La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

L’objectif global de cette procédure est de générer une reconstruction 3D de la peau humaine pour les études de biologie des mélanocytes, du mélanome et des cellules souches de la peau. Ceci est accompli en enrobant d’abord un insert de plateaux de culture tissulaire avec du collagène bovin neutralisé. La deuxième étape consiste à fabriquer le compartiment dermique cellulaire à partir de fibroblastes et de collagène.

Ensuite, fabriquez le compartiment épidermique à partir de kératinocytes mélangés à des mélanocytes ou à des cellules de mélanome. La dernière étape de la procédure consiste à récolter une reconstruction de la peau au jour 18 et à greffer une reconstruction de la peau sur une souris. En fin de compte, les analyses immunohistochimiques et immunofluorescentes du greffon montrent l’architecture d’une peau normale contenant des mélanocytes, la migration et la différenciation des cellules souches normales et les phénotypes de mélanome spécifiques au stade.

Nous avons développé le modèle de reconstruction cutanée il y a 20 ans parce que nous avons découvert dès le début de nos études que les mélanocytes normaux ou les cellules de mélanome qui sont cultivés sur une boîte se comportent très différemment des cellules qui se trouvent dans un contexte tissulaire. Le modèle de reconstruction de la peau est donc idéal pour nous permettre de voir comment les cellules se déplacent d’un compartiment de la peau à n’importe quel autre endroit. Le mélange de collagène acellulaire préalablement préparé sur de la glace, puis ajoutez un millilitre de la solution jaune paille dans chaque insert d’un six.

Bien le plateau de culture tissulaire incube le plateau pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre au gel de se solidifier. Pendant ce temps, la solution devrait changer de couleur du jaune au rose pendant que le gel solidifie les yeux de trypsine, la fibre humaine de leur flacon de culture avec 0,25 % de tripsin EDTA après cinq minutes. Ajoutez DMEM contenant 10 % FBS pour neutraliser le processus de isation.

Prélever les cellules détachées par centrifugation pendant cinq minutes à 200 G à température ambiante, puis remettre les cellules en suspension à 4,5 fois 10 jusqu’à la cinquième cellule par 1,5 millilitre. DMEM complété par 10 %FBS. Ensuite, remplissez un tube de 50 millilitres avec le mélange de collagène de couche cellulaire préalablement préparé et placez le tube sur de la glace.

Ajoutez 1,5 millilitres de suspension de fibroblastes dans le tube et mélangez. Ajouter trois millilitres de la solution de couche cellulaire jaune paille à chaque insert enduit de couche acellulaire. Ensuite, incubez le plateau de culture tissulaire pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de dioxyde de carbone pendant la période d’incubation.

La couleur de la solution de la couche cellulaire doit également passer du jaune au rose. Une fois que le gel de la couche supérieure s’est solidifié, ajoutez deux millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS à l’intérieur de l’insert dans le plateau de culture tissulaire, et 10 millilitres à l’extérieur de l’insert. Incuber les plateaux de culture tissulaire pendant quatre jours.

En vérifiant le quatrième jour que le gel se contracte, le quatrième jour d’incubation, aspirez le milieu à la fois de l’intérieur et de l’extérieur de chaque insert. Ajoutez deux millilitres de produit de lavage à l’intérieur et 10 millilitres à l’extérieur des inserts pour éliminer le sérum régulier. Ensuite, incubez les plateaux pendant une heure à 37 degrés Celsius pour la génération de l’épiderme.

Tout d’abord, la trypsine est constituée de kératinocytes humains. Ensuite, après cinq minutes, utilisez un inhibiteur de trypsine de soja pour neutraliser la trypsine après avoir fait tourner les cellules détachées à 200 G pendant cinq minutes. Reus suspend la pastille cellulaire à 4,17 fois 10 aux six cellules par millilitre dans la peau.

Reconstruire le milieu un après que les kératinocytes ont été récoltés. Trypsine glace les mélanocytes humains pendant une à deux minutes. Encore une fois, neutralisez la trypsine avec un inhibiteur de la trypsine de soja.

