Name: Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez la calorespirométrie pour analyser le métabolisme énergétique cellulaire en mesurant simultanément la consommation d'oxygène et la production de chaleur. Cette méthode non invasive aide à évaluer la toxicité mitochondriale.

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Ce travail a été financé en partie par la subvention de la National Science Foundation CHE-160944 à Mary E. Konkle et Michael A. Menze.

1. Culture cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules de carcinome (HepG2) hépatocellulaire humaine au moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et autres substrats (glucose 10 mM, 2 mM de glutamine et pyruvate de 1 mM) à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire (5 % CO2 , air de 95 %, 100 % d’humidité). Remarque : Utilisez la formulation DMEM ci-dessus lorsque DMEM est référencée dans les étapes ultérieures de respirométrie et calorimétrie.</li>
	<li>Plaque des cellules à 1 x 106 cellules par plaque de 100 mm culture et sous-culture eux tous les 7 jours, ou avant d’atteindre 90 % confluence et renouveler le milieu tous les 3-4 jours.</li>
	<li>Réaliser les expériences lorsque les cellules sont confluents de 60 à 80 %.</li>
</ol>2. préparation du respiromètre et calorimètre
<ol><li>Pipeter 2,2 mL de DMEM dans la chambre de respiromètre, insérer le bouchon pleinement et l’ajuster avec l’outil d’entretoise bouchon permettant la diffusion de l’oxygène optimale de l’air au milieu.</li>
	<li>Remuer constamment à 37 ° C jusqu'à ce que la concentration en oxygène (trace bleue) et le flux d’oxygène (trace rouge) sont stables. S’assurer que le logiciel du respiromètre est programmé pour tenir compte de la solubilité de l’oxygène du milieu utilisé dans l’expérience. Remarque : Différents médias ont des coefficients de solubilité d’oxygène différents (p. ex., DMEM = 0,92).</li>
	<li>Après la stabilisation de la concentration en oxygène en DMEM lorsque la chambre est ouverte, sélectionner une partie stable de la trace de concentration de l’oxygène et étalonner pour la saturation de l’air de 100 %.</li>
	<li>Calibrer pour 0 % d’oxygène en sélectionnant une partie stable de la trace de concentration de l’oxygène lorsque aucun oxygène n’est présent dans la chambre. Effectuez cette étape après 20 titrage µL de dithionite de sodium 230 mM ou après que tout l’oxygène est consommé par l’échantillon biologique à la fin d’une expérience.</li>
	<li>Après l’étalonnage de 100 % d’air de la respiromètre, fermez le bouchon et veiller à ce qu’aucune bulle n’est présents dans l’hémicycle. Remarque : une légère augmentation de flux d’oxygène sera détectée dans la chambre fermée comme le capteur d’oxygène polarographique (POS) consomment l’oxygène afin de mesurer la pression partielle d’oxygène.</li>
	<li>Après environ 10 min du bouchon étant fermé, confirmer que le respiromètre est prêt pour les cellules HepG2 en observant un flux d’oxygène stable. Remarque : Le calorimètre utilisé ici utilise des ampoules en acier inoxydable et nécessite une ampoule à utiliser comme référence.</li>
	<li>Ajouter 2,5 mL de H2O (dH2O) [volume égal que les échantillons (étape 4)] à l’ampule de référence du calorimètre et serrer le bouchon, si nécessaire, utiliser des pinces. Nettoyer l’ampoule scellée avec circulation d’air et abaisser lentement l’ampoule sur la position 1 dans la chaîne de référence du calorimètre. Restent en position 1 jusqu'à ce que l’échantillon biologique est préparé.</li>
</ol>3. préparation des cellules HepG2 respirométrie et calorimétrie
<ol><li>Confirmer que le respiromètre calorimètre sont apprêtés et calibré. Chaud DMEM et trypsine à 37 ° C dans un bain d’eau.</li>
