balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

L’installation d’élevage peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’écologie larvaire, de l’encrassement biologique et de la biologie évolutive. Plus précisément, il peut être utilisé dans des études sur les interactions récepteur-ligand lors de la fixation larvaire, le développement de nouvelles technologies antifouling et l’évolution et la fonction des gènes impliqués dans l’osmorégulation. Le principal avantage de cet organisme modèle est que la balane Balanus improvisus est robuste, se reproduit toute l’année et a une durée de génération relativement courte.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’élevage des balanes, elle peut également être appliquée à l’élevage d’autres organismes marins. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison du grand nombre de détails importants pour le succès, tels que l’approvisionnement en eau de mer de bonne qualité, la production robuste d’aliments de haute qualité et une attention constante au nettoyage et à l’alimentation des cultures. Martin Ogemark et Anna-Lisa Wrange, techniciennes et chercheuses travaillant avec les balanes, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, installez des cadres pouvant contenir plusieurs panneaux thermoplastiques transparents. Percez deux trous dans les coins supérieurs de chaque panneau et utilisez des serre-câbles pour fixer les panneaux aux cadres. Pour ramasser les balanes adultes, déployez les panneaux verticalement à une profondeur d’un à trois mètres dans les eaux calmes.

Après avoir laissé les balanes s’installer et atteindre cinq millimètres de diamètre, apportez les panneaux dans le laboratoire. Placez ensuite les panneaux verticalement dans un support avec des rainures fraisées dans un plateau en polyéthylène. Tout d’abord, à l’aide de ruban adhésif non toxique et résistant à l’eau, collez cinq panneaux ensemble pour créer un cube ouvert en haut.

Placez le cube dans un petit plateau et remplissez-le d’eau de mer. Ensuite, ajoutez environ 200 cypridés en haut du cube. Tous les deux jours, nourrissez les balanes juvéniles avec 100 millilitres de Skeletonema marinoi.

Après deux à trois semaines, les panneaux du cube doivent contenir des juvéniles établis d’au moins cinq millimètres de diamètre. Démontez le cube et déplacez les panneaux dans des plateaux avec de l’eau de mer qui coule. Pour récolter les nauplies d’Artemia, éteignez d’abord la pompe d’aération et noircissez la bouteille, puis éclairez la partie inférieure de la bouteille pendant 10 minutes.

Les nauplii d’Artemia éclos nageront vers la lumière. Les kystes non éclos couleront au fond, tandis que les coquilles de kystes flotteront vers le haut. Ouvrez la pince au fond et collectez la fraction intermédiaire sous forme de population dense de nauplies d’Artemia nageurs.

Pour nettoyer les panneaux avec des balanes adultes, vaporisez-les doucement d’eau douce et enlevez tout salissure avec une brosse à dents souple. Nettoyez les plateaux sans balanes et les tubes avec de l’eau douce chaude. Ensuite, placez un tamis dans le plateau en polyéthylène avec un orifice de trop-plein.

Récupérez les larves de balanes qui se déposent dans le tamis pendant la nuit. Remplissez ensuite un seau avec 20 litres d’eau de mer filtrée et un litre d’un mélange de microalgues de diatomées pour créer une densité de 50 000 diatomées par millilitre. Transférez les nauplies de balanes précédemment collectées dans un plat de cristallisation et illuminez le plat par le côté.

Ensuite, à l’aide d’une pipette, récupérez les nauplii qui nagent vers la lumière et transférez-les dans un autre plat. Transférez les nauplii dans un bécher contenant un litre d’eau de mer filtrée pour le comptage. Ensuite, ajoutez un litre de nauplii dans le seau préalablement préparé.

Après trois jours, utilisez un tamis de 90 micromètres pour recueillir les nauplies de balanes, puis nettoyez le seau, remplissez-le d’eau de mer filtrée et ajoutez de nouvelles diatomées et les nauplies de balanes. Après deux à trois jours supplémentaires d’incubation, utilisez un tamis de 320 micromètres sur un tamis de 160 micromètres pour séparer les nauplies de balanes non muées des cyprides. Après avoir mis en place quatre bouteilles de quatre litres pour la culture de microalgues, placez les bouteilles à la lumière à une intensité de 50 à 100 micromoles par mètre carré.

Récoltez les cultures lorsqu’elles sont suffisamment denses pour être utilisées pour l’alimentation. Tout d’abord, sélectionnez des individus de grande taille et retenez la nourriture pendant deux jours avant la dissection. Ensuite, nettoyez la coquille de balane avec une brosse à dents et rincez-la à l’eau pour minimiser la contamination par d’autres espèces présentes dans l’environnement.

Placez une balane individuelle sur une surface plane pour la dissection, puis insérez la pointe d’une paire de pinces entre les plaques tergales et scutales. Saisissez une assiette et tirez-la doucement pour la retirer. Ensuite, utilisez des pinces pour saisir le cirri et tirez le bernacle tout droit.

Enfin, placez les balanes disséquées directement dans une solution d’éthanol ou d’ARN stabilisant à 96 % pour la fixation. Avec le protocole décrit ici, jusqu’à quatre lots de larves de nauplies nonnettes peuvent être produits en une semaine. Au maximum, chaque lot du système de culture se compose d’environ 12 000 nauplii, ce qui signifie que jusqu’à 50 000 nauplii peuvent être cultivés par semaine.

En l’espace d’une semaine, 70 à 90 % des nauplii collectés se transformeront en cypridés, ce qui donnera environ 30 000 cypridés par semaine. Une moyenne de 500 nanogrammes d’ARN de haute qualité a été obtenue à partir d’aussi peu que 20 cypridés individuels, quel que soit le stade de fixation. Chez les balanes, l’ARNr 28S se décompose lorsqu’il est chauffé.

L’homogénéisation par des billes de céramique confère à l’ARN la plus grande intégrité, ce qui en fait la méthode privilégiée pour manipuler les tissus de balanes et d’arthropodes. À l’aide de l’analyse qPCR, une augmentation de deux fois a été observée pour les variantes longues de l’ARNm NAK1 et une faible salinité par rapport aux variantes courtes de NAK. Cela indique que la forme longue est prédominante dans des conditions de faible salinité.

Quelques semaines de formation sont nécessaires pour maîtriser les différentes étapes de l’élevage des balanes. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est particulièrement important de minimiser la contamination à toutes les étapes du flux de travail de culture. Après son développement, cette technique d’élevage a joué un rôle déterminant dans notre compréhension de l’écologie, de la physiologie et de la biologie moléculaire des balanes.

C’est aussi une pierre angulaire importante pour faire du balane Balanus improvisus un puissant système de modèle marin.