Name: Démarche analyse des déficiences moteurs fonction de l’âge chez la souris avec la neurodégénérescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Apprenez l'analyse cinématique de la démarche par imagerie ventrale pour surveiller les changements de coordination motrice liés à l'âge chez les modèles murins de neurodégénérescence. Cette méthode permet d'étudier les déficiences motrices subtiles et sévères.

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Nous remercions les gardiens animaux à l’animalerie de l’ENI pour aide à l’élevage et Dr. Nuno Raimundo pour des commentaires utiles sur le manuscrit. I.M. est pris en charge par les subventions de la Fondation allemande de la recherche (DFG) à travers le centre de recherche en collaboration SFB-889 (projet A8) et SFB-1190 (projet P02) et le Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. est soutenu par la bourse de recherche de l’Ecole doctorale de Göttingen pour les Neurosciences, biophysique et des Biosciences moléculaires (GGNB).

Toutes les expériences sur des animaux présentés ici sont menées conformément aux directives européennes pour le bien-être animal (2010/63/UE) avec l’approbation de la Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Lavesarchitecte (construction), numéro d’immatriculation 14 / 1701.
1. conception de l’étude
<ol><li>Comme travail de comportement animal exige une planification minutieuse, examiner les paramètres suivants lors de la conception de l’expérience.<ol>
<li>Nombre d’animaux nécessaires par groupe.<ol>
<li>Utiliser un logiciel de statistique (p. ex., PASS, EDA ou GPower) pour calculer la taille de groupe requis. Remarque : La taille du groupe dépend de la variation entre les animaux et la sévérité du phénotype. Pour l’analyse de la démarche cinématique, le nombre de souris est généralement de 10 à 20 par groupe.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sexe des animaux expérimentaux.<ol>
<li>Examiner l’effet des oestrogènes sur l’expérience, selon les souches animales. NOTE : De nombreuses études de comportement se concentreront sur les hommes afin d’éviter l’influence des oestrogènes sur l’expérience. Ces influences sont plus ou moins fortes selon les souches animales de fond.</li>
			<li>Si les deux sexes seront utilisés, tester pour l’influence du sexe et d’évaluer les deux sexes séparément lorsque c’est nécessaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Âge des animaux expérimentaux.<ol>
<li>Utiliser des animaux adultes (2 mois, ou plus) si un seul point unique est nécessaire.</li>
			<li>Sélectionnez plusieurs points dans le temps lorsque le changement de comportement moteur avec l’âge doit être étudié. Le point le plus rapproché possible de temps est de 1 mois, après que les souris sont sevrés de leur mère. Les animaux de laboratoire à intervalles réguliers, par exemple, tous les 1, 2 ou 3 mois.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solliciter une autorisation auprès des autorités locales pour effectuer des tests de comportement animal.</li>
	<li>Faire des plans pour se procurer les animaux testés.<ol>
<li>Faire un plan d’élevage ou contactez un distributeur animal en temps opportun afin que suffisamment les animaux de laboratoire sont disponibles le jour quand commencent les expériences.</li>
		<li>Que les animaux puissent s’habituer pendant une semaine, si elles sont conservées dans une nouvelle salle/au cours des expériences.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enregistrement vidéo
NOTE : Pour illustrer l’utilisation de l’analyse cinématique gait, ici un système d’imagerie disponible dans le commerce avec son accompagnement de l’imagerie et le logiciel d’analyse (voir la Table des matières) sont utilisés.
<ol><li>Démarrez l’ordinateur et le logiciel de l’imageur.</li>
	<li>Déterminer l’état de santé et le bien-être de chaque animal en l’observant dans sa cage maison, elle pesée sur une balance.</li>
	<li>Si nécessaire, appliquer doucement le doigt rouge peinture aux pattes de l’animal avec une brosse. Laissez la peinture sécher pendant environ 5 min dans une cage propre de rechange. Remarque : Évitez de peindre le ventre de l’animal car la peinture est utilisée pour renforcer le contraste entre les pattes et le corps. Il est utile d’avoir la peinture de doigt noir très pratique pour les corrections. Cette étape est nécessaire pour les animaux à fourrure brune, ou dans les cas les pattes ont été tatoués pour identification. Si choisi de peindre les pattes d’un animal, tous les animaux dans le même groupe et le groupe témoin doivent être peints ainsi.</li>
	<li>Régler la vitesse du tapis roulant sur le panneau supérieur droit de l’appareil ; Si plus d’une vitesse de marche sera appliqué, commencez tout d’abord avec la vitesse la plus lente.</li>
	<li>Placer l’animal dans la chambre d’essai (évitez la queue ou les pattes de serrage lors de la fermeture de la chambre). Couvrir la chambre avec un tissu sombre et permettre à chaque animal tenir compte de 1-2 min.</li>
	<li>Allumez la lumière dans la chambre d’essai en tournant l’interrupteur rotatif tapis roulant à la position « on ». Tourner le commutateur rotatif de tapis de course de « transmettre » pour démarrer le tapis de course, puis cliquez sur le bouton « enregistrer » dans le logiciel de l’imageur. Remarque : Alors que le tapis roulant est en cours d’exécution, il est important d’observer le rendement des animaux avec soin et constamment : arrêter le tapis roulant immédiatement si l’animal ne peut pas faire face à la vitesse du tapis roulant, ou présente des symptômes secondaires non liés à la locomotion (par exemple, des crises d’épilepsie). Conditions d’essai peuvent nécessiter un réajustement.</li>
	<li>Lorsque l’animal s’exécute de manière stable (aucun évasions rapides pour les côtés, avant ou arrière), enregistrer pendant au moins 5 s avant d’arrêter le tapis roulant. Arrêter l’enregistrement en cliquant sur « stop » sur le logiciel imager et tourner le bouton rotatif de tapis roulant vers la position « off ». Remarque : Pour éviter un fonctionnement instable des animaux, il peut être utile de les laisser tourner pendant quelques secondes, ou pour leur permettre d’exécuter dans l’autre sens (en tournant le commutateur rotatif de tapis roulant pour « inverser » au lieu de « faire suivre »).</li>
