Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte
25 août 2018
Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.
L’objectif général de cette vidéo est de présenter une nouvelle méthode simple pour isoler et cultiver des cellules épidermiques humaines primaires à partir d’un tissu cutané adulte. Cette méthode avancée est plus adaptée à la production d’un grand nombre de cellules épidermiques à haut potentiel pour des applications de laboratoire et cliniques. Lavez le mouchoir avec du PBS avant de le peser.
Pesez le tissu cutané à l’aide d’une balance électronique. Rincez le tissu cutané avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes. Incuber le tissu dans le PBS avec des antibiotiques deux fois pendant cinq minutes à chaque fois.
Transférez le tissu dans une autre boîte stérile et homogénéisez soigneusement à l’aide de lames de scalpel. Ajoutez 200 microlitres de PBS toutes les cinq minutes pour garder le tissu humide. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube de 50 millilitres.
Ajoutez 10 millilitres de mélange d’enzymes pour chaque gramme de tissu cutané. Mélangez soigneusement les enzymes avec les tissus homogénéisés. Incuber le mélange dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en secouant.
Après cela, ajoutez 1/5 du volume de 0,25 % de trypsine. Poursuivez l’incubation pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajouter la solution de Dnase I au mélange dans un rapport de un à 100.
Ensuite, incubez encore cinq minutes. Arrêtez le processus de digestion en ajoutant le même volume de milieu de neutralisation. Pipetez la solution de haut en bas environ 20 fois.
Filtrez les cellules dissociées à travers une passoire de 100 micromètres pour éliminer les débris tissulaires. Centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Observez la pastille au fond du tube.
Retirez les surnageants et lavez la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu de neutralisation. Puis centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’inoculation avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires.
Plaquez deux fois 10 à la sixième cellules dans une boîte de culture de 100 millimètres. Après trois jours, remplacez le milieu d’inoculation par un milieu de kératinocytes sans sérum. Changez de milieu tous les deux jours.
Lorsque les cellules ont atteint environ 80 % de la densité, passez les cellules. Lavez les cellules avec du PBS. Si nécessaire, essayez de le faire pendant deux minutes et lavez les cellules avec du PBS pour éliminer les cellules dermiques contaminées.
Ajouter le même volume de milieu de neutralisation. Centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Enfin, retirez les surnageants et remettez en suspension la pastille cellulaire.
Les kératinocytes isolés de tissus cutanés humains ont été incubés séparément par deux méthodes. La méthode conventionnelle est une digestion en deux étapes qui implique une procédure de deux jours. En revanche, la nouvelle méthode est une digestion en une seule étape qui prend environ trois heures.
Le troisième jour, nous pouvons facilement trouver de nombreux amas de cellules cultivés par la nouvelle méthode, alors que ce phénomène ne se produit pas avec la méthode conventionnelle. Le cinquième jour, il a été observé que la nouvelle méthode produisait une plus grande quantité de cellules primaires. Pour tester l’état de différenciation des kératinocytes en culture, nous avons analysé le marqueur basal K5 et le marqueur de différenciation terminale Loricrin.
Nous avons constaté que 90 % des cellules totales étaient K5 positives, mais que moins de 10 % des cellules exprimaient Loricrin au passage trois, ce qui indique qu’il s’agit de kératinocytes indifférenciés. Nous avons vérifié l’expression de la vimentine qui est exprimée dans le fibroblaste dermique afin d’examiner la contamination des cellules dermiques lors de l’isolement. Nous avons constaté qu’environ 3 % des cellules dermiques apparaissaient lors du passage initial, mais que seulement environ 0,02 % des cellules dermiques étaient détectées lors du passage trois, ce qui indique une grande pureté des cellules épidermiques après le passage.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole simplifié pour isoler les kératinocytes humains primaires à partir de tissus cutanés adultes. La méthode utilise l'inhibiteur ROCK Y-27632 pour faciliter la séparation des cellules épidermiques des cellules dermiques.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Dermatologie
- Médecine régénérative
Contexte
- Les kératinocytes humains primaires sont essentiels pour diverses applications de recherche.
- Les méthodes d'isolement conventionnelles peuvent être complexes et chronophages.
- L'utilisation de l'inhibiteur ROCK Y-27632 offre une approche plus efficace.
- Les kératinocytes isolés peuvent être utilisés dans des contextes de laboratoire et cliniques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode plus efficace pour isoler les cellules épidermiques.
- Améliorer le rendement des cellules épidermiques à fort potentiel.
- Faciliter la recherche et les applications cliniques impliquant des cellules cutanées.
Méthodes utilisées
- Laver le tissu cutané avec du PBS avant de le peser.
- Peser le tissu cutané à l'aide d'une balance électronique.
- Rincer le tissu avec de l'éthanol à 70 % pendant 30 secondes.
- Incuber le tissu dans du PBS avec des antibiotiques deux fois pendant cinq minutes chacune.
Résultats principaux
- Le protocole isole avec succès les kératinocytes primaires.
- Des rendements élevés de cellules épidermiques viables ont été obtenus.
- La méthode est reproductible et efficace.
- Les cellules isolées peuvent être utilisées pour diverses applications.
Conclusions
- Cette méthode simplifie l'isolement des kératinocytes primaires.
- Elle fournit une approche fiable pour les chercheurs dans le domaine.
- L'utilisation de l'inhibiteur ROCK améliore le rendement et la viabilité cellulaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
