoclave une gélose trypticase soja (TSA) suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez la TSA dans des plats de Pétri stérile dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire. Remarque : Les plaques TSA doivent être de 4 à 6 mm d’épaisseur.</li>
		<li>La culture de micro-organismes différents à tester en aérobiose pendant 18-24 heures dans les boîtes de Pétri avec TSA dans un incubateur à 37 ° C.</li>
		<li>Préparer et bouillon de trypticase soja autoclave (BST) suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez le BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL avec une pipette sérologique préstérilisé dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Resuspendre quelques colonies d’étape 3.1.3 dans 25 mL de TSB contenue dans un tube à centrifuger stérile à l’aide d’un coton-tige stériles et vortex eux pendant 1 min obtenir un mélange homogène.</li>
		<li>Ajuster l’absorbance (à 540 nm) de la culture avec un spectrophotomètre pour le nombre approprié de colonies formant des unités (UFC) par mL : environ 1,5 x 108 UFC/mL pour les bactéries et de 1 x 106 à 5 x 106 UFC/mL pour la levure. Remarque : Les volumes pour mesurer l’absorbance de la culture et de la cuvette doivent être choisies selon le type du spectrophotomètre utilisé.</li>
		<li>Vortex le bouillon de culture microbienne pendant 5 secondes pour améliorer la dispersion du micro-organisme et Plongez brièvement un coton-tige stériles dans cette suspension microbienne. Enlever l’excès de liquide de l’écouvillon en le pressant contre la paroi du tube contenant la culture.</li>
		<li>-Ensemencer uniformément la suspension microbienne bouillon avec le coton-tige stériles sur la surface des plaques TSA dans 3 plans pour couvrir leur toute la surface avec le micro-organisme et le laisser sécher pendant 5 min après l’inoculation. Remarque : Pour supprimer toute trace d’humidité, les plaques TSA doivent être placés ouverts en position inversée à 37 ° C pendant 10 à 15 min avant l’inoculation.</li>
		<li>Stériliser une paire de pincettes en immergeant dans un bécher avec de l’éthanol 96 % et ensuite les flammes avec un bec Bunsen ou la lampe à alcool.</li>
		<li>Placer les disques d’échantillon pour tester et contrôler le disque au centre des plaques TSA en utilisant une paire de pinces stériles.</li>
		<li>Incuber en aérobiose la TSA en position inversée à 37 ° C pendant 24 h. Remarque : Pour éviter tout risque de contamination, il est recommandé à incuber les boîtes de Pétri de TSA. Toutefois, si le disque échantillon se détache des plaques TSA, n’effectuez pas cette étape en position inversée. Dans ce cas, il est recommandé de sécher les plaques dans la hotte à flux laminaire. Ce test antimicrobiens doit être effectué au moins en quadriplicate à des jours différents pour assurer la reproductibilité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vérification de la pureté et la concentration de la suspension microbienne Remarque : Les étapes suivantes sont nécessaires afin de vérifier que la concentration microbienne déterminée avec le spectrophotomètre à l’étape 3.1.7 est correcte et s’assurer qu’il n’existait aucune contamination microbienne de l’environnement. Une contamination microbienne de l’environnement peut être facilement détectée par l’apparition de divers types de colonies microbiennes après 24 h de culture. En outre, aucune contamination microbienne du milieu du BST au cours de sa manipulation dans les dilutions décimales en série ne doit être assurée avec une plaque de contrôle négative du BST.<ol>
<li>Diluer le TSB stérile (préparé à l’étape 3.1.4) dans des microtubes stériles à l’aide d’une micropipette avec des pointes autoclavés appropriés dans des conditions aseptiques. L’un d’eux sera utilisé comme contrôle négatif du BST.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série avec la suspension microbienne bouillon utilisée à l’étape 3.1.9 dans les tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST.</li>
		<li>Propagation de 100 µL de chaque dilution sur des plaques TSA à l’aide d’une spatule de Drigalski préstérilisée ou un autre instrument. Aussi répandu 100 μl de milieu du BST sans micro-organisme (préparé à l’étape 3.2.1) sur une plaque TSA comme une plaque de contrôle négative du BST.</li>
		<li>Incuber en aérobiose la TSA en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Compter le nombre de colonies pour vérifier que le CFU/mL sont semblables à celui déterminé à l’étape 3.1.7.</li>
		<li>Vérifier qu’il n’y a aucune contamination microbienne environnementale sur les plaques de la TSA avec qu’un seul type de colonies.</li>
		<li>Vérifier qu’il n’y a aucune contamination microbienne sur la plaque de contrôle négatif du BST ne montrant aucune colonie</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mesure de l’activité antimicrobienne sur les Surfaces des matériaux (méthode de Contact)
 Remarque : Lorsque la surface de contact peut être le mécanisme principal d’antimicrobiens de certains matériaux de pointe, la méthode de contact peut fournir des informations très utiles quant à la capacité antimicrobienne de ces matériaux. Dans cette méthode, les micro-organismes sont placés directement sur la surface du matériau et leur inhibition de la croissance peut être déterminée après un certain laps de temps.