	<li>Ajouter DMEM à un frais 100 mm plaque et les placer dans un incubateur pour permettre l’équilibration du milieu pour le CO2 et de température. Remarque : Ce moyen de communication sera utilisé pour l’expérience de la calorimétrie, donc le volume approprié dépend du nombre d’ampoules qui sera utilisé.</li>
	<li>Confirmez avec un microscope inversé de lumière que les cellules sont au confluent de 60 à 80 %, puis lavez le 100 mm plaque de 2 x 10 ml d’une solution saline température ambiante tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Ajouter 3 mL de la trypsine de-37 ° C sur la plaque de 100 mm des cellules et les incuber pendant 7 à 10 min à 37 ° C dans l’incubateur de culture cellulaire. Neutraliser la trypsine avec 3 mL de-37 ° C DMEM et suspendez la doucement il pipetage ~ 20 fois avec une pipette de 5 mL.</li>
	<li>Transférer le 6 mL de cellules resuspendues dans DMEM et trypsine dans un tube conique stérile de 15 mL et il centrifuger à 5 min à 175 x g. supprimera le liquide sans déranger le culot cellulaire.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans environ 5 mL de DMEM et pipette soigneusement pour s’assurer que les cellules sont suffisamment dissocié de l’autre.</li>
	<li>Enlever les ~ 100 µL de l’échantillon bien mélangé et effectuer un nombre de cellules complet utilisant tous les 8 champs sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules. Calculez le volume pour la remise en suspension des cellules afin de générer environ 2 x 106 cellules / µL 50. Remarque : Ceci assurera que 2 x 106 cellules sont ajoutés à chaque chambre du respiromètre avec déplacement moyen minimal.</li>
	<li>Centrifuger les cellules pendant 5 min à 175 x g. remettre le culot dans le volume calculé de DMEM étape 3,7.</li>
	<li>Effectuer un nombre d’éléments pour déterminer le volume nécessaire d’injecter 2 x 106 cellules / chambre dans le respiromètre (cela devrait être ~ 50 µL). Stocker les cellules pour mesurer la respirométrie sur la glace jusqu’au moment.</li>
	<li>Bien que l’échantillon de cellules concentrées sur glace, déterminer la dilution requise pour produire une concentration de 1 x 105 cellules/mL pour la calorimétrie.</li>
	<li>Bien mélanger l’échantillon et préparer environ 3 mL des cellules de 1 x 105 cellules/mL dans du DMEM pour chaque ampoule. Remarque : Le DMEM utilisé pour la dilution de l’échantillon doit être le milieu équilibré préparé à l’étape 3.3.</li>
</ol>4. la calorimétrie
<ol><li>Assurez-vous que le calorimètre est connecté à l’ordinateur et le signal calorimétrique en µW est observable et stable.</li>
	<li>Ajouter 2,5 mL des cellules à 1 x 105 cellules/mL (~2.5 x 105 cellules) à chaque ampoule, assurant suffisamment d’air se situe entre le couvercle de l’ampoule et le support permettant la diffusion de gaz.</li>
	<li>Immédiatement, bien serrer le bouchon, si nécessaire, utiliser des pinces. Nettoyer l’ampoule scellée, à l’aide de flux d’air pour enlever tous les débris extérieurs et abaisser lentement l’ampoule sur la position 1 du calorimètre. Noter le temps que l’ampoule est abaissé sur la position 1.</li>
	<li>Permettre à l’ampoule de s’asseoir en position 1 pendant 15 min. Remarque : Pendant cette période de 15 min, les cellules sont être injecté dans le respiromètre (étape 5). Cela garantit que le même intervalle de temps est utilisé pour la production de chaleur et consommation d’oxygène lorsque le rapport de CR est déterminé.</li>
	<li>Après 15 min en position 1, abaissez lentement la référence et l’échantillon des ampoules sur la position 2. Noter le temps que les ampoules ont été abaissés et mesure pendant au moins 30 min.</li>
