La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

L'objectif général de cette procédure est de générer un reconstruct cutané humain tridimensionnel pour des études sur la biologie des mélanocytes, du mélanome et des cellules souches cutanées. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant un insert de plaques de culture tissulaire avec du collagène de bovin neutralisé. La deuxième étape consiste à former le compartiment dermique cellulaire à partir de fibroblastes et de collagène.

Ensuite, constituez le compartiment épidermique à partir de kératinocytes mélangés à des mélanocytes ou à des cellules de mélanome. La dernière étape de la procédure consiste à récolter un reconstruct cutané au jour 18 et à greffer ce reconstruct cutané sur une souris. Enfin, les analyses immunohistochimiques et immunofluorescentes de la greffe révèlent l'architecture d'une peau normale contenant des mélanocytes, ainsi que la migration et la différenciation de cellules souches normales et des phénotypes spécifiques aux stades du mélanome.

Nous avons mis au point le modèle de reconstruction cutanée il y a 20 ans, car dès le début de nos études, nous avons observé que les mélanocytes normaux ou les cellules de mélanome cultivées dans une boîte se comportent très différemment des cellules présentes dans un contexte tissulaire. Ainsi, le modèle de reconstruction cutanée est idéal pour observer comment les cellules migrent d'un compartiment de la peau vers un autre emplacement. Le mélange de collagène acellulaire préparé précédemment est maintenu sur glace, puis un millilitre de la solution jaune paille est ajouté dans chaque insert d'une plaque de six.

Incubez le plateau de culture tissulaire dans une plaque à puits pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre la solidification du gel. Pendant ce temps, la solution doit changer de couleur, passant du jaune au rose, tandis que le gel se solidifie. Détachez les fibroblastes humains de leur flacon de culture à l’aide de trypsine-EDTA 0,25 % après cinq minutes. Ajoutez du DMEM contenant 10 % de FBS pour neutraliser le processus d’enzymolyse.

Récupérez les cellules détachées par centrifugation pendant cinq minutes à 200 ×g à température ambiante, puis resuspendez les cellules à raison de 4,5 fois 10 à la puissance 5 cellules par 1,5 millilitre de DMEM supplémenté en 10 % de FBS. Ensuite, remplissez un tube de 50 millilitres avec le mélange de collagène et de couche cellulaire préparé précédemment et placez le tube sur de la glace.

Ajouter 1,5 millilitre de la suspension de fibroblastes dans le tube et mélanger soigneusement. Ajouter trois millilitres de la solution de couche cellulaire jaune paille dans chaque insert revêtu de couche acellulaire. Incuber ensuite la plaque de culture tissulaire pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de dioxyde de carbone pendant la période d'incubation.

La couleur de la solution de la couche cellulaire doit également passer du jaune au rose. Une fois que le gel de la couche supérieure est solidifié, ajoutez deux millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS à l'intérieur de l'insert dans la boîte de culture tissulaire, et 10 millilitres à l'extérieur de l'insert. Incubez les boîtes de culture tissulaire pendant quatre jours.

Le quatrième jour, vérifiez que le gel s'est contracté au quatrième jour d'incubation ; aspirez le milieu de l'intérieur et de l'extérieur de chaque insert. Ajoutez deux millilitres de milieu de lavage à l'intérieur et 10 millilitres à l'extérieur des inserts afin d'éliminer le sérum ordinaire. Incubez ensuite les plaques pendant une heure à 37 °C pour permettre la formation de l'épiderme.

Commencez par traiter les kératinocytes humains avec la trypsine. Ensuite, après cinq minutes, utilisez l'inhibiteur de trypsine de soja pour neutraliser la trypsine, après avoir centrifugé les cellules détachées à 200 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez ensuite le culot cellulaire à 4,17 × 10⁶ cellules par millilitre dans la peau.

Reconstituez le milieu une fois les kératinocytes récoltés. Incubez les mélanocytes humains dans la trypsine sur glace pendant une à deux minutes. Neutralisez à nouveau la trypsine à l’aide d’un inhibiteur de la trypsine de soja.

