Name: Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Découvrez une méthode computationnelle pour analyser la distribution des protéines membranaires en temps réel. Cette technique utilise le marquage FM 4-64 et la décomposition de signaux fluorescents sans microscope sophistiqué.

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Ce projet a été soutenu par NPU I, LO1417 (ministère de l’éducation, jeunesse et des Sports de la République tchèque).

1. préparation du matériel biologique
<ol><li>Préparer le matériel biologique exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt, mais aussi un marqueur cytoplasmique. Suivez les procédures mentionnées dans l’Introduction.</li>
</ol>2. confocal Laser Scanning Microscopy
<ol><li>Détachant le matériel préparé à l’article 1 avec FM 4-64 colorant7.<ol>
<li>Appliquer un protocole de coloration qui est approprié pour la matière étudiée. Pour les cellules de tabac BY-2, détachant 200 μl de suspension cellulaire avec 0,2 μL de 10 mM FM 4-64 solution dans le diméthylsulfoxyde. Remarque : La concentration de coloration typique de FM 4-64 colorant est environ 10 μM à l’aide de solution mère de 10 mM dans le diméthylsulfoxyde. Utiliser la concentration la plus faible possible de FM 4-64 pour une coloration appropriée et pas Incuber les cellules sur la glace (FM 4-64 et basse température peut influer sur les propriétés de la membrane plasmique). Poursuivez l’observation en microscopie confocale immédiatement. L’intervalle entre la coloration et l’acquisition de l’image ne doit pas contenir plu de 10 min ; dans le cas contraire, l’endocytose du colorant affectera la FM 4-64 coloration.</li>
		<li>Traiter des échantillons multiples consécutivement et tache pas tous les échantillons au début de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capturer un plan équatorial confocale par une seule cellule.<ol>
<li>Définissez un scanner séquentiellement de deux canaux pour le chromophore utilisé comme étiquette de protéine (doit être dans la première chaîne) et FM 4-64 (doit être dans la deuxième manche). Définissez une résolution optique supérieure (10 – 20 px/μm). Une configuration exemple : 63 X huile taille d’image immersion objectif, NA 1.3, 1 024 x 1 024 px. S’assurer que le plan de la membrane plasmique est perpendiculaire au plan confocal-section dans les images acquises.</li>
		<li>Capturer au moins 20 cellules par exemple d’avoir suffisamment de données pour l’évaluation statistique (dépend de la variabilité du signal dans la matière traitée).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. logiciel Installation
<ol><li>Installer les Fidji ImageJ distribution8et le périphérique de macro requis.<ol>
<li>Télécharger le logiciel depuis le site https://fiji.sc/#download et installez-les en décompactant.</li>
		<li>Commencer à Fidji en double-cliquant sur le fichier « ImageJ(.exe) » dans le répertoire « Fiji.app » décompressé.</li>
		<li>Télécharger une macro « périphérique » sur le site suivant : http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.IJM.</li>
		<li>Aux Fidji, sélectionnez Plugins | Les macros | Installer... dans le menu principal et spécifier le chemin vers le fichier téléchargé « Peripheral_.ijm. » Remarque : Deux nouveaux outils de la macro installée « périphérique » seront affiche dans la barre d’outils de Fidji : « Prenez le profil outil » et « Menu de protéines périphériques ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installer du logiciel R-project9les paquets nécessaires.<ol>
<li>Suivez les instructions sur le site https://cloud.r-project.org/ pour l’installation de R-project. Remarque : L’analyse globale se fera dans les îles Fidji. Le logiciel R s’appellera uniquement en interne par la macro Fidji « périphérique » au cours du calcul.</li>
		<li>Exécuter R GUI, sélectionnez Packages | Installez le paquet (s)... dans le menu principal, puis indiquez le référentiel le plus proche et le paquet « ggplot2 » pour l’installation. Remarque : Vous pouvez également tapez au R de ligne de commande : install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Télécharger un package R périphérique de la destination : http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Installez-les en sélectionnant paquets | Installer les packages de fichiers locaux.... Remarque : Tapez alternativement, à la ligne de commande R cette commande seulement : install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, type = "source").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. image Analysis in Fiji
<ol><li>Traiter les images confocales du marqueur cytoplasmique.<ol>