<ol><li>
Procédure initiale
	<ol>
<li>Préparer et stériliser du BST en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez le BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL avec une pipette sérologique préstérilisé dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Culture les différents microorganismes à tester en aérobiose, du jour au lendemain dans le tube avec le BST dans un agitateur orbital (140 tr/min) à 37 ° C.</li>
		<li>Diluer la culture nuitée dans 20 mL du BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL à une concentration d’environ 106 UFC/mL (déterminé avec un spectrophotomètre à 540 nm). Remarque : Les volumes pour mesurer l’absorbance de la culture et de la cuvette doivent être choisies selon le type du spectrophotomètre utilisé.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série de cette culture en tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST. Répandre 100µl de la culture sur des plaques TSA et il incuber en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Dénombrer les colonies afin d’assurer une concentration cellulaire initial d’environ 1 x 106 UFC/mL</li>
		<li>4 place les disques de contrôle pour le comptage microbienne après 24h et 4 disques d’échantillon de chaque type des matériaux testés pour le comptage microbienne après que 24h en sépare les puits d’une plaque de 48 puits stérile.</li>
		<li>Distribuer 150 µL de la suspension microbienne sur chaque surface de disque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microbienne de comptage sur le contrôle et les matériaux testés (après 24 h)
	<ol>
<li>Après l’étape 4.1.6, en aérobiose Incuber les 4 disques échantillon restant dans la plaque de 48 puits à 37 ° C pendant 24 h. Remarque : Ce temps d’incubation de 24 heures peuvent être modifié afin d’étudier l’inhibition de la croissance à des moments plus ou moins longues.</li>
		<li>Après 24 h d’incubation, distribuer 850 µL de PBS stérile sur la surface des 4 disques échantillon et mélangez-le avec les 150 µL de la suspension microbienne.</li>
		<li>Percevoir le mélange de suspension microbienne/PBS et chaque disque de la plaque 48 puits et transférez-les sur un tube de 10 mL pré-stérilisés.</li>
		<li>Vortex le mélange de suspension microbienne/PBS et chaque disque pendant 1 min, ultrasons il à 50 Hz pendant 5 min et vortex il à nouveau pendant 1 min pour s’assurer qu’aucun des microorganismes viables ne restent ont adhéré à la surface du matériau.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série de chaque culture aux ultrasons dans des tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST et répandre 100µl de la culture sur des plaques TSA et il incuber en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Compter le nombre de colonies, qui sont le nombre de micro-organismes viables sur chaque surface de disque échantillon et témoin. Exprimer ce nombre de cellules viables dans (UFC/mL).</li>
		<li>Prenez une photo de la culture microbienne finale pour les disques de l’échantillon et témoin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analyse des résultats antimicrobiens
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Figure 1 : mesures pour la largeur normalisée de l’antimicrobien « halo ». Ce panneau indique le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>
Analyse des résultats méthode diffusion
	<ol>
<li>Mesurer le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d) (voir la Figure 1) avec un pied à coulisse numérique. Remarque : L’inhibition zone ou antimicrobien « halo » est formé par suite de l’inhibition de la croissance microbienne produite par le disque de matière antimicrobien (voir Figure 1). Il est possible d’observer qu’il y a une zone transparente anneau proche de l’échantillon par rapport au reste de la plaque où les micro-organismes sont développées correctement (zone opaque).</li>
		<li>Déterminer la largeur normalisée de l’antimicrobien « halo » (nwhalo) de chaque disque en appliquant l’équation (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Déterminer la moyenne et l’écart de la largeur normalisée des valeurs nwhalo antimicrobien « halo » avec 4 déterminé de chaque échantillon.</li>
		<li>Prenez une photo de la culture microbienne finale avec le disque de matière. Remarque : Le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d) peuvent être mesurées aussi de la photo prise à l’étape 5.1.4 en utilisant une logiciel de traitement d’image adaptée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Méthode de contact résultats analyse