Ensuite, après avoir fait tourner les cellules dans les mêmes conditions qu’auparavant, remettez en suspension la pastille de mélanocytes à 8,3 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans la peau. Reconstruisez également le support un. Ensuite, retirez le produit de lavage de l’intérieur et de l’extérieur de chaque insert d’un plateau de culture tissulaire préparé par couche dermique.

Remplacez le produit de lavage par l’ajout de 1,5 millilitre de peau, reconstruisez le support, un à l’intérieur et 10 millilitres à l’extérieur de chaque insert. Mélangez ensuite 600 microlitres de suspension de cellules kératinocytaires avec 600 microlitres de suspension de mélanocytes. Distribuer 200 microlitres de suspension à cellules mixtes.

Goutte à goutte jusqu’à l’intérieur de chaque insert. Incuber le plateau de culture tissulaire pendant deux jours à 37 degrés Celsius. Après avoir incubé les cellules, aspirez la peau, reconstruisez le milieu un à partir de l’intérieur et de l’extérieur de chaque insert, puis ajoutez deux millilitres de peau, reconstruisez le milieu, deux à l’intérieur et 10 millilitres à l’extérieur de l’insert.

Ensuite, incubez les reconstructions pendant deux jours supplémentaires à 37 degrés Celsius. Après la deuxième incubation de deux jours, aspirez la peau, reconstruisez le milieu deux de l’intérieur et de l’extérieur de chaque insert. Ajoutez maintenant 7,5 millilitres de peau, reconstruisez le milieu trois à seulement l’extérieur des inserts.

Remettez les reconstructions dans l’incubateur et changez la peau. Reconstruisez le milieu trois tous les deux jours jusqu’au 18e jour. Au 18e jour de l’incubation, aspirer le milieu de l’intérieur et de l’extérieur des inserts d’un plateau de culture tissulaire chargé de reconstitution cutanée.

Retirez les inserts du plateau à l’aide d’une pince. Découpez la construction, y compris le filtre en polycarbonate, en traçant un cercle près du bord avec une lame de scalpel. Placez ensuite la reconstruction dans le filtre sur une surface dure et coupez-les en deux avec la lame.

Placez la moitié de la reconstruction sur un papier de biopsie TBS noir, puis placez le papier dans une cassette d’histologie. Faites tremper toute la cassette dans du formol à 10 % pendant plus de quatre heures. Ensuite, placez la cassette dans de l’éthanol à 70 % et stockez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous soyez prêt à traiter la reconstruction pour l’incorporation de paraffine.

Placez l’autre moitié de la reconstruction dans 50 % de saccharose à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Ensuite, changez le saccharose en deux molaires, puis conservez-le à quatre degrés Celsius pendant encore une à deux heures. Remplissez à moitié un moule de base avec une température de coupe optimale, un support de congélation ou un OCT.

Évitez les bulles. Saisissez le bord de la reconstruction à l’aide d’une pince et retirez la reconstruction du saccharose. Placez-le sur des lingettes Kim jusqu’à ce que le saccharose soit absorbé.

À l’aide d’une pince et d’une spatule, transférez la reconstruction dans le bateau au-dessus de l’OCT. Couvrez le haut de la reconstruction avec plus d’OCT jusqu’à ce que le bateau soit complètement plein. Encore une fois, en évitant les bulles.

Placez le bateau uniformément sur de la glace sèche pilée pour permettre à l’OCT de geler complètement. Ensuite, enveloppez le moule de base et la feuille et stockez-le à moins 70 degrés Celsius jusqu’à ce que vous soyez prêt à le couper avec un cryostat. Pour préparer la greffe d’une reconstruction cutanée sur une souris, remplissez un récipient d’azote liquide et ajoutez cinq millilitres de DMEM dans un tube de 50 millilitres.