	<li>Cliquez sur le bouton « transformation » dans le logiciel de l’imageur pour ouvrir un menu dans lequel le début et fin de la section vidéo (à utiliser pour l’analyse) peuvent être définies. Pour ce faire, utilisez le curseur en bas de l’écran pour naviguer dans la vidéo.</li>
	<li>Pour sélectionner le point à l’heure actuelle comme le début ou le point de terminaison, cliquez sur « du n° de l’image » et « to », respectivement. Assurez-vous que la section contient au moins 7 étapes/patte (14 étapes au total) de l’animal en exécutant de façon stable à une vitesse constante.</li>
	<li>Entrer l’identification de l’animal, date de naissance, poids et sexe. Enregistrer les données sur l’emplacement désiré sur l’ordinateur ou du serveur. Cliquez sur « caméra » pour revenir à l’interface d’enregistrement.</li>
	<li>Si plusieurs vitesses d’entraînement en cours d’exécution doivent être enregistrées, répétez les étapes 2.6-2.10 avec les vitesses de fonctionnement désirés. Avant d’enregistrer la vidéo suivante, assurez-vous que la peinture rouge est toujours présente sur la patte, sinon Répétez l’étape 2.3.</li>
	<li>Après l’enregistrement, libérer l’animal de sa cage maison. Après avoir retiré un animal, nettoyer le tapis avec de l’eau savonneuse suivie de désinfectant pour le préparer pour le prochain animal expérimental.</li>
</ol>3. video Processing
<ol><li>Démarrer le logiciel d’analyse, puis cliquez sur « select étudier le dossier » sélectionner le dossier avec les vidéos enregistrées.</li>
	<li>Sélectionnez une vidéo d’un ou plusieurs vidéos qui peuvent être traitées de façon consécutive, cliquez sur « go ».</li>
	<li>Utilisez la fonction de « rafraîchissement » pour sélectionner la zone où la souris est en cours d’exécution ; Cette section doit contenir uniquement la souris et le fond blanc.</li>
	<li>Si la fonction « inverse » tapis roulant a été utilisée précédemment, choisissez « vérifier si le nez du sujet est à votre droite >>> » mettre en miroir la vidéo puisque le logiciel est conçu pour analyser uniquement les animaux courir vers la gauche. Cliquez sur « J’accepte » pour continuer.</li>
	<li>Utilisez la fonction « rafraîchir » pour voir le masque par défaut et que le logiciel détecte empreinte de patte. Remarque : La vidéo d’origine est affichée sur la gauche, et une image noir et blanc des tirages proposés patte est sur la droite.</li>
	<li>Entrez des valeurs dans les cases « longueur » et « width » pour modifier le masque qui exclut la zone rouge autour du museau de l’animal pour l’analyse ; la couleur est semblable aux pattes, ne pas masquer cette zone pourrait entraîner le logiciel classement accidentellement le museau comme une patte.</li>
	<li>Réglez les curseurs « filtre bruit » et « filtrer les fourrures et les taches sombres » pour optimiser l’impression de patte noir et blanc. Réglez le curseur « filtre bruit » à ~ 800-950 pour animaux noir et à environ 700-800 pour animaux bruns ou blancs, selon la couleur exacte de fourrure de l’animal. Sélectionnez « OK » lorsque les réglages sont satisfaisants. Remarque : Le curseur « filtrer les fourrures et les taches sombres » dépend sur comment « rouge » la patte est. Pour pattes peintes, la valeur est habituellement d’environ 100-120 et pour les pattes non vernies la meilleure valeur est autour de 50-100. Ces paramètres dépendent les nuances de couleur de la fourrure et les pattes et doivent être optimisées pour chaque animal. La patte noir et blanche impression devrait avoir les représentations claires des pattes avec comme bruit de fond peu que possible.</li>
	<li>Sélectionnez une ou plusieurs vidéos qui ont passé le premier ajustement (marqués avec « @@ » avant le nom de la vidéo) et sélectionnez la fonction « imprimer » pour lancer l’analyse de ces vidéos. Remarque : L’analyse prend 2-5 min par vidéo. Il est possible d’exécuter l’analyse de plusieurs vidéos du jour au lendemain, car cette étape ne nécessite aucun apport de l’expérimentateur.</li>
	<li>Sélectionnez une vidéo analysée (marqués avec « @@@ ») et cliquez sur « go ». Notez que la patte zone (cm2) au contact de la ceinture au fil du temps (démarche dynamique) pour chaque patte distinct peut maintenant être vu. Pour comparer la vidéo originale et la patte calculée pour une zone sélectionnée, utilisez la fonction « jeu vidéo ».</li>
	<li>Utilisez les outils suivants (trois) pour corriger les petites erreurs commises par le logiciel.<ol>
<li>Utilisez l’option « correcte » pour supprimer un mauvais signal, par exemple, lorsque le logiciel enregistre un signal, même si la patte correspondante n’est pas en contact avec la courroie. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquer la bordure gauche de l’objet à supprimer avec le second clic et la bordure de droite avec le troisième clic.</li>
		<li>Utilisez l’option « se connecter » pour combiner deux signaux, par exemple, quand aucun signal n’est enregistré pour quelques images, même si la patte est en contact avec la courroie. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée, puis double-cliquez sur au milieu de deux objets à combiner.</li>
		<li>Utilisez l’option « Supprimer » pour supprimer complètement les points dans le temps de l’analyse. Utilisez cette option uniquement si l’erreur ne peut être fixée avec le « correct » ou « se connecter » fonction, par exemple, quand un signal de la patte de la patte avant gauche est accidentellement enregistré pour la patte de la patte gauche. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquer la bordure gauche de la zone à enlever avec le second clic et la bordure de droite avec le troisième clic. Remarque : Les outils peuvent uniquement servir pour corriger les petites erreurs ; défaillances systématiques (par exemple, si le signal d’une patte était extrêmement faible) ne peuvent être corrigées : la vidéo devrait être exclue de l’analyse et l’enregistrement de l’animal respectif répété, lorsque cela est possible. Remarque que l’option « jeu vidéo » n’est plus disponible après le « bon », « se connecter » ou « supprimer » option a été utilisée, et en cliquant sur le bouton « Annuler » se réinitialisera toutes les 3 outils d’édition.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez « ensuite l’intégrité physique » à aller de l’avant à travers les 4 membres ; Lorsque vous cliquez sur « prochain membre » après la dernière patte, le logiciel effectue l’analyse et affiche les résultats de cet animal sur 4 écrans.</li>