	<ol>
<li>Déterminer le nombre de micro-organismes viables récupérés selon l’équation (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> NOTE : Ici, N est le nombre de micro-organismes viables récupérés par cm2 par éprouvette ; C est la teneur en germes ; D est le facteur de dilution ; A est la surface de l’éprouvette en cm2 déterminé par le diamètre du disque échantillon.</li>
		<li>Déterminer la perte de viabilité (LV) pour tenir compte de l’inhibition de la croissance cellulaire en appliquant l’équation (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> NOTE : Ici, C est le nombre moyen de micro-organismes viables (N) en UFC/mL•cm2, prélevés les échantillons de contrôle après 24 h ; S est le nombre de micro-organismes viables (N) en UFC/mL•cm2, extraite des éprouvettes après 24h.</li>
		<li>Déterminer la moyenne et l’écart type de la perte de viabilité avec les 4 valeurs déterminées de LV(%) de chaque échantillon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’activité antimicrobienne de nouveaux matériaux avancés peut être analysée par le présent protocole facile à suivre, consistant en 2 procédures complémentaires basées sur 2 méthodes existantes : la méthode de diffusion sur gélose test38 et mesuré l’activité antimicrobienne surfaces de matériaux selon la norme ISO 22196:200739.
Dans ce domaine de recherche, nombreux tests antimicrobiens rapportées dans la littérature sont très dépendants de l’essai. Il est donc très important d’avoir des détaillées et cohérente des protocoles en place dans les laboratoires. Cet article est une étape dans cette direction. En outre, il pourrait être très utile pour de nombreux chercheurs qui sont moins expérimentés dans ce domaine et qui doivent être approfondie, étape par étape à suivre pour des résultats précis.
Ce protocole peut être utilisé avec plusieurs types de matériaux découpés en formes de disque de 10 mm de diamètre. Les matériaux fragiles peuvent être gonflées dans un solvant approprié pendant 1 h rendre le processus de découpe plus facile. Ainsi, des matériaux hydrophiles comme les alginates peuvent être hydratés dans l’eau distillée autoclavé. Autres solvants, comme l’éthanol, cétone et le dichlorométhane, peuvent servir à gonfler des matières hydrophobes pendant 1 h avant de les couper. Cependant, certains matériaux tels que le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) n’avez pas besoin d’être gonflé, et ils peuvent être coupés directement. Après cela, il est très important de sécher les disques matérielles de l’échantillon dans une étuve à vide et stériliser chaque échantillon avec l’éthanol et le rayonnement UV pendant 1 h pour éviter tout risque de contamination.
Ce protocole recommande TSA et BST comme milieux de culture et de l’utilisation des cultures pures de 3 microorganismes pour atteindre un large éventail de microorganismes : les bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus, Escherichia coli, les bactéries à Gram négatif et la levure Candida albicans. Cependant, les milieux de culture alternative et d’autres microorganismes qui ont besoin de conditions différentes d’incubation pourraient également être utilisés avec ce protocole. Parfois, 1 seul micro-organisme est testé pour avoir une première idée de l’activité antimicrobienne d’un nouveau matériau.
Les matériaux à forte activité antimicrobienne contre les 3 recommandés montrant différents types de microorganismes doivent également être testés contre les agents pathogènes résistants aux antibiotiques comme la méthicilline-résistant Staphylococcus epidermidis (MRSE), qui ont été utilisés avec succès avec ce protocole. Autres micro-organismes résistants aux médicaments importants qui causent beaucoup de soucis sont le Gram positif méthicilline-résistant Staphylococcus aureus (SARM) et vancomycin-resistant Enterococci (ERV) et le Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inhibition de biofilm et l’activité antimicrobienne des matériaux contre d’autres types de micro-organismes tels que les virus et les parasites ne peuvent être testés avec ce protocole. Toutefois, ce protocole prévoit un très bon point de départ pour une étude d’antimicrobiens d’un nouveau matériel de pointe.