<li>Importez les images à Fidji, à l’aide de Plugins | Bio-Formats | Bio-Formats importateur dans le menu de Fidji avec les paramètres par défaut.</li>
		<li>Vérifier si l’importateur Bio-Formats reconnus correctement la calibration de l’image. La dimension de l’image affichée dans la fenêtre d’image champ supérieur gauche informations doit être égale aux dimensions photo originale.</li>
		<li>Traiter mal calibré images avec incorrect dimensions individuellement, par exemple, en définissant les paramètres corrects dans la fenêtre de dialogue Analyze | Définissez l’échelle... dans le menu de Fidji : remplir la largeur en pixels de l’image dans le champ de la Distance en pixels et la largeur réelle de l’unité de longueur appropriée dans le domaine de la distance connue ). Remarque : Si les fichiers Leica LCS LEI sont mal calibrés, suivez l’étape 4.2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez la macro options importation d’une configuration d’analyse. Activer la macro par l’une des trois manières différentes : sélectionnez Plugins | Les macros | Importer des options [f1] dans le menu principal de Fidji, sélectionnez le même point après avoir cliqué sur l’outil menu Périphériques protéine Menuou appuyez sur le clavier raccourci F1. Définissez le paramètre dans la fenêtre de dialogue macro appelée.<ol>
<li>Dans le cas du format Leica LCS LEI, résoudre calibrage incorrect en activant la case à cocher Leica.lei images . Cette option importe correctement les dimensions de l’image du fichier avec l’extension « lei ».</li>
		<li>Définissez la valeur appropriée dans le champ flou gaussien rayon (px). Ceci influence la réduction de bruit et de lissage photo. Une valeur faible (1 px) est suffisante et ne provoque pas de perte d’informations de toute image.</li>
		<li>Définir une valeur dans le champ largeur de ligne de profil (px). Une ligne plus épaisse provoque plus de lissage des courbes de profil. Une valeur par défaut 10 px est recommandé.</li>
		<li>Définir une image de titre l’analyse de la définition de « Échantillon délimiteurs » et « Les éléments exportés. » Remarque : Un titre de l’image (nom de fichier sans extension, par exemple: « Expérience-1_line-02_cell-11 ») sera réparti autour de tous les caractères répertoriés dans le champ « Délimiteurs de l’échantillon » (par exemple: «-_ ») en un ensemble d’éléments (« Expérience », « 1 », » la ligne », « 02 », « cell » et « 11 ») qui peut être utilisé comme facteurs de regroupement (identité de l’échantillon, cellule, ligne ou traitement) dans l’analyse qui suit. Définir les éléments qui serviront en tapant leur numéro de séquence (« 0 » pour le premier élément) dans classé « Exporté éléments. » Utilisez format délimitée par des espaces, par exemple, « 5 3 ». Dans cet exemple, rubriques « 02 » et « 11 » seront considérées comme regroupant les facteurs nommés « Fac_0 » et « Fac_1. » En outre, l’identité de chaque mesure désignera comme facteur « i ».</li>
		<li>Sinon, garder les délimiteurs échantillon vide et entrez 0 dans les éléments exportés , si le titre de l’image complète pourra être retenu.</li>
		<li>Sur le système d’exploitation Windows, vérifiez si le chemin d’accès au logiciel R sera correctement détecté automatiquement dans le champ chemin d’accès au R.exe. Dans le cas contraire, spécifiez le chemin complet vers le fichier R.exe dans le système (par exemple, « C:\Program Files\R\bin\R.exe »).</li>
		<li>Cliquez sur OK. Vérifier le titre l’analyse dans la fenêtre de dialogue suivante, cliquez sur OK ou retour pour remettre à zéro. Remarque : Toutes les images seront automatiquement lissées et finalement recalibrées. Une liste de facteurs de regroupement tout exporté s’affichera dans la fenêtre de résultats.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer une sélection linéaire dans l’ensemble de la région de la membrane plasmique dans les images traitées et mesurer les profils de fluorescence.<ol>
<li>Sélectionnez l’outil de Fidji ligne droite dans la barre d’outils de Fidji. Cliquez sur l’image et faites glisser une ligne dans l’ensemble de la région de la membrane plasmique. La ligne doit commencer dans l’espace extracellulaire et doit être perpendiculaire à la membrane plasmique. Choisir les régions avec une couche plus épaisse et plus homogène du cytoplasme cortical. La durée optimale de la sélection linéaire est de 5 à 10 μm.</li>
		<li>Exécuter la macro de profil de prendre par méthode analogique comme dans l’étape 4.2 (raccourci « x ») ou en cliquant sur prendre le profil outil dans la barre d’outils de Fidji. La mesure automatique de profils de fluorescence dans les deux voies sera effectuée et données seront affichera dans la fenêtre de résultats.</li>