</ol>5. respirométrie
<ol><li>Au cours de l’intervalle de 15 min dans laquelle l’ampoule est en position 1 dans le calorimètre, commencent les études respirométriques.</li>
	<li>Bien mélanger l’échantillon cellulaire en pipettant également, afin d’assurer une solution homogène et injecter < 50 µL de l’échantillon de cellules dans chaque chambre du respiromètre pour une concentration finale de 2 ~ x 106 cellules/chambre. Noter le temps que les cellules sont injectées dans le respiromètre.</li>
	<li>Après l’injection, les cellules HepG2 sont continuellement brassés à 37 ° C. Attendre au moins 20-30 min pour les deux une stabilisation du flux d’oxygène et une diminution constante de la concentration d’oxygène.</li>
	<li>Cliquez sur l’onglet flux de2 O par V sur la droite de l’écran et le mettre en surbrillance une partie stable du flux d’oxygène. Sélectionnez les marques, puis statistiques et enregistrer des données pour le flux2 O par V. Cet enregistrement sera utilisé dans le calcul du ratio CR. Remarque : Les étapes 5.5 et 5.6 sont facultatives. Fuite la respiration et la respiration maximale découplée seront révélés par les titrages de l’oligomycine et FCCP.</li>
	<li>Injecter 1 µL de l’oligomycine 4mg/mL dans chaque chambre et permettre à ~ 10 min pour la stabilisation des flux d’oxygène. Taux de respiration record fuite stable en suivant les étapes effectuées au point 5.4 en mettant en évidence une partie stable de la trace du flux d’oxygène après l’addition de l’oligomycine.</li>
	<li>Titrer les injections 2 µL de 0,2 mM FCCP dans chaque chambre, permettant une stabilisation flux d’oxygène après chaque injection. Continuer les titrages jusqu'à ce que le flux maximal est atteint, comme il est indiqué par une légère baisse dans le titrage FCCP ultérieur. Enregistrer le taux de respiration stable pendant le flux maximal.</li>
</ol>6. le calcul du Ratio de Calorespirometric
<ol><li>Effectuer un nombre de cellules final des échantillons préparés à ~ 1 x 105 cellules/mL, utilisant tous les 8 domaines d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules ajoutées à l’ampoule (2,5 mL).</li>
	<li>Déterminer un temps aux mesures Records du calorimètre et respiromètre au cours de laquelle les signaux stables sont présents en même temps. Référence que le temps enregistré lorsque l’ampoule a été abaissé à la position 2 et le moment de l’injection de cellules dans le respiromètre.</li>
	<li>La production de chaleur record en plaçant le curseur sur la trace affichant la puissance calorifique pour l’ampule respecté au moment déterminé à l’étape et explicite comme µW/millions de cellules. Recueillir des données sur la consommation d’oxygène et s’assurer qu’elle est exprimée en pmol O2 x s-1 x millions de cellules.</li>
	<li>Pour calculer le taux de CR, commencez par convertir µW kJ/s et puis répartir kJ/s sur mol de O2/s pour obtenir le rapport CR exprimé en kJ/mol O2. NOTE : Le rapport CR est présenté en kJ/mol O2. (voir <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">dossier complémentaire 1</a>)</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’objectif de calorespirometry est d’évaluer quantitativement les contributions des voies aérobies et anaérobies à activité métabolique et d’obtenir une vue composite de flux d’énergie cellulaire. Ceci est accompli par une mesure simultanée de la dissipation de la chaleur et le flux d’oxygène suivie d’une comparaison entre le ratio calculé de CR avec l’oxycaloric théorique équivalente. Plusieurs étapes critiques doivent être considérés pour des données fiables et reproductibles. Le maintien d’une culture de cellules stér...

