Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’analyser l’activité métabolique d’un échantillon biologique et de déterminer dans quelle mesure les voies anaérobies contribuent à la production d’énergie cellulaire dans l’échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine pharmaceutique sur l’étendue de la toxicité mitochondriale lors du développement de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la mesure simultanée de la consommation d’oxygène et de la production de chaleur dans un échantillon de cellule d’intérêt.

Cette méthode peut donc donner un aperçu de la planification du traitement pendant le développement pharmaceutique. Il peut également être appliqué à d’autres domaines, tels que la cyrobiologie dans laquelle les effets du préconditionnement métabolique sur la cryoconservation peuvent être évalués. Pour préparer le respiromètre, ajoutez d’abord deux virgule deux millilitres de DMEM dans chaque chambre de respiromètre et insérez complètement les bouchons.

Ajustez les bouchons à l’aide d’un outil d’espacement pour permettre une diffusion optimale de l’oxygène dans le milieu, et réglez les chambres pour agiter en continu les échantillons à 750 tr/min à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la concentration d’oxygène et le flux d’oxygène soient stables. Confirmez que le logiciel du respiromètre est programmé pour tenir compte de la solubilité à l’oxygène du milieu utilisé dans l’expérience. Sélectionnez ensuite une partie stable de la trace de concentration d’oxygène et calibrez cette partie pour une saturation en air de 100 %.

Maintenant, fermez les bouchons en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans les chambres. Après environ 10 minutes, un flux d’oxygène stable doit être observé. Pour vous préparer à la calorimétrie, ajoutez d’abord deux virgule cinq millilitres d’eau désionisée dans l’ampoule de référence, puis serrez le bouchon.

À l’aide d’une pompe à air, retirez les débris externes de l’ampoule, puis abaissez lentement l’ampoule pour la positionner dans le canal de référence du calorimètre. L’ampoule restera en position un jusqu’à ce que l’ampoule contenant l’échantillon de cellule ait été préparée. Le DMEM, utilisé pour la calorimétrie, doit être équilibré dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée et 5 % de CO2.

Commencez l’expérience en ajoutant trois millilitres de DMEM dans une plaque de 100 millilitres pour chaque ampoule calorimétrique qui sera utilisée, et placez la plaque dans l’incubateur jusqu’à ce que l’échantillon soit prêt pour la calorimétrie. Pendant que le milieu s’équilibre, utilisez un microscope inversé pour sélectionner une plaque avec des cellules HepG2 qui sont entre 60 et 80 % confluentes et distribuées de manière homogène. Tout d’abord, retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS.

Ajoutez trois millilitres de trypsine préchauffée à 37 degrés Celsius et incubez la plaque à 37 degrés Celsius. Après sept à 10 minutes d’incubation, neutralisez la réaction enzymatique avec les trois millilitres de DMEM à 37 degrés Celsius et utilisez une pipette de cinq millilitres pour dissocier doucement les cellules en une suspension unicellulaire. Transférez les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres pour la centrifugation, et remettez la palette en suspension dans environ cinq millilitres de DMEM frais.

Pipetez soigneusement les cellules pour désagréger les amas de cellules et, après le comptage, concentrez les cellules à environ deux millions de cellules par 50 microlitres de milieu. La reproductibilité de cette méthode dépend de l’uniformité et de la précision du comptage des cellules. Il est essentiel de s’assurer que l’échantillon est homogène et que les cellules ne sont pas agglutinées à aucun moment de l’analyse.

Ensuite, stockez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à effectuer des mesures respirométriques et calorimétriques. Avant la mesure calorimétrique, vérifiez que le calorimètre est connecté à l’ordinateur et que le signal calorimétrique est stable et en microwatts. Diluez les cellules à 100 000 cellules par millilitre dans le milieu équilibré qui a été placé dans l’incubateur avant la préparation de l’échantillon.

Ajoutez ensuite deux virgule cinq millilitres de solution cellulaire dans chaque ampoule, en confirmant qu’un volume d’air suffisant est maintenu entre les couvercles des ampoules et le milieu pour permettre la diffusion du gaz. Serrez immédiatement les capuchons et nettoyez les ampoules scellées à l’air pour éliminer tous les débris externes. Ensuite, abaissez lentement l’ampoule scellée avec l’échantillon de cellule pour positionner l’un des calorimètres.

Mélangez soigneusement l’échantillon pour assurer une solution homogène et injectez deux millions de cellules dans chaque chambre fermée du respiromètre sous agitation continue. Après 15 minutes à la position un dans le calorimètre, abaissez lentement l’ampoule de référence et l’ampoule avec les cellules jusqu’à la position deux et notez l’heure de descente. 10 à 15 minutes après l’injection des cellules dans le respiromètre, une stabilisation du flux d’oxygène et une diminution constante de la concentration d’oxygène doivent être observées.

Pour déterminer la respiration de fuite, injectez un microlitre de quatre milligrammes d’oligomycine par millilitre dans chaque chambre et laissez le flux d’oxygène se stabiliser pendant environ 10 minutes, en enregistrant le taux de respiration stable de fuite comme nous venons de le démontrer. Ensuite, pour déterminer le flux maximal, injectez deux microlitres de FCCP millimolaire à virgule zéro deux millimolaires dans la chambre, en laissant le flux d’oxygène se stabiliser après chaque injection, et en continuant les titrages jusqu’à ce que le flux maximal soit atteint. Enregistrez le rythme respiratoire stable pendant le flux maximal.

Lorsque la chambre du respiromètre fonctionne avant la mesure de l’échantillon, la concentration d’oxygène et les traces de flux d’oxygène doivent être stables. Une fois que l’ampoule a été abaissée en position deux, une période de temps peut être identifiée pendant laquelle la production de chaleur est stable, et une période correspondante peut être identifiée pendant laquelle le flux d’oxygène est stable, pour permettre le calcul du rapport calorespirométrique. Si les cellules HepG2 sont cultivées en l’absence de glucose et que le galactose est complété pour augmenter l’implication mitochondriale, les cellules ne prolifèrent pas à l’intérieur du calorimètre, mais diminuent plutôt leur activité métabolique après environ 30 minutes dans l’ampoule, limitant le calcul calorespirométrique au premier moment où la dissipation de chaleur a été mesurée.

Il est essentiel d’enregistrer le temps pendant lequel les cellules sont pipetées dans l’ampoule afin que les mesures de la production de chaleur et de la consommation d’oxygène soient collectées à des points de temps identiques, car il faut environ 15 minutes pour que le flux d’oxygène se stabilise et que la concentration d’oxygène diminue régulièrement. Comme le flux d’oxygène stabilisé des cellules sert de substitut à la consommation d’oxygène lors du calcul du rapport calorespirométrique, des titrages supplémentaires peuvent être effectués pour évaluer la respiration de fuite, qui est indiquée par une baisse du flux d’oxygène et la respiration découplée maximale, qui est indiquée par un échec à augmenter la respiration avec des titrages FCCP successifs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de quatre heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que d’autres lignées cellulaires peuvent avoir des propriétés métaboliques différentes. Par conséquent, chaque nouvelle lignée cellulaire doit être optimisée pour ses mesures calorimétriques et respiratoires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les cellules HepG2 pour la calorespirométrie afin d’assurer un étalonnage instrumental correct et de mener correctement une expérience calorespirométrique.