Dans le test de diffusion de disque antimicrobien agar, une étape cruciale se produit lorsque le disque de l’échantillon doit être placé dans le centre de la plaque car certains matériaux plier dès qu’ils obtiennent en contact avec les milieux gélosés. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser une paire stérile de pincettes pour Dépliez délicatement l’échantillon. En revanche, dans la méthode de contact, il est essentiel de laver le contrôle et disques d’échantillon très bien avec du PBS de pipetage eux quatre fois suivie d’une agitation vigoureuse et la sonication afin de ne garantir qu’aucun des microorganismes viables restent collés à la matière surface.
Ce protocole vidéo peut être utilisé dans de nombreuses applications de la bio-ingénierie, tels que le génie des bioprocédés, génie tissulaire, livraison de drogue contrôlée, matériaux d’emballage, traitement des eaux usées et l’agriculture, qui utilisent des biomatériaux avec une très capacité antimicrobienne souhaitable.
Les résultats obtenus avec ce protocole sont qualitatives (les images) et quantitative (la largeur normalisée de l’antibactérien « halo » et la perte de viabilité) avec une bonne analyse de sa reproductibilité (moyenne ± écart-type). Lorsque l'on compare les différents matériaux, ces valeurs moyennes obtenues avec l’analyse de résultats de méthode diffusion et contact doivent être analysés par ANOVA, suivie de l’analyse post hoc de la Turquie, afin d’étudier si elles sont, statistiquement, significativement à différents (p < 0,01).

Échec de l’implant est souvent une conséquence des infections microbiennes qui se produisent en dépit de la prophylaxie antimicrobienne et des conditions de travail aseptique. Ce problème est entraînant des coûts très élevés de soins de santé, est pénible parmi les patients1. Important des bactéries telles que Staphylococcus aureus sont actuellement considérés comme très dangereux agents pathogènes nosocomial infections liées aux cathéters et d’autres implants médicaux et sont les principaux contaminants des instruments médicaux2. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies antimicrobiennes est absolument nécessaire pour les utilisations quotidiennes et médicale.
Agents antimicrobiens incluent antibiotiques3composés d’ammonium quaternaire4, ions/oxydes métalliques5et peptides antimicrobiens (ampères)6. Antibiotiques deviennent progressivement moins efficaces en raison de la résistance bactérienne7, qui est à la hausse en raison de la surutilisation antibiotique8. Composés d’ammonium quaternaire ne sont plus très efficaces pour une utilisation à court terme en raison de la résistance microbienne,9. Les ions/oxydes métalliques ont été longtemps utilisés comme agents antimicrobiens très efficaces et sont utilisés dans nombreux produits commerciaux communs, y compris les pansements, les filtres à eau, peintures, etc.10,11,12. Toutefois, il a été démontré que ces types de composés peuvent être toxiques pour certains types de cellules de mammifères,13.
Ampères excellent antimicrobien et immunomodulatrices propriétés14,15, et bactéries semblent très difficile de développer une résistance contre les16. Cependant, le processus pour produire des amplis purs est cher ; par conséquent, une production à grande échelle n’est pas viable. Ainsi, des stratégies pour contrer les problèmes dans la production d’amplificateurs ont été mis au point (p. ex., petites peptoid antibactérien moléculaire imite17, peptoids18, α-peptides19 et β-peptides20). Polypeptoids et polypeptides méthacrylate à composition non limitée ont été synthétisés pour antimicrobien et antifouling coatings21.
Le développement de nouveaux agents antimicrobiens tels que les matériaux de pointe en pure ou forme hybride, capable de prévenir et traiter les infections pharmaco-résistante, est de plus en plus nécessaire. Une large gamme de nouveaux matériaux avancés pour les nombreux domaines de la bio-ingénierie comme tissu et génie des bioprocédés ont été développés avec des propriétés chimiques et physiques améliorées au cours des dernières décennies via plusieurs méthodes : plasma-polymérisation greffage sur un substrat hydrophobe22,23,24, l’adaptation de la densité de réticulation25,26, la polymérisation en solution27,28,29 , 30, porogen dissolution31,32et par l’incorporation des nanomatériaux comme le graphène oxyde (aller)33,34,35,36 et carbone nanofibres (CNFs)37.