Ensuite, après avoir centrifugé les cellules dans les mêmes conditions qu'auparavant, resuspendre le culot de mélanocytes à 8,3 × 10⁵ cellules par millilitre dans le milieu de reconstruction cutanée un. Ensuite, retirer le milieu de rinçage à la fois de l'intérieur et de l'extérieur de chaque insert d'un plateau de culture tissulaire à couche dermique préparé.

Remplacer le milieu de lavage en ajoutant 1,5 millilitre de milieu de reconstruction de la peau, un à l'intérieur et 10 millilitres à l'extérieur de chaque insert. Ensuite, mélanger 600 microlitres de la suspension de cellules kératinocytes avec 600 microlitres de la suspension de mélanocytes. Distribuer 200 microlitres de la suspension cellulaire mixte.

Goutte à goutte à l’intérieur de chaque insert. Incuber la plaque de culture cellulaire pendant deux jours à 37 degrés Celsius. Après incubation des cellules, aspirer le milieu de reconstruction de la peau un, à la fois de l’intérieur et de l’extérieur de chaque insert, puis ajouter deux millilitres de milieu de reconstruction de la peau deux à l’intérieur et 10 millilitres à l’extérieur de l’insert.

Incubez ensuite les reconstituts pendant deux jours supplémentaires à 37 degrés Celsius. Après la deuxième incubation de deux jours, aspirez le milieu de reconstitution de la peau deux à l'intérieur et à l'extérieur de chaque insert. Ajoutez maintenant 7,5 millilitres du milieu de reconstitution de la peau trois uniquement à l'extérieur des inserts.

Remettez les reconstitutions dans l'incubateur et changez le milieu de reconstitution tous les deux jours jusqu'au jour 18. Au jour 18 de l'incubation, aspirez le milieu de l'intérieur et de l'extérieur des inserts d'un plateau de culture tissulaire contenant des reconstitutions cutanées.

Retirez les inserts du plateau à l’aide de pinces. Découpez la construction en incluant le filtre en polycarbonate en traçant un cercle près du bord avec une lame de scalpel. Ensuite, placez la reconstruction sur le filtre sur une surface dure et coupez-la en deux à l’aide de la lame.

Placez une moitié du reconstruct sur un papier de biopsie TBS noir, puis insérez le papier dans une cassette d'histologie. Immergez l'ensemble de la cassette dans du formol à 10 % pendant plus de quatre heures. Ensuite, placez la cassette dans de l'éthanol à 70 % et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt à traiter le reconstruct pour l'inclusion en paraffine.

Placer l'autre moitié du prélèvement dans du saccharose à 50 % à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Ensuite, remplacer le saccharose par une solution deux molaire et conserver à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures supplémentaires. Remplir à moitié un moule de base avec du milieu de congélation à température optimale de coupe, ou OCT.

Évitez toute bulle. Saisissez le bord du reconstruct à l’aide de pinces et retirez-le du saccharose. Placez-le sur des essuies-papiers Kim jusqu’à ce que le saccharose soit absorbé.

À l’aide de pinces et d’une spatule, transférer le reconstruct dans l’embarcation, par-dessus le OCT. Recouvrir la partie supérieure du reconstruct de plus de OCT jusqu’à ce que l’embarcation soit complètement remplie. Veiller de nouveau à éviter les bulles.

Placez le bateau uniformément sur de la glace sèche broyée pour permettre à l'OCT de geler complètement. Ensuite, enveloppez le moule de base et la feuille d'aluminium et conservez-les à moins 70 degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt à les couper avec un cryostat. Pour préparer la greffe d'une reconstruction cutanée sur une souris, remplissez un récipient avec de l'azote liquide et ajoutez cinq millilitres de DMEM dans un tube de 50 millilitres.

Remplir un bécher avec 600 millilitres d'eau du robinet et placer le bécher sur un chauffe-plaque pour le réchauffer. Ensuite, sélectionner une souris femelle skid hairless non consanguine d'environ six semaines d'âge. Après anesthésie de la souris à l'isoflurane.