</ol>4. analyse de la démarche
<ol><li>Si toutes les vidéos d’une des expériences sont analysées, sélectionnez toutes les vidéos, cliquez sur « Réorganiser les résultats » pour exporter les résultats (une liste de paramètres dans les fichiers de feuille de calcul).</li>
	<li>Ouvrez le fichier avec la terminaison « reorganized_stride_info » et ajouter des informations ne figurant pas dans cette feuille de calcul : groupe d’information (p. ex., génotype, traitement), l’âge et les mesures de longueur de l’animal et la largeur qui sont enregistrés dans un autre fichier de feuille de calcul avec la terminaison « SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info ».</li>
	<li>Normaliser les paramètres démarche animale largeur ou longueur, si nécessaire, par exemple, SL à longueur de l’animal et SW à la largeur de l’animal.</li>
	<li>Trier les résultats par groupe, l’âge et vitesse de course : analyser toutes ces conditions de façon indépendante. NOTE : Les âges différents ou des vitesses en cours d’exécution ne peuvent être combinées au sein d’un même groupe.</li>
	<li>Calculer les valeurs de la moyenne (moyenne), écart-type et écart-type de la moyenne pour chaque paramètre pour toutes les conditions expérimentales.</li>
	<li>Effectuer une analyse statistique selon le protocole expérimental, par exemple, utiliser une queue 2 t-test pour comparer animal mutant/traités à un type sauvage (WT) / contrôle ou ANOVA pour comparer plusieurs groupes indépendants.</li>
	<li>Coup d’oeil mesurée à tous les paramètres : il est utile de tracer chaque paramètre pour mieux visualiser les résultats. S’il y a des différences statistiques dans un paramètre donné, vérifiez si les autres paramètres dépendants modifier corrélativement. Remarque : par exemple, si le SL est significativement diminué dans un certain groupe de test, ceci également entraînera une plus grande fréquence de foulée (puisque la vitesse de course est le même) et peut résulter en une augmentation SW (afin de maintenir la stabilité de la posture).</li>
	<li>Sélectionnez les paramètres qui sont les plus pertinents pour un modèle et/ou sont comparables aux observations dans la maladie humaine. Pour une présentation, créer des vidéos représentant pour chaque groupe et les compléter par des graphiques montrant la lecture pour les paramètres pertinents, étant donné que les changements d’allure subtile ne sont souvent pas évidents d’après les vidéos.</li>
</ol>5. problèmes et solutions
Remarque : Certains animaux, notamment des modèles de souris avec un phénotype d’anxiété, peut-être avoir des difficultés à accomplir encore une tâche simple comme courir sur un tapis roulant. Voici les étapes qui peuvent être prises à des niveaux inférieurs d’anxiété et d’encourager en cours d’exécution.
<ol><li>Accoutumance et application de la loi positive.<ol>
<li>À 2-3 jours avant le premier test, placez votre souris dans la chambre d’essai, couvrez-la avec un torchon foncé et laisser la lumière éteinte. Laissez la souris ajuster au nouvel environnement pendant environ 5 min. Ajouter chow ou beurre chocolat/noix (p. ex., Nutella) à la chambre d’essai pour une association positive peut-être se former.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Application de la loi négative par limite de souffles/arrière d’air.<ol>
<li>Souris n’aiment pas les bouffées d’air ou un mouvement derrière eux et seront déroulera loin de la perturbation. Pour motiver en cours d’exécution, utilisez les choux à la masse d’air doux, ou un mouvement rythmique de la barre souple qui forme la limite arrière de la chambre d’essai, afin d’encourager la souris de courir vers la partie antérieure de la chambre d’essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slow-start.<ol>
<li>Lorsque vous testez des vitesses élevées en cours d’exécution, démarrez le tapis roulant à une vitesse inférieure et ensuite augmenter lentement la vitesse du tapis roulant vers la condition désirée à l’essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Minimiser la libre circulation.<ol>
<li>La longueur de chambre de test est limitée par deux barres réglables à l’avant et l’arrière. Si un animal test tient à la vitesse de marche mais ne tourne pas régulièrement, limiter la longueur de la chambre pour une marche plus régulière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si les mesures susmentionnées ne sont pas réussies, record en cours d’exécution sur le lendemain. Si l’animal refuse toujours à courir après l’essai sur trois jours, enregistrer ceci comme la conclusion et exclure l’animaux de tests supplémentaires. Remarque : Les résultats de l’analyse de la démarche dépendant d’enregistrement vidéo de bonne qualité. Il n’y a aucune raison d’exclure les vidéos lors de l’analyse si les vidéos ont été enregistrées avec soin. Si la qualité vidéo est insuffisante, il deviendra évident au cours de l’étape 3.6 lorsque les paramètres pour la création de l’impression numérique patte sont définies. Si aucune autre partie du corps sauf les pattes et le museau apparaît rouge (p. ex., en raison de la fourrure manquante autour des organes génitaux ou des jets de peinture de doigt sur l’abdomen), la qualité diminue considérablement. Les ajustements à l’étape 3.6 permettent de corriger les seuls petits problèmes et si cela ne peut pas apporter la vidéo à un rapport signal/bruit acceptable, la vidéo doit être exclue de l’analyse et enregistrement doit être répété. Ainsi, il est recommandé d’analyser des vidéos peu après que les enregistrements sont effectués.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