Remplissez un bécher avec 600 millilitres d’eau du robinet et placez le bécher sur une plaque chauffante pour le réchauffer. Sélectionnez ensuite une souris femelle mâle, sans poils et consanguine vers l’âge de six semaines. Après avoir anesthésié la souris avec de l’huile de fluor.

Utilisez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie tout au long de la procédure. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile et fournissez un soutien thermique pour prévenir l’hypothermie. Ensuite, nettoyez la peau de la souris avec de la teinture de benjoin et des tampons de préparation à l’alcool.

Marquez une ligne sur le dos de la souris pour garder la même position pour une suture ultérieure. Découpez un lit de plaie rond sur le dos de la souris à l’aide de ciseaux à iris et de pinces, puis couvrez le lit de la plaie avec des éponges de gaze stériles. Mettez la peau ronde de la souris dans le tube de 50 millilitres de DMEM.

Plongez le tube dans un récipient d’azote liquide jusqu’à ce que tous les milieux et tissus soient totalement congelés. Ensuite, dégivrez le tube dans un bécher d’eau chaude jusqu’à ce qu’il soit totalement décongelé. Répétez cette opération, congelez et décongelez trois fois.

Utilisez une lame chirurgicale pour détacher une reconstruction cutanée d’un insert. Retirez la membrane très soigneusement, puis transférez la peau reconstruite vers le haut du lit de la plaie de la souris. Maintenant, placez la peau de souris sur la reconstruction de la peau.

Assurez-vous que la première suture se trouve au-dessus du marqueur précédemment étiqueté et que la seconde se trouve en bas. Ensuite, utilisez deux autres sutures sur les côtés de la peau pour reconstruire pour fixer la peau de la souris. Nettoyez la peau de la souris après la greffe, puis placez la souris dans une nouvelle cage.

Au jour 18. L’épiderme des reconstructions cutanées est composé de couches de kératinocytes stratifiées, la couche basale indifférenciée et les couches différenciées séquentiellement sont orientées verticalement. Coloration de la coupe de reconstructions avec le marqueur mélanocytaire.

S 100, comme l’indiquent les flèches noires, montre que les mélanocytes sont alignés dans la couche basale de l’épiderme et communiquent avec plusieurs kératinocytes par des extensions de dendrites. Le compartiment dermique contient des fibroblastes intégrés dans un collagène de type un matrice déposée de collagène quatre indique la membrane basale, qui sépare l’épiderme du derme. Les figures suivantes illustrent comment se développent plusieurs couches de kératinocytes dans l’épiderme.

Lorsque des cellules souches dermiques marquées avec un vecteur lentiviral GFP sont intégrées aux fibroblastes. Dans une matrice de collagène de type 1, ils migrent vers l’épiderme et se différencient en mélanocytes au cinquième jour. Après l’ensemencement des kératinocytes, les cellules uniques commencent à migrer hors des sphères.

A noter que l’épiderme est toujours composé d’une seule couche. Au huitième jour. Quelques cellules atteignent l’interface épiderme-derme.

Au jour 10, les cellules positives à la GFP sont étroitement alignées à la position de la membrane basale, comme on peut le voir ici. Les cellules GFP positives migrées dans l’épiderme expriment le marqueur mélanocytaire HMB 45. Lorsque les différentes lignées cellulaires du mélanome sont incorporées dans les reconstructions cutanées, le comportement des cellules reflète leurs caractéristiques in vivo.

Ici, des mélanocytes normaux et des cellules de mélanome cultivés dans des cultures 2D peuvent être vus sur cette figure. L’emplacement et le taux de croissance des mélanocytes normaux sont étroitement contrôlés dans les reconstructions cutanées, comme on le voit ici, la phase de croissance radiale, les mélanomes primaires prolifèrent principalement dans l’épiderme, tandis que les mélanomes en phase de croissance verticale se développent de manière invasive dans le derme, comme le montre cette figure. Enfin, la façon dont les mélanomes métastatiques envahissent agressivement le derme peut être observée ici.

Nos études sur les peaux normales jettent les bases d’une meilleure connaissance du développement et de la progression du mélanome.