Utilisez un cône nasal pour maintenir l'anesthésie tout au long de la procédure. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile et assurez un soutien thermique pour prévenir l'hypothermie. Ensuite, nettoyez la peau de la souris avec une teinture de benjoin composée et des compresses imprégnées d'alcool.

Marquez une ligne sur le dos de la souris afin de conserver la même position pour la suture ultérieure. Découpez un lit de plaie circulaire sur le dos de la souris à l’aide de ciseaux à iridectomie et de forceps, puis recouvrez le lit de plaie avec des compresses stériles. Placez la peau ronde de la souris dans le tube de 50 millilitres contenant du DMEM.

Immerger le tube dans un contenant d'azote liquide jusqu'à ce que tout le milieu et le tissu soient complètement congelés. Ensuite, décongeler le tube dans un bécher d'eau chaude jusqu'à complète décongélation. Répéter cette procédure de congélation et de décongélation trois fois.

Utilisez une lame chirurgicale pour détacher un reconstruct cutané d'un insert. Retirez très soigneusement la membrane, puis transférez le reconstruct cutané sur la surface du lit de plaie de la souris. Placez ensuite la peau de souris par-dessus le reconstruct cutané.

Vérifiez que le premier point de suture se trouve au-dessus du marqueur précédemment étiqueté et que le second est en dessous. Utilisez ensuite deux autres points de suture sur les côtés de la reconstruction cutanée pour fixer la peau de la souris. Nettoyez la peau de la souris après la greffe, puis placez la souris dans une nouvelle cage.

Au jour 18. L'épiderme des reconstitutions cutanées est composé de couches stratifiées de kératinocytes ; la couche basale indifférenciée et les couches différenciées successives sont orientées verticalement. Coloration de la section des reconstitutions avec le marqueur mélanocytaire.

S 100, indiqué par les flèches noires, montre que les mélanocytes sont alignés dans la couche basale de l'épiderme et communiquent avec plusieurs kératinocytes par des prolongements dendritiques. Le compartiment dermique contient des fibroblastes intégrés dans une matrice de collagène de type un ; le collagène quatre indique la membrane basale, qui sépare l'épiderme du derme. Les figures suivantes illustrent comment plusieurs couches de kératinocytes dans l'épiderme se développent.

Lorsque des cellules souches dermiques marquées avec un vecteur lentiviral GFP sont incluses avec des fibroblastes dans une matrice de collagène de type I, elles migrent vers l'épiderme et se différencient en mélanocytes au jour cinq. Après l'ensemencement des kératinocytes, des cellules isolées commencent à migrer à partir des sphéroïdes.

Remarquez que l'épiderme est encore composé d'une seule couche. Au huitième jour, quelques cellules atteignent l'interface entre l'épiderme et le derme.

Vers le jour 10, les cellules positives pour la GFP sont étroitement alignées au niveau de la membrane basale, comme on peut le voir ici. Les cellules positives pour la GFP ayant migré dans l'épiderme expriment le marqueur mélanocytaire HMB 45. Lorsque différentes étapes de lignées cellulaires de mélanome sont intégrées dans des reconstitutions cutanées, le comportement des cellules reflète leurs caractéristiques in vivo.

Ici, des mélanocytes normaux et des cellules de mélanome cultivées en cultures 2D peuvent être observés sur cette figure. La localisation et la vitesse de croissance des mélanocytes normaux sont strictement contrôlées dans les reconstitutions cutanées, comme le montre cette image ; les mélanomes primaires en phase de croissance radiale prolifèrent principalement dans l'épiderme, tandis que les mélanomes en phase de croissance verticale envahissent de manière invasive le derme, comme illustré sur cette figure. Enfin, on peut observer ici la manière dont les mélanomes métastatiques envahissent de façon agressive les couches profondes du derme.

Nos études sur la peau normale fournissent la base d'une meilleure compréhension du développement et de la progression du mélanome.