L’étude de la coordination motrice est une approche utile dans la caractérisation de modèles de maladies neurodégénératives, en particulier pour les maladies comme PD dans laquelle la coordination motrice est durement touchée. Avec l’aide d’un test fonctionnel de l’analyse cinématique démarche, nous pouvons identifier les changements subtils dans la démarche d’animaux à l’apparition de problèmes locomoteurs, ou dans les modèles avec faible neurodégénérescence et phénotype donc relativement modeste. Compte tenu de la dive...

Imposent un lourd fardeau sur les patients, les familles et la société des maladies neurodégénératives et deviendront encore plus préoccupant que l’espérance de vie augmente et la population mondiale continue de vieillir. Un des symptômes plus courants des maladies neurodégénératives sont des problèmes d’équilibre et de la mobilité. Ainsi, la caractérisation du comportement moteur dans le vieillissement chez les mammifères (p. ex., un rongeur) des modèles ou des modèles montrant les phénotypes neurodégénératives, constitue un outil précieux pour démontrer la pertinence in vivo de la modèle animal spécifique (s), ou thérapeutique traitements qui visent à améliorer les symptômes de la maladie. Presque chaque approche pour traiter les maladies neurodégénératives nécessite finalement stable dans un modèle animal avant l’instauration d’un essai clinique chez l’homme. Par conséquent, il est crucial d’avoir des tests de comportement fiable et reproductible qui peuvent être utilisés pour quantifier systématiquement des phénotypes pertinents-maladie le long de la progression de l’âge, afin de s’assurer qu’un médicament candidat, qui a montré de potentiel dans un modèle in vitro , peut effectivement améliorer le phénotype chez un animal vivant.
Un des aspects de l’évaluation du comportement moteur chez les rongeurs sont l’analyse cinématique démarche, pouvant être exécutées par le VPI (également appelé plan ventral vidéographie)1,2. Cette méthode tire parti de l’enregistrement continu de la face inférieure des rongeurs marchant sur un tapis roulant transparent et motorisés ceinture1,2,3,4. Analyse le flux de données vidéo crée « patte digital prints » de quatre membres qui dynamiquement et de manière fiable récapitulent modèle marche du rongeur, initialement décrite par Kale et al. 2 et modifiée et al. 3.
Le principe de l’analyse de la démarche axée sur l’imagerie consiste à mesurer la patte en contact avec le tapis au fil du temps, pour chaque patte individuel. Chaque position est représentée par une augmentation dans la région de patte (en phase de freinage) et une diminution dans la région de la patte (en phase de propulsion). Elle est suivie de la phase pendulaire dans laquelle aucun signal n’est détecté. Swing et position ensemble forment une enjambée. En plus des paramètres de dynamique de marche, les paramètres de posture peuvent également être extraits des vidéos enregistrées. Paramètres exemplaires et leur définition sont répertoriés dans le tableau 1 et comprennent la largeur de la position (SW ; la distance combinée entre les pattes avant ou arrières et l’axe de la queue de museau), "Stridez" de longueur (SL ; distance moyenne entre deux enjambées de la patte même) ou patte de placement angle (l’angle de la patte à l’axe de la queue de museau). Les données de la posture et démarche dynamique permettent de tirer des conclusions sur l’équilibre animal (par les paramètres de position et leur variabilité au cours de plusieurs étapes) et de la coordination (par des paramètres de dynamique de marche). Autres paramètres, tels que le coefficient de l’ataxie (la variabilité SL calculé par [(max. SL−min. SL) / signifie SL]), membre postérieur partagé position (temps que les deux membres postérieurs sont en contact avec la ceinture), ou drag patte (superficie totale de la patte sur la ceinture de position complet pour la patte de Lift-off) peuvent également être extraits et ont été signalés à modifier dans divers neurodégénératives di Sease modèles5,6,7,8 (voir tableau 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paramètre</td>
			<td>Unité</td>
			<td>Définition</td>
		</tr>
<tr>
<td>Swing time</td>
			<td>MS</td>
			<td>durée de temps que la patte n’est pas en contact avec la courroie</td>
		</tr>
<tr>
<td>temps de position</td>
			<td>MS</td>
			<td>durée de que la patte est en contact avec la courroie</td>
		</tr>
<tr>
<td>frein de %</td>
			<td>% du temps de position</td>
			<td>pourcentage de temps de position que les pattes sont en phase de freinage</td>
		</tr>
<tr>
<td>propulser %</td>
			<td>% du temps de position</td>
			<td>pourcentage de temps de posture, que les pattes sont en phase de propulsion</td>
		</tr>
<tr>
<td>largeur de la position</td>
			<td>cm</td>
			<td>combiné de distance entre les pattes avant ou arrières et l’axe de la queue de museau</td>
		</tr>
<tr>
<td>longueur de foulée</td>
			<td>cm</td>
			<td>distance moyenne entre deux enjambées de la patte de même</td>
		</tr>
<tr>
<td>fréquence de la foulée</td>
			<td>progrès/s</td>
			<td>numéro complet foulées par seconde</td>
		</tr>
<tr>
<td>angle de placement patte</td>
			<td>deg</td>
			<td>angle de la patte par rapport à l’axe de museau-queue de l’animal</td>
		</tr>
<tr>
<td>coefficient d’ataxie</td>
			<td>a. u.</td>
			<td>La variabilité SL calculé par [(max SL-min SL)/moyenne SL]</td>
		</tr>
<tr>
<td>position partagée %</td>
			<td>% de position</td>
			<td>temps de patte partagé de position ; temps que les deux membres postérieurs sont en contact avec la courroie en même temps</td>
		</tr>
<tr>
<td>patte de drag</td>
			<td>mm2
</td>
