Détection des anticorps qui neutralisent l’assimilation de thérapies de remplacement de Enzyme avec un Cell-based Assay

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunogénicité et de la bioanalyse sur l’impact des anticorps neutralisants sur l’innocuité, l’efficacité et les profils pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode cellulaire sensible et biologiquement pertinente pour mesurer les anticorps neutralisants spécifiques aux médicaments de manière semi-quantitative. Dans cette technique, des enzymes marquées au fluorophore pénètrent dans les cellules Jurkat par la liaison d’un résidu de mannose-6-phosphate au récepteur du mannose-6-phosphate indépendant des cations ou CI-M6PR.

Les anticorps neutralisants qui empêchent l’interaction enzyme-récepteur induisent une diminution de la fluorescence mesurée par cytométrie en flux. Pour commencer, ensemencez 7,5 fois 10 à la quatrième cellules Jurkat dans 100 microlitres de milieu de croissance cellulaire par puits dans une plaque de culture cellulaire à fond rond de 96 puits pour une incubation de 14 à 20 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec 95 % d’humidité. Diluez d’abord les échantillons de dosage dans un milieu sans sérum dans un rapport de un à 2,5.

Ajoutez ensuite 60 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés d’une plaque de polypropylène blanc non contraignant à fond rond de 96 puits. Il s’agira de la plaque d’incubation de l’échantillon. Pour les échantillons qui ont été testés positifs et qui doivent être confirmés, utilisez un vortex dans un flacon de thérapie enzymatique substitutive ou de billes ERT et ajoutez le nombre approprié de billes dans un tube conique de 15 millilitres pour un autre vortex.

Placez ensuite le tube dans un support de tube magnétique pendant deux minutes et retirez soigneusement le surnageant. Après le quatrième lavage, ajoutez 100 microlitres de billes dans les puits appropriés d’une nouvelle plaque de polypropylène non liant à fond rond blanc de 96 puits. Lorsque toutes les billes ont été plaquées, placez la plaque sur un aimant latéral à 96 puits et laissez les billes former une pastille avant de retirer soigneusement le surnageant transparent.

Ensuite, ajoutez 140 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés et scellez la plaque avec un film plastique pour l’agiter pendant au moins 60 minutes sur un agitateur rotatif à environ 800 tr/min à température ambiante. Placez ensuite la plaque de confirmation sur l’aimant à jupe latérale à 96 puits pour permettre aux billes de former une autre pastille et ajoutez 60 microlitres d’échantillon dans les puits appropriés d’une plaque d’incubation d’échantillon en polypropylène blanc à fond rond non contraignant à 96 puits. Pour les échantillons qui ont été dépistés et qui sont confirmés positifs, une série de titres peut être effectuée.

Pour préparer une série de titres, diluer en série l’échantillon dans la matrice groupée un nombre suffisant de fois pour franchir le point de coupure de titre prédéterminé et ajouter 60 microlitres de chaque échantillon dilué dans les puits appropriés de la plaque d’incubation de l’échantillon et 60 microlitres des concentrations appropriées d’ERT marqué au fluorophore dans les puits appropriés d’une nouvelle plaque de polypropylène blanc non contraignant à fond rond de 96 puits conformément au protocole de texte. Ensuite, pipetez plusieurs fois la solution d’échantillon de fluorophore ERT pour mélanger et envelopper les plaques dans du papier d’aluminium pour une incubation de 14 à 20 heures à deux à huit degrés Celsius. Le lendemain matin, réchauffez les plaques d’échantillon dans un bain de billes à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes et vérifiez les cellules plaquées au microscope inversé pour confirmer que les cellules sont saines et uniformément réparties dans les puits.

Lorsque les plaques se sont réchauffées, ajoutez 100 microlitres d’échantillon et de mélange ERT marqué au fluorophore dans la plaque cellulaire conformément à la carte expérimentale des plaques et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant encore trois heures et 15 minutes. A la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation et confirmez la présence d’une pastille au fond de chaque puits. En tenant la plaque à un angle de 30 à 45 degrés, retirez soigneusement le surnageant dans chaque puits sans déranger les granulés et lavez les cellules trois fois dans 200 microlitres de DPBS par puits et par centrifugation.

Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de teinture morte vivante dans chaque puits pour une incubation de 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation et lavez les cellules avec 200 microlitres de DPBS par puits. Remettez en suspension les granulés lavés dans 100 microlitres de deux à huit degrés Celsius 1 % de paraformaldéhyde par puits et scellez la plaque pour un vortex d’impulsion doux.

Ensuite, enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium pour une fixation de 10 minutes entre deux et huit degrés Celsius. Pour analyser la viabilité cellulaire par cytométrie en flux, mélangez les cellules avec 50 microlitres de DPBS par puits pour obtenir une suspension unicellulaire et lisez les cellules sur un cytomètre en flux selon les protocoles standard de cytométrie en flux. L’absorption de l’ERT conjuguée aux fluorophores peut ensuite être évaluée en fonction de l’intensité médiane de fluorescence ou MFI des cellules individuelles vivantes.

Avant d’être testé dans le test, un seuil de dépistage expérimental est calculé comme seuil pour déterminer les échantillons positifs et négatifs. Dans cet exemple, des contrôles de qualité enrichis par des quantités élevées ou faibles d’anticorps neutralisants sont présentés. Les échantillons positifs sont ensuite testés dans un test de confirmation à l’aide de billes magnétiques conjuguées aux médicaments pour épuiser l’anticorps spécifique du médicament des échantillons.

Les échantillons dont le taux de récupération est supérieur au seuil de confirmation sont considérés comme positifs. Les échantillons qui ont été dépistés et confirmés positifs sont dilués en série et testés dans le test de titre pour déterminer le titre relatif des anticorps neutralisants dans chaque échantillon. Le titre est la valeur interpolée entre deux dilutions qui franchissent le point de coupure du titre.

Sur la photo, les IMF unicellulaires vivantes ont évalué l’absorption de l’ERT conjuguée aux fluorophores. Par exemple, dans cette expérience, la matrice a été enrichie par l’absorption conjuguée de l’ERT par l’anticorps de contrôle positif, ce qui a entraîné une faible intensité médiane de fluorescence. En revanche, les cellules incubées avec la matrice en l’absence de l’anticorps de contrôle positif ont présenté une intensité de fluorescence médiane plus élevée, démontrant l’absorption de l’ERT conjugué au fluorophore.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des fenêtres d’incubation strictes pour obtenir des résultats fiables et cohérents. Il est également important d’optimiser le dosage de chaque enzymothérapie substitutive. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux scientifiques en immunogénicité et en bioanalyse dans le développement de médicaments pour explorer l’impact des anticorps neutralisants sur l’innocuité et l’efficacité de l’ERT.

N’oubliez pas que travailler avec des échantillons humains peut être extrêmement dangereux et que tous les échantillons doivent être traités comme s’ils étaient potentiellement infectieux lors de l’exécution de cette procédure.