L’étude de la capacité antimicrobienne de ces nouveaux matériaux pourrait augmenter exponentiellement leur applicabilité éventuelle de la bioingénierie et est, par conséquent, devenue indispensable. Nous présentons un protocole facile à suivre afin de quantifier l’activité antimicrobienne de ces nouveaux matériaux avancés. Ici, après la préparation de l’échantillon, deux méthodes complémentaires sont suivies : la première repose sur la gélose disque diffusion test38 (méthode de diffusion) et le second est basé sur la norme de 22196:2007 ISO39 pour mesurer l’activité antimicrobienne sur surfaces des matériaux (méthode de contact).

<table><tbody><tr><td>Poinçon cylindrique&nbsp ;</td><td></td><td></td> Boîtes de Pétri de <td>10 mm de diamètre</td></tr><tr><td></td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm de diamètre, stérile</td></tr><tr><td>Gélose tryptique au soja (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Milieu déshydraté 500 g (poudre</td></tr><tr><td>)Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Milieu déshydraté 500 g (poudre)</td></tr><tr><td>Coton-tige stérile</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse tubes</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, stérile</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Éthanol absolu</td></tr><tr><td>Plaque stérile 48 puits</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Fond plat avec couvercle, traité par culture tissulaire, apyrogène, polystyrène</td></tr><tr><td>Une paire de pinces à épiler</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Four sous vide avec pompe à vide connectée</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W Lampe de rayonnement UV-C</td></tr><tr><td>Classe II Armoire de sécurité biologique</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Spectrophotomètre Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel, Allemagne</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Bec Bunsen</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Brûleur à alcool</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>Dans le cas où la stérilisation doit être effectuée à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique de classe II</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Pied à coulisse numérique</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, stérile</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, stérile</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, stérile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L, plastique 20-200 & micro ; L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 & micro ; </td></tr><tr><td>L Micropipette&nbsp ;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pointes de micropipette</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &micro ; L</td></tr><tr><td>Pointes de micropipette</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 & micro ; L</td></tr><tr><td>Tube pré-stérilisé&nbsp ;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&nbsp ;</td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>Tout appareil photo haute résolution peut également être utilisé</td></tr> <tr><td>Bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus</td><td></td><td>&nbsp ; souche V329</td><td>Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),&nbsp ; 2888&ndash ; 2896 (2001)</td></tr><tr><td>Bactéries à Gram négatif Escherichia coli</td><td>Colecci&oacrace ; n Espa&ntilde ; ola de Cultivos Tipo CECT CECT</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Levure Candida albicans</td><td>Colecci&oacute ; n Espa&ntilde ; ola de Cultivos Tipo CECT CECT</td><td>1394</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation&nbsp ;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre-cuvettes</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Spatule Drigalski</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Stérile, jetable&nbsp ;</td></tr><tr><td>billes de verre (2 mm de diamètre)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Autoclavable, dispositif alternatif à la spatule Drigalski</td></tr><tr><td>Sacs autoclave</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>Pour stériliser les résidus microbiologiques ou les matériaux contaminés</td></tr><tr><td>Dispositif de remplissage de pipette électronique</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de laboratoire avec filetage ISO, gradué, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, pour milieu de culture en autoclave</td></tr><tr><td>Flacon de laboratoire avec filetage ISO, gradué, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, pour milieu de culture en autoclave</td></tr><tr><td>Flacon de laboratoire avec fil ISO, gradué, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, pour milieu de culture en autoclave</td></tr><tr><td>Flacon de laboratoire avec fil ISO, gradué, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, pour milieux de culture en autoclave</td></tr><tr><td>Gants en latex</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Ruban indicateur pour la stérilisation</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Ruban auto-adhésif avec du papier imprégné qui vire à la couleur lorsqu’il est exposé au processus de stérilisation.