Name: Explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez la technologie de feuilles cellulaires pour modéliser le carcinome hépatocellulaire sur rats nus. Cette méthode permet d'évaluer l'effet des cellules souches mésenchymateuses sur le développement tumoral in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel de la chirurgie expérimentale et les animaux de laboratoire à la faculté de médecine, Université du Roi Saoud, pour leur coopération et soutien-surtout Hussain Almukhayzim et Hisham Aloudah. Les auteurs aimerait également remercier l’équipe de médias à la King Saud bin Abdul-Aziz University pour préparer le visuel matériel, surtout Muath bin Ghannam et Abdulwahab Alsulami.

Le protocole suit les directives de protection des animaux du Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Interventions chirurgicales et anesthésiques autres médicaments utilisés pour les animaux sont approuvés par le Comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud. Tous les travaux expérimentaux sont effectuée par un personnel convenablement formé.
1. cellule feuille Construction
<ol><li>Enduire le Pétri (3,5 cm température Pétri) de sérum non dilué fœtal (SVF) et faire en sorte de couvrir toute la surface du plat. Remarque : Cette étape est importante pour le détachement de la feuille de la cellule car elle favorise la croissance des cellules dans une monocouche et empêche l’agrégation cellulaire.</li>
	<li>Incuber les plats pendant 24 h à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO2 et 95 % d’air.</li>
	<li>Enlever l’excès FBS de la vaisselle couchée et laissez la vaisselle sécher à température ambiante (RT) pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Préparer les suspensions de trois cellules : 1 x 106 HepG2 cellules, cellules de 1 x 106 HepG2 avec BMMSCs et 1 x 106 HepG2 cellules avec UCMSCs (dans une proportion de 4:1 pour BMMSCs et UCMSCs).</li>
	<li>Graine de la suspension cellulaire appropriée à chaque plat marqué.</li>
	<li>Suspendre toutes les cellules dans un milieu de culture DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO2 et 95 % d’air.</li>
</ol>2. cellule feuille détachement
<ol><li>Au confluent de 100 % de cellules, prendre la vaisselle hors de l’incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>Incuber le plat de feuille cellulaire HepG2 pendant 1 h à RT, tout en incubant les HepG2/BMMSC et HepG2/UCMSC cellule feuille plats pendant 30-40 min à 20 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % CO2 et 95 % d’air. Remarque : La plaque de cellules fabriquée à partir de seulement HepG2 est fragile ; réduire la température à 20 ° C provoque des dommages à la structure de la feuille.</li>
</ol>3. exécution de la procédure chirurgicale
Remarque : Au cours de la période d’incubation pour le détachement de feuille de la cellule, démarrer la procédure de l’animale.
<ol><li>
Instructions pour la préparation de la zone de chirurgie
	<ol>
<li>Effectuer toutes les interventions chirurgicales dans une zone stérile distincte au sein du laboratoire, par exemple une hotte à flux laminaire et une salle de chirurgie aseptique. S’assurer que toutes les surfaces de la région de chirurgie sont non poreux, étanche, durable et nettoyables.</li>
		<li>Porter un équipement de protection adéquat, notamment des gommages, des gants, masques faciaux et tête et couvre-chaussures.</li>
		<li>Utilisation chirurgicale des outils qui sont propre et stérilisé (par autoclavage ; tige saturée sous haute pression) au début de la chirurgie.</li>
		<li>Changer entre les rats.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de l’animal pour la chirurgie
	<ol>
<li>Utiliser des rats nus âgés de 8 à 12 semaines.</li>
		<li>Créer une anesthésie injectable pour les rats.<ol>
<li>Pour préparer la solution d’anesthésie, kétamine-xylazine, mélanger 1 mL de solution saline physiologique stérile (par exemple, le chlorure de sodium 0,9 %) dans un flacon stérile 10 mL sérum, 1 mL de xylazine (à une concentration de 20 mg/mL) et 2 mL de kétamine et bien agiter avant utilisation.</li>
			<li>Pour appliquer l’anesthésie, injecter par voie intrapéritonéale 0,2 mL de la solution de kétamine-xylazine par 100 g de poids corporel du rat. Remarque : La dose totale de la solution est de 100 mg/kg de la kétamine et 10 mg/kg de xylazine.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Retirer saletés/débris visibles sur le site chirurgical.</li>