			<td>superficie totale de la patte sur la ceinture de position complet pour la patte de Lift-off</td>
		</tr>
<tr>
<td>chargement de la branche</td>
			<td>cm2
</td>
			<td>MAX dA/dT ; taux maximal de changement de zone de patte dans la phase de rupture</td>
		</tr>
<tr>
<td>variabilité d’angle étape</td>
			<td>deg</td>
			<td>écart-type de l’angle entre la biche pattes en fonction de la SL et SW</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Définition des paramètres de démarche clés qui peuvent être testés par imagerie plan ventral.
Évaluer le comportement moteur de modèles de rongeurs pour les maladies neurodégénératives peut être difficile selon la sévérité du phénotype d’un modèle spécifique à un âge donné. Plusieurs maladies, surtout de PD, spectacle comportement moteur solide (locomotion) déficits, tant chez les patients dans des modèles animaux. Un des quatre symptômes principaux dans PD est bradykinésie, qui progresse avec l’âge et se manifeste dans les handicaps graves démarche déjà dans les premiers stades de PD9. Études du modèle PD aiguë, rongeurs traités avec 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), ont déjà utilisé le VPI démarche analyse10,11,12. Toutefois, étant donné la nature aiguë de ce modèle, ces études ne traitent pas de la progression liée à l’âge des déficits moteurs. Plusieurs études récentes ont effectué l’analyse de la démarche chez les souris âgées avec changements neurodégénératives,13,14,, par exemple15, mettant l’accent sur l’importance de comprendre la progression de la maladie avec l’âge .
En plus des déficits moteurs, modèles animaux de maladies neurodégénératives, souvent, ont des difficultés à se concentrer sur les tâches d’examen et montrent des troubles cognitifs importants, en particulier avec l’âge. Tel un phénotype peut influer sur le résultat des tests de comportement moteur. À savoir, un des tests plus largement utilisés pour examiner des déficits moteurs, les rotarod test16, s’appuie sur la cognition, l’attention et stress17,18. Alors que la volonté de marcher sur un tapis roulant motorisé dépend également de ces facteurs, l’affichage enregistré est en cours d’exécution, qui est une caractéristique plus standardisée et beaucoup moins influencé par la cognition altérée. Effets du stress et de l’attention peuvent être visibles dans les paramètres spécifiques, comme la fois swing/position pour le stress et SL pour attention19,20, mais pas dans la capacité globale de course.
L’approche de l’analyse cinématique démarche plus offre l’avantage d’avoir des options pour ajuster le défi pour les modèles de rongeurs. Le tapis de course avec vitesse et angle réglable permet de vitesses de marche allant de 0,1 - 99,9 cm/s, alors que les rongeurs ayant une déficience sévère marche peuvent encore être en mesure de rouler à une vitesse lente (~ 10 cm/s). Animaux non-voyants peut être mesurés à des vitesses plus rapide en cours d’exécution (30 - 40 cm/s). L’observation de si oui ou non les animaux testés sont capables de fonctionner à une certaine vitesse fournit un résultat en soi. En outre, le rongeur peut être en outre contesté d’exécuter un plan incliné vers le haut ou le bas une baisse, en inclinant le tapis roulant à un angle désiré à l’aide d’un goniomètre, ou en attachant un traîneau pondéré à souris ou rat des membres postérieurs.
En plus de nombreuses études sur les protéines simples qui sont mutés chez les patients, il y a une récente prise de conscience croissante des liens entre l’endocytose défectueux processus et neurodégénérescence13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modèles avec des niveaux réduits d’endophiline-a murins (désormais endophiline), un acteur clé dans les deux endocytose clathrine13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 et endocytose clathrine indépendant34, ont été trouvés pour montrer la neurodégénérescence et déficiences de la fonction de l’âge dans l’activité locomotrice13,21. Trois gènes codent pour la famille de protéines endophiline : endophiline 1, endophiline 2 et endophiline 3. Notamment, le phénotype résultant de l’appauvrissement de la couche de protéines endophiline varie grandement selon le nombre de disparus endophiline gènes13,21. Alors que triple knock out (KO) de tous les gènes de l’endophiline est létale quelques heures après la naissance et les souris sans les deux endophiline 1 et 2 ne parviennent pas à s’épanouir et de mourir dans les 3 semaines après la naissance, KO unique pour toutes les trois endophilins ne montre aucun phénotype évidente pour testés conditions21. Autres génotypes mutants endophiline Voir la durée de vie réduite et développent des déficiences moteurs avec l’augmentation de l’âge13. Par exemple, endophiline 1KO-2HT-3KO souris affichage marche altérations et des problèmes de coordination motrice (selon les essais par rotarod et analyse de la démarche cinématique) déjà à 3 mois d’âge, tandis que leurs frères, animaux de 1KO-2WT-3KO endophiline, afficher une importante réduction de coordination motrice qu’à 15 mois d’âge13. En raison de la vaste diversité des phénotypes dans ces modèles, il est nécessaire d’identifier et d’appliquer un critère qui peut intégrer une variété de défis correspondant aux capacités de cognition et moteur de l’animal, ainsi que l’âge. Ici, nous détaillons les procédures expérimentales qui capitalisent sur l’analyse cinématique démarche pour évaluer le début et la progression du handicap moteur dans un modèle de souris qui montre les changements neurodégénératives (c.-à-d. endophiline mutants). Cela inclut la mesure des paramètres de marche à différentes époques et différentes sévérités des déficiences de la locomotion.