Dans les systèmes biologiques, le dégagement de chaleur ou enthalpie changement au cours du métabolisme est généralement contrôlé soit directement (via direct calorimétrie) ou indirectement par l’intermédiaire de la consommation de2 O ou la production de CO2 (via respirométrie). Malheureusement, lorsque ces techniques sont utilisées dans l’isolement, information critique est perdue, comme la contribution des voies anaérobies au métabolisme cellulaire. Calorespirometry est une technique puissante qui s’appuie sur la mesure simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration. Calorespirometric travail de pionnier étudié le métabolisme anaérobie dans les cellules de mammifères totalement oxygénés et démontré des cotisations simultanées des voies aérobies et anaérobies à l’homéostasie énergétique malgré les cellules transformées en un environnement complètement oxygéné1. Calorespirometry a depuis lors été appliqué à une grande variété de questions biologiques. Voici quelques exemples : l’étude de l’énergétique animale à faibles teneurs en oxygène, les effets des herbicides et œstrogènes sur les branchies de bivalves, le métabolisme des organismes terrestres et la décomposition microbienne des sols organiques question2, 3 , 4 , 5 , 6. par ailleurs, calorespirometry a révélé comment métabolique préconditionnement avant congélation améliore la cryoconservation de mammifères cellules7. Chaque approche, calorimétrie tant respirométrie, a augmenté indépendamment de notre connaissance de bioénergétique cellulaire et organismique. Cependant, des questions biologiques fondamentales auxquelles on peuvent répondre grâce à l’utilisation de calorespirometry demeurent relativement inexplorées.
Loi de Hess déclare que le changement d’enthalpie totale d’une réaction est indépendant de la voie entre les États initiaux et finaux. Par exemple, le changement d’enthalpie totale pour une voie biochimique est la somme de la variation de l’enthalpie de réaction de tous au sein de la voie. Calorimétrie propose une approche en temps réel pour mesurer la production de chaleur cellulaire, qui permet de détecter sans discernement des voies aérobies et anaérobies. Ceci est basé sur le fondement qu’aucune énergie n’est échangée dans le système, sauf à travers les parois de l' ampoule expérimentales8. Un changement dans la dissipation de chaleur est égal à la variation d’enthalpie, libéré de toutes les réactions métaboliques dans l’ampoule. Ainsi, une enthalpie négative correspond à une perte de chaleur du système. Une recherche exhaustive sur les quatre dernières décennies a caractérisé le paysage thermodynamique du catabolisme et anabolisme. Ceci est représenté par une augmentation régulière des articles de recherche trouvé sous les termes de recherche « biologiques » et « calorimétrie » comme indexée par l’United States National Library of Medicine (NLM) à la National Institutes of Health (PubMed). La recherche révèle qu’avant 1970, un total de 27 publications référence biologique calorimétrique ; pendant ce temps, en 2016 seul, 546 publications a utilisé la technique.
Méthodes calorimétriques sont bien établies pour déterminer la production de chaleur. Cependant, davantage de souplesse est accordée pour régler la valeur respirométriques. La mesure respirométriques peut se composer d’O2, CO2, ou O2 et CO2. En outre, la mesure de O2 ou CO2 peut être accomplie par diverses techniques, dont la consommation, électrodes de type Clark et tunable diode laser absorption spectroscopy7,9,10 ,11. Alors que la production de CO2 est un indicateur précieux dans de nombreuses études respirométriques, le milieu de cellules cultivées utilise souvent un système tampon pH contrôle12,13bicarbonic. Pour éviter les complications de mesure de CO2 dans le système de bicarbonate, le protocole suivant pour la calorespirometry des cellules en culture utilise O2 comme paramètre respirométriques seul.
Parallèlement à la mesure de flux d’oxygène, certaines respiromètres (voir Table des matières) sont conçus pour des évaluations détaillées de la fonction mitochondriale. Substrat-découpleur-inhibiteur-titrages (costume) protocoles sont bien établies et sont compatibles avec les expériences visant à mesurer la membrane potentiels ou réactives de l’oxygène (DRO) formation14. Le protocole présenté pour calorespirometry des cellules intactes est compatible avec l’introduction des découpleurs chimiques tels que le carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et l’oligomycine F0F1-ATP synthase inhibiteur. Grâce à l’ajout de FCCP, consommation d’oxygène peut être découplée de la production d’ATP, ce qui est utile pour évaluer l’impact de la thérapeutique possible sur peformance mitochondrial15. En outre, l’ajout de l’oligomycine éclaire l’ampleur de la respiration de la fuite. Ainsi, les mesures respirométriques effectuées au cours de la calorespirometry sont compatibles avec longs protocoles conçus pour élucider davantage la physiologie mitochondriale.