		<li>Vérifier la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de retrait pédale (pied touche pincée sur les deux pattes). Remarque : Si la pincée de pad pied provoque une réponse, répéter à une dose de 0,05 mL/100 g (environ toutes les 30 min), puis re-vérifier la profondeur de l’anesthésie.</li>
		<li>Désinfecter la zone de chirurgie avec un gommage bi-étagé de povidone-iode/isopropanol.</li>
		<li>Couvrir le rat avec un drap stérile pour éviter toute contamination de l’incision.</li>
		<li>Injecter les rats par voie sous-cutanée avec la buprénorphine (0,01 - 0,05 mg/kg)8 avant de faire l’incision.</li>
		<li>À l’aide d’un scalpel stérile, faire un 7 à 10 cm couper entre la peau et les muscles sous-jacents pour exposer le foie.<ol>
<li>Séparer les muscles abdominaux de la peau avec le bord plat arrière du scalpel.</li>
			<li>Poignarder soigneusement la linea alba à l’aide d’un scalpel et d’étendre la coupe avec des ciseaux pointus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cellule feuille Transplantation
Remarque : La transplantation de cellules feuille est effectuée sur le foie.
<ol><li>Recueillir la plaque de cellules de la boîte de Pétri.<ol>
<li>Tapotez doucement le plat de la culture sur le banc pour détacher la feuille de sa surface.</li>
		<li>Séparer la plaque de cellules de surface de la capsule en grattant le bord de la feuille dans un demi cercle à l’aide d’un embout de la pipette stérile.</li>
		<li>Retirez délicatement le support complet de la boîte de Pétri.</li>
		<li>S’assurer que la feuille est intacte sans aucun dommage ; dans le cas contraire, il ne peut pas être utilisée (Figure 1). Remarque : Les feuilles qui en résulte peuvent être détectées directement par le œil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une membrane stérile (papier filtre) pour récolter la plaque de cellules du plat.<ol>
<li>Tout d’abord, faire tremper la membrane avec un soluté physiologique. Ensuite, retirez l’excès saline avec un tampon de coton stérile.</li>
		<li>Placer la membrane humide sur la plaque de cellules, tout en évitant les plis et les bulles d’air entre la membrane et la feuille de la cellule.</li>
		<li>Ajouter quelques gouttes de sérum physiologique sur la membrane et la plaque de cellules pour les recueillir plus facilement. Remarque : Pour éviter de casser la plaque de cellules, ne sont pas utiliser de sérum physiologique froid et soulever la membrane et la plaque de cellules avec une pince.</li>
		<li>Laisser la membrane pendant quelques secondes pour s’assurer que la feuille de la cellule est bien fixée à la membrane et puis il recueille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le foie pour la transplantation de cellules feuille.<ol>
<li>Assurez-vous que la surface du foie est sec en tapant doucement avec un tampon de coton stérile.</li>
		<li>À l’aide d’une pince stérile, placer la membrane avec la plaque de cellules sur un seul lobe de foie de rat.</li>
		<li>Ajouter quelques gouttes de sérum physiologique et appliquez une légère pression à la membrane pour détacher la plaque de cellules de celle-ci.</li>
		<li>Attendre 5 min avant de retirer soigneusement la membrane. NOTE : Ceci est fait pour s’assurer que la feuille de la cellule est correctement branchée sur le foie.</li>
		<li>Enfin, fermer les muscles sous-jacents et incisions avec sutures en nylon de 5-0 de la peau.</li>
		<li>Désinfecter la zone de chirurgie avec la povidone iodée. Remarque : Figure 2 montre un schéma de la procédure de transplantation cellulaire feuille sur le foie d’un rat nu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. après la chirurgie soins
<ol><li>Immédiatement après la chirurgie, loger le rat individuellement pour éviter le cannibalisme ou suffocation et surveiller régulièrement (au moins toutes les 15 min) jusqu'à ce qu’elle est consciente et entièrement ambulant.</li>
	<li>Ensuite, évaluer les rats par jour pendant 5-14 d, au moins 5 jours après l’intervention, pour s’assurer qu’il n’y a pas de complications. Lors de l’évaluation quotidienne, s’assurer de ce qui suit.<ol>