<table><tbody><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, États-Unis</td><td></td><td>Le logiciel d’imagerie et d’analyse DigiGait est inclus avec le matériel.</td></tr><tr>Une<td>couverture non transparente ou un tissu</td><td></td><td></td> sombre <td>recouvre la chambre d’essai pour réduire la sensation d’exposition/l’équilibre de stress de l’animal</td></tr><tr><td></td><td>, par exemple la balance Satorius</td><td></td><td>avec une précision de 0,1 g et une charge maximale d’au moins 100 g</td></tr><tr><td>de rouge peinture au doigt</td>, <td>par exemple Kreul ou Staedtler</td><td></td><td>pour augmenter le contraste entre les pattes et l’animal. corps petit</td></tr><tr><td>pinceau</td><td></td><td></td><td>pinceau doux pour appliquer de la peinture au doigt sur les pattes de l’animal</td></tr><tr><td>détergent</td><td></td><td></td> dilué <td>pour le nettoyage</td></tr> désinfectant<tr><td>, par exemple Meliseptol ou 70 % d’éthanol</td>, <td>par exemple B.Braun</td><td></td><td>pour la désinfection</td></tr></tbody></table>

démarche analyse des déficiences moteurs fonction de l’âge chez la souris avec la neurodégénérescence

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Des tests de comportement moteur sont couramment utilisés pour déterminer la pertinence fonctionnelle d’un modèle de rongeur et pour tester nouvellement mis au point des traitements chez ces animaux. Plus précisément, analyse de la démarche permet de reconquérir la maladie des phénotypes pertinents qui sont observés chez des patients humains, en particulier dans les maladies neurodégénératives qui affectent des habiletés motrices comme la maladie de Parkinson (MP), la maladie d’Alzheimer (ma), amyotrophique latérale amyotrophique (SLA) et autres. Au début des études dans cette optique, la mesure des paramètres de la démarche a été laborieuse et dépendent de facteurs qui ont été difficiles à contrôler (par exemple, vitesse, fonctionnement continu). Le développement plan ventral systèmes d’imagerie (VPI) rend possible la démarche analyse à grande échelle, faisant de cette méthode un outil utile pour l’évaluation du comportement moteur chez les rongeurs. Nous présentons ici un protocole approfondi de l’utilisation de l’analyse cinématique démarche pour examiner la progression en fonction de l’âge des déficits moteurs dans des modèles murins de la neurodégénérescence ; lignées de souris avec une baisse des taux de l’endophiline, dans lequel les lésions neurodégénératives augmentent progressivement avec l’âge, sont utilisées à titre d’exemple.