La mesure simultanée de dissipation de la chaleur et de flux d’oxygène permet le calcul du ratio calorespirometric (CR). Ce ratio est ensuite comparé à une constante de la Thornton ou l’oxycaloric théorique équivalente, qui s’étend entre-430 à-480 kJ mol-1 selon la lignée cellulaire ou tissulaire d’intérêt et le carbone supplémenté substrats1, 16. ainsi, un ratio de CR plus négatif révèle une augmentation des contributions de voies anaérobies à activité métabolique général. Par exemple, le ratio de CR pour la respiration des tissus musculaire systématique sans l’exécution active du travail varie entre -448-468 kJ mol-1, qui se trouve dans la plage du oxycaloric théorique équivalent17,18. Pendant ce temps, des cellules de mammifères cancéreuses cultivées dans un milieu riche en glucose affichent fermentation lactiques renforcée suite à la glycolyse et relativement faible engagement mitochondrial19. Ce résultats de phénotype ratios CR dans la plage de-490 à-800 kJ mol-1, démontrant une implication accrue des voies anaérobies dans le métabolisme cellulaire, comme l’a indiqué plus négatif CR ratios1,7, 16,20.
Distributeurs commerciaux et sans but lucratif, cellulaires et tissulaires actuellement offre des lignées de cellules provenant de plus de 150 espèces, avec presque 4 000 lignées de cellules dérivée de l’homme. Lignées cellulaires immortalisées sont des outils pratiques pour rapidement évaluer la toxicité d’agents thérapeutiques potentiels, dont plusieurs peuvent interférer directement ou indirectement avec les fonctions mitochondriales. À l’aide de cellules transformées au cours de dépistage des drogues peut être une valeur prédictive limitée en partie à cause de l’effet Warburg, une caractéristique de nombreux cancers. Souvent, les cancers génèrent de l’ATP de phosphorylation de substrat-niveau et maintiennent l’équilibre rédox grâce à la production de lactate sans engager pleinement la mitochondrie sous conditions aérobies19. Développement pharmaceutique est notoirement coûteux et inefficaces, avec environ 8 sur 9 composés testés dans des essais cliniques humains parviennent pas à atteindre le marché approbation21. Alors que le potentiel thérapeutique peut transférer dépistage initial en raison de la faible cytotoxicité dans les lignées cellulaires, il est possible que certains de ces composés sont mitotoxic. Sans une méthode appropriée pour détecter comment ces toxines peuvent nuire à l’équilibre de l’énergie dans les cellules primaires qui n’affichent pas l’effet Warburg, information critique est souvent négligée, désengorgement de développement thérapeutique dans les premiers stades.
Calorespirometry est une approche pratique et non invasive d’analyser l’activité métabolique dans une variété d’échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus. Le noyau du protocole présenté est compatible avec un éventail d’applications. Associée à une complication, cependant, a été identifiée. Les cellules immortalisées sont souvent cultivées dans un milieu sans glucose additionné de galactose afin d’accroître la contribution de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour la production d’énergie, afin de sensibiliser les cellules à potentiel mitotoxins22, 23. Cette reprogrammation métabolique semble obscure analyse lorsque les échantillons sont placés dans les ampoules en acier inoxydable utilisés par le calorimètre à15. Les cellules cultivées dans un milieu glucosé continuent à s’engager dans l’activité métabolique intense pendant plusieurs heures. Pendant ce temps, les cellules cultivées dans un milieu galactose diminuent de la production de chaleur dans les 30 minutes de leur placement dans l’ampoule, la mesure limitée aux premiers moments expérimentale. Malheureusement, ce comportement, fait obstacle à l’occasion d’évaluer leur prolifération cellulaire. Malgré cette limitation spécifique, la plupart des applications sont compatibles avec l’analyse calorespirometric et informations métaboliques détaillées peuvent être obtenues grâce à cette approche.