<li>La plaie est fermée, et les sutures sont intacts, sans être trop serré.</li>
		<li>Il n’y a aucun signe d’infection du site d’incision, comme la chaleur, excès, gonflement ou purulent décharge.</li>
		<li>Il n’y a pas de signes associés à la douleur, tels que la consommation de nourriture et d’eau a diminué, perte de poids, déshydratation, peau sous la tente ou respiration par la bouche ouverte et rapide. Au contrôle douleur modérée à sévère après l’intervention, le cas échéant, injecter les rats par voie sous-cutanée avec la buprénorphine (0,01 - 0,05 mg/kg) chaque 6-8 h9 pendant au moins 48 à 72 heures après l’opération.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analyse de la zone transplantée
<ol><li>Un mois après la transplantation, scarifice le rat et recueillir la zone transplantée pour histologique et immunohistochimique analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088(2010).</li>
<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
<li>Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats">https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats</a> (2017).</li>
<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
<li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).</li>
<li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reports%22%5BJournal%5D)">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li>
<li>Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+in+vivo+cancer+model+using+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering.</a> Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une quantité considérable de recherche se consacre au développement adéquat en vivo précliniques modèle animal qui ressemble à des cancers humains. Actuellement, les principales approches utilisées pour créer des modèles animaux de cancer impliquent de transplantation de génie génétique et la cellule11. Modèles animaux génétiquement modifiés sont de bons outils pour l’identification et la validation des gènes cibles, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ...

HCC est un cancer primitif du foie qui est significativement associé à un mauvais pronostic. Chaque année, presque un demi-million de nouveaux patients sont diagnostiqués avec HCC, qui représentent 85 % des patients de cancer du foie dans le monde1. Hepatocarcinogenesis n’est pas une maladie unique-forme ; C’est plutôt un ensemble de maladies qui ont différentes caractéristiques histopathologiques et variabilité génétique et génomique, outre varié résultats pronostiques1. Par conséquent, les principaux défis à l’élaboration d’une stratégie thérapeutique efficace pour HCC sont la connaissance limitée de la biologie de la HCC et l’absence d’un modèle animal expérimental adapté qui peut aider à comprendre cette maladie complexe. Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme est nécessaire pour la sélection des gènes candidats et d’identifier des marqueurs pronostiques/prédictifs impliqués dans l’induction du cancer, ainsi que pour l’étude des différents facteurs qui peuvent influer sur les réponses du cancer d’agents thérapeutiques.
Des études in vitro du cancer sont toujours associées à des limites importantes. Cela est dû au fait que les cellules cancéreuses perdent beaucoup de leurs caractéristiques en vivo lorsque maintenu en culture. Les changements qui se produisent à des cellules in vitro résultat de l’absence de la physiologie du tissu entier dans un cadre ex vivo . Interaction de cellule-cellule de cancer (stromal, immunitaire, système vasculaire, épithélial, etc.) dans le microenvironnement tumoral reflète grandement sur le cancer cellule caractéristiques2. Le microenvironnement tumoral pourrait modifier expression de gènes/protéines de cellules du cancer et des caractéristiques phénotypiques, outre ANGIOGÉNÉTIQUE et potentiel métastatique. Le système de culture à deux dimensions (2d) in vitro manque également une matrice convenable, ce qui est nécessaire pour réguler la progression tumorale. Ainsi, en raison de ces limitations, en vivo modèles toujours devraient être utilisés pour appuyer les conclusions préliminaires de in vitro des modèles. Dans cette étude, nous utilisons la technologie de feuille de cellule à développer un modèle in vivo animal qui élucide le processus biologique qui sous-tendent la HCC.