</td></tr><tr><td>Rack universel pour tubes à essai</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>Pour maintenir les tubes à centrifuger</td></tr><tr><td>Rack pour tubes à microcentrifuger</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>Pour maintenir les tubes à microcentrifuger</td></tr><tr><td>Boucle stérile</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 et micro ; L de capacité pour la culture microbienne&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matière M1</td><td>Universidad Cat&oacute ; lica de Valencia San Vicente M&aacute ; rtir (UCV)</td><td></td><td>Type de matériau 1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matière M2</td><td>Universidad Cat&oacute ; lica de Valencia San Vicente M&aacute ; rtir (UCV)</td><td></td><td>Type de matériau 2&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matériel : M3</td><td>Universidad Cat&oacute ; lica de Valencia San Vicente M&aacute ; rtir (UCV)</td><td></td><td>Type de matériau3</td></tr><tr><td>Matériau M4</td><td>Universidad Cat&oacute ; lica de Valencia San Vicente M&aacute ; rtir (UCV)</td><td></td><td>Type de matériau 4&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matière C</td><td>Universidad Cat&oacute ; lica de Valencia San Vicente M&aacute ; rtir (UCV)</td><td></td><td>Matériau de contrôle</td></tr></tbody></table>

antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des applications de bio-ingénierie

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Le développement de nouveaux matériaux avancés avec des propriétés améliorées devient de plus en plus important dans un large éventail d’applications de la bio-ingénierie. Ainsi, de nombreux nouveaux biomatériaux est conçus pour imiter les environnements spécifiques requis pour des applications biomédicales telles que l’ingénierie tissulaire et de la livraison de drogue contrôlée. Le développement de matériaux aux propriétés améliorées pour l’immobilisation des cellules ou des enzymes est également un sujet de recherche actuels en génie des bioprocédés. Cependant, une des propriétés plus désirables d’un matériau dans ces applications est la capacité antimicrobienne pour éviter toute infection indésirables. Pour ce faire, nous présentons des protocoles facile à suivre pour la caractérisation antimicrobienne des matériaux à base de (i) le critère de diffusion disque agar (méthode de diffusion) et (ii) la norme de 22196:2007 ISO pour mesurer l’activité antimicrobienne sur les surfaces des matériaux (contact méthode). Ce protocole doit être effectué à l’aide de bactéries Gram-positives et Gram-négatives et la levure pour couvrir un large éventail de microorganismes. À titre d’exemple, 4 des matériaux avec différentes natures chimiques sont testés suivant ce protocole contre Staphylococcus aureus, Escherichia coliet Candida albicans. Les résultats de ces tests montrent une activité non antimicrobiens pour la matière première et en augmentant l’activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives pour les 3 autres matériaux. Toutefois, aucun des 4 matières sont capables d’inhiber la croissance de Candida albicans.

Ce protocole a été employé, à titre d’exemple, pour tester la capacité antimicrobienne de 4 matériaux avec différentes natures chimiques contre les 3 recommandé microorganismes : Staphylococcus aureus, Escherichia coliet Candida albicans . Les résultats des tests agar disque diffusion (méthode de diffusion) a présenté une activité non antimicrobiens pour la matière première (M1) car elle a eu lieu dans le disque de contrôle (C, image ne pas montrée) et en augmentant l’activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives bactéries pour les 3 autres matériaux M2, M3 et M4 (voir Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Figure 2 : résultats de méthode de diffusion antimicrobiens. Ce panneau indique la méthode de diffusion aux antimicrobiens pour les 4 matières (M1, M2, M3 et M4) disques (diamètre 10 mm x 1 mm d’épaisseur) contre s. aureus et Escherichia coli après 24 h d’incubation. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 3 montre les différentes largeurs normalisées de l’antimicrobien « halo » (nwhalo), pour les matériaux différents exemple M1, M2, M3 et M4 contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, calculé avec l’équation (1). Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de la levure Candida albicans (images non illustrés).