Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

L’objectif général de cette vidéo est de présenter une nouvelle méthode simple pour isoler et cultiver des cellules épidermiques humaines primaires à partir d’un tissu cutané adulte. Cette méthode avancée est plus adaptée à la production d’un grand nombre de cellules épidermiques à haut potentiel pour des applications de laboratoire et cliniques. Lavez le mouchoir avec du PBS avant de le peser.

Pesez le tissu cutané à l’aide d’une balance électronique. Rincez le tissu cutané avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes. Incuber le tissu dans le PBS avec des antibiotiques deux fois pendant cinq minutes à chaque fois.

Transférez le tissu dans une autre boîte stérile et homogénéisez soigneusement à l’aide de lames de scalpel. Ajoutez 200 microlitres de PBS toutes les cinq minutes pour garder le tissu humide. Transférez le tissu homogénéisé dans un tube de 50 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de mélange d’enzymes pour chaque gramme de tissu cutané. Mélangez soigneusement les enzymes avec les tissus homogénéisés. Incuber le mélange dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en secouant.

Après cela, ajoutez 1/5 du volume de 0,25 % de trypsine. Poursuivez l’incubation pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajouter la solution de Dnase I au mélange dans un rapport de un à 100.

Ensuite, incubez encore cinq minutes. Arrêtez le processus de digestion en ajoutant le même volume de milieu de neutralisation. Pipetez la solution de haut en bas environ 20 fois.

Filtrez les cellules dissociées à travers une passoire de 100 micromètres pour éliminer les débris tissulaires. Centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Observez la pastille au fond du tube.

Retirez les surnageants et lavez la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu de neutralisation. Puis centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’inoculation avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires.

Plaquez deux fois 10 à la sixième cellules dans une boîte de culture de 100 millimètres. Après trois jours, remplacez le milieu d’inoculation par un milieu de kératinocytes sans sérum. Changez de milieu tous les deux jours.

Lorsque les cellules ont atteint environ 80 % de la densité, passez les cellules. Lavez les cellules avec du PBS. Si nécessaire, essayez de le faire pendant deux minutes et lavez les cellules avec du PBS pour éliminer les cellules dermiques contaminées.

Ajouter le même volume de milieu de neutralisation. Centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Enfin, retirez les surnageants et remettez en suspension la pastille cellulaire.

Les kératinocytes isolés de tissus cutanés humains ont été incubés séparément par deux méthodes. La méthode conventionnelle est une digestion en deux étapes qui implique une procédure de deux jours. En revanche, la nouvelle méthode est une digestion en une seule étape qui prend environ trois heures.

Le troisième jour, nous pouvons facilement trouver de nombreux amas de cellules cultivés par la nouvelle méthode, alors que ce phénomène ne se produit pas avec la méthode conventionnelle. Le cinquième jour, il a été observé que la nouvelle méthode produisait une plus grande quantité de cellules primaires. Pour tester l’état de différenciation des kératinocytes en culture, nous avons analysé le marqueur basal K5 et le marqueur de différenciation terminale Loricrin.

Nous avons constaté que 90 % des cellules totales étaient K5 positives, mais que moins de 10 % des cellules exprimaient Loricrin au passage trois, ce qui indique qu’il s’agit de kératinocytes indifférenciés. Nous avons vérifié l’expression de la vimentine qui est exprimée dans le fibroblaste dermique afin d’examiner la contamination des cellules dermiques lors de l’isolement. Nous avons constaté qu’environ 3 % des cellules dermiques apparaissaient lors du passage initial, mais que seulement environ 0,02 % des cellules dermiques étaient détectées lors du passage trois, ce qui indique une grande pureté des cellules épidermiques après le passage.