Plus de dix ans, laboratoire de Okano mis en place une nouvelle méthode de l’ingénierie tissulaire, basé sur la cellule feuille technologie3. Cette technique utilise un plastique thermo-sensible de la culture pour permettre l’adhérence/détachement de cellule réversible en contrôlant l’hydrophobicité de la surface. Cette méthode permet une récolte douce des cellules cultivées en intact en trois dimensions (3d) forme (feuille de i.e.,cell), avec une bien gardé de la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule. La technique de feuille de cellule nécessite le PRELIMINAIRE de Pétri avec une poly(N-isopropylacrylamide) de température-responsive polymer (suis PIPA), qui est commercialement disponible et prêt à l’emploi. À une température inférieure à 20 ° C, polymères PIPA suis deviennent hydratées et dissolvent en solution aqueuse, considérant que, à une température plus élevée (37 ° C), les polymères sont déshydratent et se transforment en un précipité turbide. Le polymère contient des chaînes de l’amide hydrophile et chaînes latérales hydrophobes (groupes isopropyles). À des températures élevées, le mouvement brownien des molécules d’eau s’intensifie, considérant que, à basse température, les molécules de l’eau qui entoure les groupes isopropyle de la rupture de la structure hydratés et les groupes de l’isopropyl hydrophobe agréger en raison des interactions hydrophobes. Par conséquent, l’ensemble de la chaîne du polymère et agrégats précipite4.
Dans l’étude présentée, cette technique est employée pour développer un modèle animal de HCC à l’aide de trois feuillets cellulaires différentes. La première feuille employée se compose de HCC ligne cellules seulement, alors que les deux autres feuilles sont constitués d’une combinaison de cellules de la lignée cellulaire HCC et MSCs de deux sources différentes : MSCs (BMMSCs) de la moelle osseuse et du cordon ombilical MSCs (UCMSCs). MSCs sont des cellules stromales non hématopoïétiques capables de différencier les intocell dérivés de la lignée mésenchymateuse, incluant les adipocytes, les ostéocytes, les chondrocytes et les myocytes5. La raison pour laquelle que nous employons ces cellules lors de la création de la plaque de cellules de cancer est la contradiction du rapport sur l’effet de MSCs sur les cancers. Il a été suggéré que MSCs peuvent avoir deux phénotypes distincts : « MSC1 », un phénotype pro-inflammatoire et « MSC2 », un immunosuppresseur phénotype6. MSCs expriment des récepteurs toll-like (TLRs). TLR4 amorçage de MSCs augmente leur sécrétion de facteurs pro-inflammatoires, alors que l’amorçage TLR3 augmente leur sécrétion de facteurs immunosuppresseurs6. Une étude in vitro de ces deux phénotypes ont signalé qu’une co-culture de MSC1 avec des lignées de cellules cancéreuses atténue de croissance des cellules cancéreuses, tandis que MSC2 co-culture a l' opposé de l’effet7. Cela implique que MSCs peuvent être Pro-cancer ou anticancéreux, selon leur phénotype. Ainsi, en plus de développer le modèle animal de HCC en utilisant la technologie de cellule feuille, nous voulons explorer l’effet des transplantations MSC sur le développement de tumeurs, ainsi qu’à l’aide de ces cellules va accroître ou réduire le développement de ce modèle.