Pour illustrer l’utilisation de l’analyse cinématique démarche, nous avons effectué démarche analyse sur souris WT C57BL/6J avec l’âge, ainsi que plusieurs lignées mutantes endophiline, utilisant des instruments disponibles dans le commerce et les logiciels (veuillez vous référer à la Table de Matériaux). Dans cette configuration, une caméra haute vitesse sous un tapis roulant transparent enregistre le fonctionnement d’une souris (Figure 1 a)...

Dans cette étude, nous montrons l’utilisation de l’analyse cinématique démarche basée sur plan ventral d’imagerie pour surveiller les changements subtils dans la coordination motrice ainsi que la progression de la neurodégénérescence avec l’âge dans des modèles murins (p. ex., endophiline mutant lignées de souris).

Démarche analyse des déficiences moteurs fonction de l’âge chez la souris avec la neurodégénérescence

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur le vieillissement et la neurodégénérescence, telles que l’apparition et la progression de la marche et des anomalies motrices avec l’âge, et en particulier, dans des modèles murins de maladies neurodégénératives. Le résultat d’un tel statut peut se traduire par une bien meilleure compréhension des déficiences motrices chez les patients atteints de maladies neurodégénératives, par exemple la maladie de Parkinson ou les ataxies. Le principal avantage de l’analyse de la marche par vidéo est qu’elle permet d’étudier les déficiences motrices subtiles et sévères dans des modèles murins de neurodégénérescence.Commencez par déterminer l’état de santé de chaque animal en l’examinant de près et en le pondérant sur une balance. Appliquez doucement de la peinture rouge au doigt sur les pattes de l’animal à l’aide d’un pinceau. Placez l’animal dans une cage propre et de rechange pendant que la peinture sèche.Ensuite, réglez la vitesse du tapis roulant sur le panneau supérieur droit de l’appareil. Ensuite, placez l’animal dans la chambre d’essai et couvrez-le d’un chiffon foncé pour permettre à chaque animal de s’ajuster pendant une à deux minutes. Allumez la lumière dans la chambre d’essai en tournant l’interrupteur rotatif de la lumière du tapis roulant sur la position marche.Ouvrez un peu le couvercle pour pouvoir observer l’animal pendant la tâche. Démarrez le tapis roulant pendant environ une demi-seconde pour avertir l’animal que la tâche est sur le point de commencer. Tournez le commutateur rotatif du tapis roulant vers l’avant pour démarrer le tapis roulant.Ensuite, cliquez sur le bouton Enregistrer dans le logiciel de l’imageur. Une fois que l’animal court de manière stable, enregistrez pendant au moins cinq secondes avant d’arrêter le tapis roulant. Arrêtez l’enregistrement en cliquant sur Arrêter sur le logiciel de l’imageur et remettez le commutateur rotatif du tapis roulant en position d’arrêt.Ensuite, cliquez sur le bouton Modifier dans le logiciel d’imagerie pour ouvrir un menu dans lequel le point de début et de fin de la section vidéo peut être défini. Naviguez dans la vidéo à l’aide du curseur en bas de l’écran. Pour sélectionner le point temporel actuel comme point de départ ou d’arrivée, cliquez respectivement sur À partir du numéro d’image et À.Assurez-vous que la section contient au moins sept pas par patte ou quatorze pas au total pour que l’animal coure de manière stable à une vitesse constante. Enfin, entrez l’identification de l’animal, la date de naissance, le poids et le sexe. Enregistrez les données à l’emplacement souhaité sur l’ordinateur ou le serveur.Le principe de l’analyse vidéo de la marche est de mesurer la zone de la patte en contact avec la surface au fil du temps pour chaque patte individuelle. De nombreux paramètres de dynamique de marche et de posture peuvent être extraits des vidéos enregistrées, par exemple, le temps d’élan, le temps et la largeur de la position, la longueur de la foulée et la fréquence. D’autres caractéristiques de la marche telles que le coefficient d’ataxie ou la variabilité de l’angle de pas peuvent ensuite être calculées à partir des mesures primaires.Commencez l’analyse vidéo en démarrant le logiciel d’analyse et en cliquant sur Sélectionner le dossier d’étude pour sélectionner le dossier contenant les vidéos enregistrées. Sélectionnez une vidéo et cliquez sur OK.Utilisez la fonction de redessin pour sélectionner la zone où la souris s’exécute. Notez que cette section ne doit contenir que la souris et un fond blanc.Ensuite, entrez des valeurs dans les zones de longueur et de largeur pour modifier le masque qui exclut la zone rouge autour du museau de l’animal pour l’analyse. Ajustez les curseurs pour filtrer le bruit et filtrer la fourrure et les taches sombres pour optimiser l’empreinte des pattes en noir et blanc. Réglez le curseur de bruit du filtre sur 800 à 950 pour les animaux noirs et sur 700 à 800 pour les animaux bruns ou blancs, en fonction de la couleur exacte de la fourrure de l’animal, puis sélectionnez OK.Sélectionnez ensuite une vidéo qui a réussi le premier réglage et sélectionnez la fonction Aller pour lancer l’analyse de la vidéo. Ensuite, sélectionnez une vidéo analysée et cliquez sur OK.Notez que la zone de l’empreinte de patte en contact avec la ceinture au fil du temps pour chaque patte distincte est maintenant visible. Pour comparer la vidéo d’origine et l’empreinte de patte calculée pour la zone sélectionnée, sélectionnez la fonction Lire la vidéo.Pour corriger les petites erreurs, utilisez l’option Corriger, Connecter ou Supprimer. Utilisez l’option Corriger pour supprimer un signal erroné. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquez la bordure gauche de l’objet à supprimer d’un deuxième clic et la bordure droite d’un troisième clic.Utilisez l’option Connecter pour combiner deux signaux. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et double-cliquez au milieu des deux objets à combiner. Utilisez l’option Supprimer pour supprimer complètement les points temporels de l’analyse.Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquez le bord gauche de la zone à supprimer avec le deuxième clic et le bord droit avec le troisième clic. Sélectionnez ensuite Membre suivant pour passer en revue les quatre membres. Notez qu’une fois que l’on a cliqué sur le membre suivant après la dernière patte, le logiciel termine l’analyse et affiche les résultats pour l’animal sur quatre écrans.Enfin, une fois que toutes les vidéos d’une expérience ont été analysées, sélectionnez toutes les vidéos et cliquez sur Réorganiser les résultats pour exporter les résultats. Environ 50 paramètres de marche sont calculés et répertoriés dans le fichier exporté. Triez le résultat par groupe, âge et vitesse de course, et analysez toutes ces conditions indépendamment.Dans l’analyse de la marche chez des souris de type sauvage avec un âge avancé, les résultats ont indiqué que la position avec une largeur d’animal normalisée ne change pas avec l’âge. Cependant, le double appui des membres postérieurs et la charge des membres augmentent avec l’âge chez les animaux de type sauvage. De plus, alors que tous les animaux testés peuvent courir à 30 mètres par seconde à un mois, les mutants de l’endophiline développent des déficits de course en vieillissant.De plus, le rythme de marche est altéré chez les mutants de l’endophiline. Par exemple, le temps de propulsion diminue chez les mutants de l’endophiline à mesure que les souris vieillissent. Lorsque vous tentez la procédure, il est important de se rappeler que l’étape la plus critique est l’enregistrement de la vidéo originale.Toute analyse ultérieure dépend de vidéos de bonne qualité. L’analyse de la marche est une méthode utile pour catégoriser la démarche et le comportement moteur dans des modèles murins de neurodégénérescence. Cependant, certains aspects du comportement moteur, par exemple la force musculaire, ne sont pas évalués de manière adéquate par cette méthode.Mais il s’agit donc d’une commande complétant l’analyse de la marche basée sur la vidéo avec une batterie d’autres tests de comportement moteur, comme la force de préhension et la marche en faisceau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse de la marche dans des modèles murins qui développent une déficience motrice avec le vieillissement.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Évaluation du bilan du moteur et de la coordination des souris en utilisant la poutre d&#39;équilibre