<table><tbody><tr><td>Cellules HepG2</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-8065</td><td>Cellules utilisées pour la calorespirométrie</td></tr><tr><td>O2k-Respirometer</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirometer</td></tr><tr><td>LKB 2277 Moniteur d’activité thermique (TAM)</td><td>Thermométrique AB</td><td></td><td>Thermometric a été acheté par TA Instruments</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Solution 100x ajoutée au milieu DMEM</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Ajouté à 10 % dans le milieu DMEM</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Oligomycine à partir de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>O4876</td><td>Inhibiteur mitochondrial</td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Découpleur mitochondrial</td></tr><tr><td>Corning 100 mm Plat de culture traité TC Corning</td><td>Corporation</td><td>430167</td><td>Plat de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Glucose, poudre</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glucose pour milieu DMEM</td></tr><tr><td>Galactose, poudre</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galactose pour milieu DMEM</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutamine pour milieu</td></tr><tr><td>DMEM sans glucose</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr></tbody></table>

calorespirometry : une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Plusieurs lignées de cellules utilisées dans la recherche biologique et biomédicale fondamentale maintiennent l’homéostasie énergétique grâce à une combinaison de la respiration aérobique et anaérobique. Toutefois, la mesure dans laquelle les deux voies contribuent au paysage de la production d’énergie cellulaire est systématiquement négligée. Les cellules transformées cultivées en saturant les niveaux de glucose souvent montrent une dépendance réduite sur la phosphorylation oxydative pour la production d’ATP, qui est compensée par une augmentation de la phosphorylation au niveau du substrat. Ce changement dans l’équilibre métabolique permet aux cellules de proliférer malgré la présence de toxines mitochondriales. En négligeant la poise altérée métabolique des cellules transformées, les résultats d’un criblage pharmaceutique peuvent être mal interprétés depuis le potentiellement mitotoxic effets peuvent ne pas être détectés modèle de lignées de cellules cultivées en présence de forte concentration de glucose concentrations. Ce protocole décrit le couplage des deux techniques puissantes, respirométrie et calorimétrie, qui permet l’évaluation quantitative et non invasive des aérobies et anaérobies contributions à la production d’ATP cellulaire. Respiration aérobie et anaérobie génère de la chaleur qui peut être surveillé par calorimétrie. Pendant ce temps, mesurer le taux de consommation d’oxygène peut évaluer l’ampleur de la respiration aérobie. Lorsque la dissipation thermique et consommation d’oxygène sont mesurés en même temps, le ratio de calorespirometric peut être déterminé. La valeur expérimentale obtenue peut alors être comparée à l’équivalent d’oxycaloric théorique et l’étendue de la respiration anaérobie peut être jugée. Ainsi, calorespirometry fournit une méthode unique pour analyser un large éventail de questions biologiques, y compris le développement de médicaments, la croissance microbienne et fondamentaux bioénergétiques normoxique et des conditions d’hypoxie.