<table><tbody><tr><td><Réactifs>fortsnbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp ;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>Technologie de la vie</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Saline physiologique stérile</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire HepG2 humaine</td><td>ATCC, USA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Moelle osseuse humaine Lignée cellulaire MSCs</td><td>PromoCell, USA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>tissu de cordon ombilical humain MSCs</td><td>PromoCell, USA&nbsp ;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine 50 %</td><td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2 %</td><td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine&reg ; &nbsp ; solution.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>Jetables :&nbsp ; </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Polypropylène Haute Clarté</td> PP <td>Tube à Centrifuger Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>boîtes de culture UpCell stériles de 3,5 cm avec le papier filtre (membrane)</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 & micro ; l &nbsp ; Pointes de pipette&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Procédure de base Drape</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp ; Pipette </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus, volume variable</td><td>Eppendorf&reg ; &nbsp ; Recherche&reg ;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire 37 &deg ; C, 5 % CO2</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire 20 &deg ; C, 5 % CO2</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outils chirurgicaux stériles et rats nus :&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel à ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Suture en nylon&nbsp ; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilament, Lancet</td></tr><tr><td>1 ml Seringues à tuberculine</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Rats nus&nbsp ;</td><td>Rivière</td><td></td><td></td> Charles</tr></tbody></table>

explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire in vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Un modèle in vivo animal qui imite le cancer chez l’homme pourrait avoir plusieurs applications qui fournissent des informations cliniques significatifs. Les techniques actuellement utilisées pour le développement de modèles in vivo de cancer ont des limites considérables. Par conséquent, dans cette étude, nous visons à mettre en œuvre de la technologie des piles à feuille pour développer un modèle de cancer in vivo . Carcinome hépatocellulaire (CHC) est développé avec succès chez le rat nude en utilisant des feuilles de cellule créées à partir des cellules de la lignée cellulaire HCC. Les feuilles de cellules de cancer sont générés par adhérence intracellulaire et la formation d’une structure stratifiée, contrôlée par la matrice extracellulaire. Cela permet la transplantation de feuille HCC dans le foie et la création d’un modèle animal de tumeur-roulement, moins d’un mois. En outre, on étudie le rôle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans le développement de ce modèle de cancer. En plus de la plaque de ligne de cellules HCC, un autre des feuilles de deux cellules sont créées : une feuille de cellules HCC et moelle osseuse MSCs (BMMSCs) et une feuille de cellules HCC et cordon ombilical MSCs (UCMSCs). Les feuilles qui ont une combinaison des cellules de la HCC et MSCs sont aussi capables de produire un animal avec tumeur. Toutefois, l’ajout de MSCs réduit la taille de la tumeur formée, et cet effet néfaste sur le développement de tumeurs varie selon source des MSCs utilisé. Cela indique qu’il pourrait utiliser une feuille de cellules de certains sous-types MSC dans le contrôle et la gestion de la tumeur.

Tumorigénicité des feuilles de transplantation cellulaire chez les Rats :
Un mois après la transplantation, toutes les feuilles de cellules transplantées dans le foie des rats ont développé des tumeurs (Figure 3). La taille moyenne des tumeurs développées de HepG2, HepG2/BMMSC et les feuilles de cellulaire HepG2/UCMSC étaient de 4,5 cm, 4 cm et 2,5 cm, respectivement<sup class="xref...

Nous présentons ici un protocole visant à développer un modèle cancer in vivo à l’aide de la technologie des cellules feuille. Un tel modèle pourrait être très utile pour l’évaluation des traitements anticancéreux.

Explorer le potentiel des cellules souches mésenchymateuses feuille sur le développement du carcinome hépatocellulaire In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Bonjour, je suis le Dr Alaa Alshareeda du Centre international de recherche médicale du roi Abdallah au Département des cellules souches et de la médecine régénérative. Aujourd’hui, nous allons démontrer l’effet des cellules souches mésenchymateuses sur le développement du carcinome hépatocellulaire sur un modèle de rat en utilisant la technologie des feuilles cellulaires. Bonjour, je suis Abdullah Almubarak.Je travaille en chirurgie expérimentale et en laboratoire animalier à l’Université King Saoud. Nous utilisons le rat nu pour éviter tout rejet après la transplantation de la feuille cellulaire. Ce schéma montre la procédure de transplantation de feuilles cellulaires sur des rats nus.Des rats nus âgés de huit à 12 semaines seront utilisés dans cette étude. Tout d’abord, entaillez