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Figure 3 : résultats de diffusion aux antimicrobiens « halo ». Ce panneau montre le normalisée « halo » (nwhalo) pour chaque disque (M1, M2, M3 et M4) matérielle (diamètre 10 mm x 1 mm d’épaisseur) contre s. aureus et Escherichia coli après 24 h d’incubation. Les différences sont statistiquement significatives (p &lt; 0,01). Cependant, l’échantillon M1 ne présentait aucune activité antimicrobienne. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Les résultats de la méthode de contact a également une activité non antimicrobiens pour la matière première (M1) car elle a eu lieu dans le disque de contrôle (C) et la croissante activité antibactérienne contre Grampositive et bactéries à Gram négatif pour les 3 autres matériaux (voir La figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Figure 4 : antimicrobienne contacter les résultats de la méthode. Ce panneau montre les plaques respectives de 90 mm du 4 matière (M1, M2, M3 et M4) surface activité antimicrobienne dosage selon l’ISO 22196:2007 après 24 h d’incubation pour Staphylococcus aureus et Escherichia coli (facteur de dilution de 10-4). C est la bactérie viable, récupérée à partir du disque de contrôle après 24 h d’incubation. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La perte de viabilité (%) a été déterminée par l’équation (2) et (3) comme indiqué dans le présent protocole (voir Figure 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Figure 5 : perte de viabilité par la méthode de contact. Ce panneau montre la perte de viabilité (%) pour le M1, M2, M3 et M4 contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli sur les surfaces des matériaux. M1 de l’échantillon n’exposé aucune activité antimicrobienne. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de la levure Candida albicans par la méthode de contact soit (non illustrés d’images). Par conséquent, 3 de ces 4 matériaux avancés a montré des résultats positifs antimicrobiens contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives et donc pourrait être très utile pour de nombreuses applications de la bio-ingénierie avec les exigences de haute activité antibactérienne. Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de levure.

Nous présentons un protocole pour la caractérisation antimicrobienne des matériaux avancés. Ici, l’activité antimicrobienne sur les surfaces des matériaux est mesurée par deux méthodes qui se complètent mutuellement : une repose sur le test de diffusion sur disque, et l’autre est une procédure standard basée sur la norme de 22196:2007 ISO.

Antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des Applications de bio-ingénierie

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie des matériaux, telles que les propriétés antimicrobiennes, qui sont très souhaitables pour de nombreuses applications de bio-ingénierie. Cette technique peut être utilisée comme protocole cohérent dans tous les laboratoires pour aider les chercheurs moins expérimentés qui ont besoin de procédures approfondies étape par étape à suivre pour obtenir des résultats précis. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à chercher des protocoles antimicrobiens, et nous nous sommes rendu compte qu’il n’y avait pas de protocoles détaillés sur celui-ci dans la littérature.Dans cette étude, quatre matériaux avancés de natures chimiques différentes et un matériau de contrôle seront testés pour leur activité antimicrobienne. Préparez chaque matériau en le découpant en disques de 10 mm de diamètre. Ensuite, stérilisez chaque échantillon par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes, puis par rayonnement ultraviolet pendant une heure de chaque côté.Trois micro-organismes différents seront utilisés pour tester l’activité antimicrobienne des matériaux avancés. Les bactéries à Gram positif, Staphylococcus aureus, les bactéries à Gram négatif, Escherichia coli, et les levures, Candida albicans. À l’aide d’un coton-tige stérile, remettre en suspension quelques colonies de chaque micro-organisme dans 25 ml de bouillon de soja tryptique, ou TSB, contenu dans un tube à centrifuger stérile.Agitez pendant une minute pour obtenir un mélange uniforme. Mesurer l’absorbence à 540 nm pour chaque culture de micro-organismes à l’aide d’un spectrophotomètre. Ajustez la concentration de chaque micro-organisme à un nombre approprié d’unités formant colonies, ou UFC par millilitre.Agitez la suspension microbienne pendant cinq secondes pour améliorer la dispersion des micro-organismes, et immergez brièvement un coton-tige stérile dans cette suspension microbienne. Retirez l’excès de liquide de l’écouvillon en pressant l’écouvillon contre la paroi du tube contenant la culture. Étalez uniformément chaque suspension de bouillon microbien avec le coton-tige stérile sur la surface d’une gélose de soja tryptique, ou plaque TSA, sur trois plans pour couvrir toute la surface avec le micro-organisme.Laissez sécher les plaques pendant cinq minutes après l’inoculation. Laissez les suspensions de bouillon microbien sur la paillasse pour une utilisation ultérieure afin de vérifier la concentration et la pureté de la suspension microbienne. Stérilisez une pince à épiler en l’immergeant dans un bécher avec de l’éthanol à 96 %, puis en l’enflammant avec un brûleur à alcool.