La reproductibilité des mesures de calorespirometric repose sur une préparation adéquate et cohérente. Échantillons préparés à partir de cultures cellulaires ne devraient pas servir si les plaques sont envahis par la végétation, des numérations globulaires peuvent devenir inexactes en raison de l’agglutination. Par ailleurs, les flux de chaleur réduite en raison de la diffusion limitée de substrat dans les cellules regroupées peuvent se produire. Par conséquent, lors de l’utilisation de cellules adhérentes, il est essent...

Ce protocole décrit le calorespirometry, la mesure directe et simultanée de dissipation de la chaleur et la respiration, qui fournit une approche non invasive pour évaluer le métabolisme énergétique. Cette technique est utilisée pour évaluer la contribution des voies aérobies et anaérobies à l’utilisation de l’énergie en contrôlant le flux d’énergie cellulaire totale.

Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’analyser l’activité métabolique d’un échantillon biologique et de déterminer dans quelle mesure les voies anaérobies contribuent à la production d’énergie cellulaire dans l’échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine pharmaceutique sur l’étendue de la toxicité mitochondriale lors du développement de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la mesure simultanée de la consommation d’oxygène et de la production de chaleur dans un échantillon de cellule d’intérêt.Cette méthode peut donc donner un aperçu de la planification du traitement pendant le développement pharmaceutique. Il peut également être appliqué à d’autres domaines, tels que la cyrobiologie dans laquelle les effets du préconditionnement métabolique sur la cryoconservation peuvent être évalués. Pour préparer le respiromètre, ajoutez d’abord deux virgule deux millilitres de DMEM dans chaque chambre de respiromètre et insérez complètement les bouchons.Ajustez les bouchons à l’aide d’un outil d’espacement pour permettre une diffusion optimale de l’oxygène dans le milieu, et réglez les chambres pour agite

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Une description d'une méthode de profilage de la fonction mitochondriale dans les cellules est fournie. Le profil mitochondrial généré fournit quatre paramètres de la fonction mitochondriale qui peuvent être mesurées dans une expérience: le taux de respiration basale, l'ATP lié respiration, fuite de protons, et la capacité de réserve.

Expérience profil bioénergétique utilisant cellules C2C12 de myoblastes

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

L’état métabolique des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (H-RPE) reflète leur santé et leur fonction. Un protocole optimisé pour examiner le flux métabolique en temps réel de H-RPE à l’aide de la respirométrie à haute résolution est présenté ici.

Analyse en temps réel de la bioénergétique dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines primaires à l’aide de la respirométrie à haute résolution

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

L’abus d’alcool altère l’immunité des macrophages alvéolaires (MA) en raison de la suppression de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique. Nous avons récemment démontré que l’exposition à l’éthanol (EtOH) augmente la dépendance à la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA. Dans le présent document, des méthodes sont fournies pour déterminer l’utilisation de la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA traités à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de...

Évaluation de la glutamine comme source de carburant pour les macrophages alvéolaires exposés à l’éthanol chronique à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire

Nous présentons une méthode non invasive et en temps réel pour surveiller la santé mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance (RRS). Nous avons utilisé le RRS pour quantifier les états redox mitochondriaux et développé une métrique de la santé mitochondriale, le rapport mitochondrial réduit par résonance Raman (3RMR), qui montre une réponse plus rapide aux variations d’oxygénation que les analytes hémato-gaz traditionnels.

Évaluation en temps réel et non invasive de la fonction mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance

Dans ce rapport, nous décrivons la peau en trois dimensions de reconstruire le modèle qui imite la peau humaine dans l'architecture et la composition. La physiologie des mélanocytes, la progression du mélanome et le destin des cellules souches dermiques ont été étudiés en utilisant la peau de reconstruire le modèle. Le modèle est également utile comme outil pour l'évaluation préclinique de médicaments.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Découvrez la calorespirométrie pour analyser le métabolisme énergétique cellulaire en mesurant simultanément la consommation d'oxygène et la production de chaleur. Cette méthode non invasive aide à évaluer la toxicité mitochondriale.

Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

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