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de test d’empreinte et l’analyse associée pour évaluer la démarche et la coordination motrice chez la souris.

Évaluation de la démarche par l’analyse de l’empreinte : une méthode pour tester la coordination motrice chez la souris

Analyse de la démarche cinématique dans le plan sagittal donne des informations très précises sur la façon dont le mouvement est exécuté. Nous décrivons l’application de ces techniques pour identifier les déficits de la démarche pour les souris soumises à demyelination autoimmun-négociée. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour caractériser les déficits de la démarche pour les autres modèles de souris mettant en vedette la locomotion avec facultés affaiblies.

Analyse cinématique démarche plan sagittal chez les souris C57BL/6 soumis à MOG35-55 induit une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

L’évaluation précise de la réponse de la douleur chez un modèle animal neuropathique est critique pour étudier la physiopathologie des maladies de douleur et élaborer de nouveaux analgésiques. Nous présentons une méthode sensible et objective pour déterminer la fonction sensorielle du rongeur hind patte par un système d’analyse automatisée de démarche.

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L’analyse automatisée de démarche est un outil faisable pour évaluer la récupération fonctionnelle dans les modèles de rongeur des dommages périphériques de nerf et des dommages de contusion de moelle épinière. Bien qu’il ne nécessite qu’une seule configuration pour évaluer la fonction locomotrice dans divers modèles expérimentaux, l’ajustement méticuleux des marchandises dures et douces et la formation des animaux est très important.

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Nous décrivons ici le système RatWalker, construit en redessinant l’appareil MouseWalker pour s’adapter à l’augmentation de la taille et du poids des rats. Ce système utilise la réflexion interne totale frustrée (FTIR), la capture vidéo à grande vitesse et un logiciel d’analyse en libre accès pour suivre et quantifier les paramètres de marche.

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Ce manuscrit présente un ensemble de tests comportementaux hautement reproductibles pour valider un modèle murin du syndrome d’Angelman.

Caractérisation comportementale d’un modèle murin du syndrome d’Angelman

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