À l’aide de la pince à épiler stérile, placez les disques d’échantillon à tester au centre des plaques TSA. Incuber les plaques TSA en position inversée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour analyser les résultats du test de diffusion, mesurez le diamètre de la zone d’inhibition et le diamètre du disque d’échantillon à l’aide d’un pied à coulisse numérique, ou en prenant une photo et en utilisant un logiciel de traitement d’image approprié.Cette procédure est nécessaire pour vérifier que les concentrations microbiennes déterminées précédemment sont correctes et pour s’assurer de l’absence de contamination microbienne de l’environnement. À l’aide d’une micropipette avec des pointes autoclavées appropriées et dans des conditions aseptiques, distribuez le TSB stérile dans des tubes de microcentrifugation stériles. Incluez un échantillon qui sera utilisé comme témoin négatif.Effectuez des dilutions en série de six décimales avec les suspensions de bouillon microbien utilisées précédemment pour le stries des plaques TSA. À l’aide d’une spatule Drigalski pré-stérilisée, étaler 100 l de chaque dilution sélectionnée sur une plaque TSA. Étaler 100 l de milieu TSB sans micro-organisme sur une plaque TSA comme témoin négatif.Incuber les plaques TSA à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour vérifier que l’UFC par millilitre est similaire à celle déterminée précédemment. Vérifiez la plaque de contrôle négative pour confirmer qu’il n’y a pas de contamination microbienne de l’environnement.Commencez cette procédure par la culture des différents micro-organismes à tester dans le TSB, dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mesurer la DO 540 de chaque culture de nuit, puis diluer chaque culture dans 20 mL de BST dans un tube à centrifuger pré-stérilisé de 50 mL jusqu’à une concentration d’environ dix à six UFC par millilitre. Placez quatre disques de chaque type de matériau et quatre disques de contrôle dans des puits séparés d’une plaque stérile à 48 puits.Pipeter 150 l de la suspension microbienne sur chaque surface du disque. Incuber la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation de la plaque à 48 puits pendant 24 heures, pipetez 850 l de PBS stérile sur la surface de chacun des quatre disques d’échantillon et des quatre disques de contrôle, et mélangez-le avec la suspension microbienne.Prélever chaque mélange de suspension microbienne PBS et chaque disque de la plaque à 48 puits, puis transférer dans un tube pré-stérilisé de 15 ml. Vortex les mélanges et disques de suspension microbienne PBS pendant une minute. Sonicer à 50 Hz pendant cinq minutes et agiter à nouveau pendant une minute pour s’assurer qu’aucun micro-organisme viable n’adhère à la surface du matériau.Effectuer des dilutions décimales en série des cultures soniquées et des tubes de microcentrifugation stériles contenant du BST. Étalez 100 l de chaque dilution sur une plaque TSA et incubez les plaques en aérobie à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, comptez le nombre de colonies et exprimez ce nombre en UFC par millilitre.Les résultats de la méthode de contact sont ensuite analysés comme décrit dans le protocole texte. Les résultats des tests de diffusion sur disque de gélose montrent une activité non antimicrobienne pour le premier matériau et une activité antibactérienne croissante contre S. aureus et E. coli pour les trois autres matériaux. Ce graphique montre le halo normalisé de chaque disque de matériau contre S. aureus et E. coli après 24 heures d’incubation.Les résultats de la méthode de contact indiquent également une activité non antimicrobienne pour le premier matériau et une activité antibactérienne accrue contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif pour les trois autres matériaux. C est la bactérie viable récupérée du disque témoin après 24 heures d’incubation. Ce graphique montre le pourcentage de perte de viabilité des quatre matériaux contre S. aureus et E. coli à la surface des matériaux.L’échantillon M1 n’a montré aucune activité antimicrobienne. Bien que cela ne soit pas montré ici, aucun des quatre matériaux n’est capable d’inhiber la croissance de la levure, Candida albicans, par d’autres méthodes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer l’activité antimicrobienne par ces deux méthodes complémentaires.

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