		<li>Si à l’aide de la touche « x » est considéré comme peu conviviaux, ouvrez le fichier de source de macro Peripheral_.ijm dans l’éditeur de texte, remplacez le symbole « x » dans la ligne "macro « Profil de prendre [x] » {' avec un symbole plus favorable (qui n’est pas utilisé dans l’environnement de Fidji comme un raccourci clavier) et enregistrez le fichier. Réinstaller la macro (étape 3.1.4) et commencer l’analyse de l’importation de l’image.</li>
		<li>Selon la variabilité individuelle de signal, prendre des nombres représentatifs des profils pour chaque cellule.</li>
		<li>Enregistrer les données via fichier | Enregistrer sous.... Toujours utiliser l’extension « csv » ; Il est nécessaire pour le format de données approprié.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez la macro de données de profil de tracer (raccourci F5) pour la visualisation graphique des profils mesurés. Définissez le paramètre dans la fenêtre de dialogue macro appelée.<ol>
<li>Garder la case utilisation de filtrage pour entrer les données ? non sélectionnées.</li>
		<li>Spécifiez si la parcelle doit être créée de récentes données dans la fenêtre de résultat, d’un simple fichier CSV ou de tous les fichiers CSV dans un répertoire spécifié en cliquant sur le bouton radio approprié. Remarque : Si l’intrigue est créé à partir des résultats récents, données seront sauvegardées tout d’abord (boîte de dialogueEnregistrer sous... sera automatiquement activé).</li>
		<li>Spécifiez quels facteurs de regroupement sera utilisé pour le tracé en sélectionnant les cases appropriées. Sélectionner le facteur « i. » si tous les profils doivent être affichés dans des emplacements uniques. Garder les cases à cocher désélectionnées, si toutes les données doivent par tracées d’un seul. ATTENTION : Sélection d’un facteur de regroupement qui n’existe pas dans l’erreur de causes résultats transformés lors de la création de l’intrigue.</li>
		<li>Spécifiez le nom de fichier lorsque vous enregistrez une parcelle dans le champ préfixe de fichier de sortie et définir l' intrigue dimensions de l’image en fichiers terrain élevé et la largeur de la parcelle. Remarque : L’intrigue qui en résultent est enregistrée dans un répertoire de données source au format PNG.</li>
		<li>Sélectionnez le sortie Pdf ? case à cocher si un PDF supplémentaire de sortie peuvent être produites.</li>
		<li>Cliquez sur OK. Spécifiez le chemin d’accès pour enregistrer les résultats, ou éventuellement pour les données à importer dans la fenêtre de dialogue suivante. Confirmer l’analyse en cliquant sur OK dans la fenêtre de dialogue montrant le code R effectué. Remarque : L’intrigue s’ouvrira dans une nouvelle fenêtre de l’image et la sortie d’analyse R apparaît dans la fenêtre de texte.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez la macro configuration de filtrage de profil (raccourci F2) si certains profils tracés ont signaux excessifs dans l’espace extracellulaire (pour la protéine étiquetée) ou dans l’espace intracellulaire (pour le signal FM 4-64). Suivez en définissant les paramètres dans la fenêtre de dialogue macro appelée. Remarque : Filtrage permet l’élimination des mauvais profils selon le seuil d’intensité autorisée maximale au coordonnées x.<ol>
<li>Pour chaque canal, définissez le seuil d’intensité appropriées dans le fichier Supprimer les mesures avec un signal (intracellulaire) extracellulaire excessif. Spécifier la région où le seuil d’intensité sera appliqué dans le champ à abscisses inférieurs (supérieur).</li>
		<li>Exécutez la macro de données de profil de tracer (étape 4.4) à nouveau avec la case à cocher utilisation de filtrage pour entrer les données ? sélectionné ; veiller à ce que tous les profils aberrants ont été correctement supprimés. Dans le cas contraire, améliorer les paramètres de filtrage (étape 4.5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez la macro modèle Create (raccourci F3) pour créer un modèle de la membrane plasmique et la distribution de fluorescence cytoplasme basées sur les données d’étalonnage. Suivez en définissant les paramètres dans la fenêtre de dialogue macro appelée.<ol>
<li>Spécifier si les données d’entrée doivent être filtrée (étape 4.5) en sélectionnant le utilisation de filtrage pour entrer les données ? case à cocher.</li>
		<li>Préciser les données de la source analogique comme au point 4.4.2.</li>
		<li>Spécifiez un intervalle au cours de laquelle le modèle va être prédite par la définition de « démarrage, » « fin », et « pas » des valeurs en μm. Remarque : Toutes les mesures de profil doivent être plus longues que l’intervalle spécifié.</li>