les rats et faites une coupe de sept à dix centimètres entre la peau et les muscles sous-jacents à l’aide d’un scalpel afin d’exposer le foie. Pour transférer la feuille de cellule, utilisez une membrane stérile.Placez la membrane sur la feuille de cellule pour la recueillir. Ensuite, placez la feuille cellulaire avec la membrane sur un lobe du foie. Construction en feuille de cellule.Avant d’ensemencer les cellules, enduire des boîtes de culture UpCell sensibles à la température de 3,5 centimètres de FBS non dilué. Le revêtement des boîtes avec du FBS favorise la croissance des cellules dans la couche membranaire et empêche la dégradation des cellules. Assurez-vous de couvrir toute la surface de la vaisselle.Incuber les plats pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air. Le lendemain, retirez l’excédent de FBS et laissez la vaisselle sécher à température ambiante pendant au moins une heure. Ensemencer au moins un million de cellules cancéreuses de l’hépatite G2 seules ou en co-culture avec des cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture DMEM.Le milieu a été complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Le rapport utilisé entre les cellules cancéreuses et les cellules souches mésenchymateuses dans cette étude est de 4:1. Après avoir ajouté les cellules, secouez doucement les plats.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air. Détachement de la feuille de cellule. À 100 % de la confluence cellulaire, sortez les plats de l’incubateur à 37 degrés Celsius.Maintenant, incubez la feuille de cellules cancéreuses de l’HepG2 pendant une heure à température ambiante, tandis que l’incubation de l’HepG2 co-cultivée avec des cellules souches mésenchymateuses pendant 30 à 40 minutes à 20 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone pour 95 % d’air. Pendant le temps d’incubation pour le détachement de la feuille cellulaire, commencez la procédure animale. Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université du Roi Saoud.Réalisation de l’intervention chirurgicale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de retrait de la pédale. Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’iode.Maintenant, appliquez un deuxième gommage à l’iode. Couvrez l’animal avec un champ stérilisé pour éviter la contamination de l’incision. À l’aide d’un scalpel stérilisé, faites une incision entre la peau et les muscles sous-jacents, d’une taille d’environ sept à dix centimètres, pour exposer le foie.Séparez le muscle abdominal de la peau avec le bord arrière plat du scalpel. Poignardez soigneusement la linea alba à l’aide d’un scalpel et étendez la coupe avec des ciseaux bien aiguisés. Greffe de feuille cellulaire sur le foie de rat.Tapotez doucement la boîte de culture sur le banc pour détacher la feuille de sa surface. Séparez la feuille de cellule de la surface du plat en raclant les bords de la feuille en demi-cercle. Maintenant, retirez délicatement tout le milieu de culture du plat.Assurez-vous que la feuille est intacte sans aucun dommage, sinon elle ne peut pas être utilisée. Préparez une membrane stérile pour récolter et transférer la feuille cellulaire. Donc, tout d’abord, trempez la membrane avec une solution saline normale, puis retirez l’excès de solution saline avec un coton-tige stérile.Placez la membrane humide sur la feuille cellulaire, tout en évitant les bulles d’air entre la membrane et la feuille cellulaire. Ajoutez quelques gouttes de solution saline normale sur la membrane et la feuille cellulaire pour recueillir le matériau. Laissez la membrane pendant quelques secondes pour vous assurer que la feuille de cellule est correctement fixée sur la membrane, puis récupérez-la.Maintenant, préparez le foie pour la transplantation. Assurez-vous que la surface du foie est sèche. Placez la membrane avec la feuille cellulaire sur un seul lobe du foie du rat.Ajoutez quelques gouttes de solution saline stérilisée pour détacher la feuille cellulaire de la membrane. Attendez cinq minutes avant de retirer soigneusement la membrane. La feuille cellulaire peut être vue attachée sur le foie dans cette vidéo.Enfin, fermez les muscles sous-jacents et les incisions cutanées avec cinq points de suture en nylon. Après avoir fermé l’incision, désinfectez la zone chirurgicale avec de la bétadine. Le temps entre l’anesthésie et la tête haute est variable, mais se situe généralement entre cinq et 20 minutes.Cette figure montre la tumeur développée sur le foie du rat après un mois de greffe de feuille cellulaire HepG2. Ici, la tumeur a été développée après la transplantation de cellules cancéreuses HepG2 fabriquées par feuille de cellules et de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Alors que celle-ci montre, la plus petite tumeur développée sur le foie de rat après la transplantation d’une feuille cellulaire fabriquée à partir de cellules cancéreuses HepG2 et de cellules souches mésenchymateuses de la corde obilicale, Cette figure montre la coloration H et E du foie de rat après un mois de transplantation de feuille cellulaire.Où A représente les cellules hépatiques normales du rat et B montre les cellules hépatiques cancéreuses du rat. Conclusion. Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de développer un modèle de carcinome hépatocellulaire sur un rat nu en utilisant la technologie des feuilles cellulaires. Merci d’avoir regardé.

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