		<li>Spécifier les maxima de longueurs d’onde de la fluorescence d’excitation et d’émission des chromophores utilisés, dans les champs appropriés. Définir les valeurs par défaut de GFP et FM combinaison 4-64. Remarque : « GFP » indique le chromophore utilisé pour la protéine de marquage (GFP, CFP, YFP, etc.), et « FM4 » indique le chromophore utilisé pour une coloration (typiquement FM 4-64) de la membrane plasmique.</li>
		<li>Spécifiez le champ préfixe de fichier de sortie . Le préfixe serviront pour l’enregistrement d’un modèle qui en résulte que le fichier RData dans un répertoire de données source.</li>
		<li>Activez la case à cocher modèle intrigue ? Si la sortie graphique est nécessaire. L’intrigue sera enregistré comme le PNG et le fichier PDF Si le sortie Pdf ? -case à cocher est activée.</li>
		<li>Cliquez sur OK. Spécifier l’entrée ou sortie des chemins d’accès dans la prochaine fenêtre de dialogue et confirmer l’analyse en cliquant sur OK dans la fenêtre de dialogue affiche le code R effectué. Remarque : L’intrigue de la modélisation cytoplasmique et la membrane composé de la fluorescence de la protéine associée à la périphérie seront affiche dans la nouvelle fenêtre d’image, et la sortie d’analyse R apparaît dans la fenêtre de texte.</li>
	</ol></li>
	<li>Traiter les images des cellules exprimant la protéine d’intérêt.<ol>
<li>Importer les images analogique comme au point 4.1.</li>
		<li>Mettre en place l’analyse analogique comme à l’étape 4.2. Le lissage et la largeur doit être identique.</li>
		<li>Mesurer les profils analogique comme au point 4.3.</li>
		<li>Vérifier l’exactitude des profils en traçant (étape 4.4) et définir le filtrage si vous le souhaitez (étape 4.5).</li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez la macro distribution Calculate (raccourci F4) pour le calcul d’une protéine cloisonnement entre la membrane plasmique et le cytoplasme. Suivre le réglage des paramètres dans la fenêtre de dialogue macro appelée.<ol>
<li>Analogique avec l’étape précédente (étape 4.4), spécifiez la source de données, le filtrage et le préfixe de nom de fichier.</li>
		<li>Spécifier si le modèle pour le calcul de répartition de protéine est chargées depuis le dernier calcul de modèle dans le cas récent de la macro « Périphérique » sur les Fidji (select case récents résultats) ou depuis le fichier RData ( activez la case à cocher « From file »).</li>
		<li>Garder la case à cocher Supprimer les résultats avec la variabilité résiduelle supérieure à activé si un filtrage de résultat est souhaité. Spécifiez le seuil de la variabilité résiduelle autorisée maximale qui peut être inexpliquée par la décomposition du signal de la mesure de profil individuel. Par exemple : une valeur de 0,200 indique que toutes les mesures avec une variabilité inexpliquée supérieure à 20 % de la variabilité totale de l’intensité de fluorescence dans le profil seront rejetées.</li>
		<li>Sélectionnez les facteurs de regroupement de l’échantillon, qui peut être utilisé pour la boîte à moustaches création (étape 4.4).</li>
		<li>Activez la case à cocher sortie Pdf ? pour l’enregistrement de la boîte à moustaches-que le fichier PDF.</li>
		<li>Cliquez sur OK, spécifier l’entrée ou sortie des chemins et confirmer l’analyse en cliquant sur OK dans la fenêtre de dialogue affiche le code R effectué. Remarque : La boîte-terrain de protéine associée à la périphérie de partitionnement entre la membrane plasmique et le cytoplasme s’affichera dans une nouvelle fenêtre de l’image, et la sortie d’analyse R apparaît dans la fenêtre de texte.</li>
		<li>Pour le traitement externe, enregistrer les résultats affichés dans la fenêtre de résultats via fichier | Enregistrer sous... dans le menu fenêtre.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode décrite ici génère une estimation plus précise de la membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées en périphérie par rapport aux autres approches basées sur la mesure des intensités de fluorescence5. L’amélioration majeure de cette méthode est qu’elle prend en compte la diffraction de la lumière et la superposition de la membrane plasmique et les signaux cytoplasmiques. Bien que ces résultats de la méthode sont en corrélation avec les résultats d’une méthode simple bas...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique sont les éléments clés des voies de signalisation cellulaire. Un des rôles fondamentaux est leur transitoires plasma membrane association et dissociation, qui est importante pour la transduction du signal entre la membrane plasmique et le cytoplasme. Protéines de la voie périphérique associée à la membrane plasmique peuvent être fixés sur la membrane plasmique par ancres lipidiques (N-myristoylation, S-acylation ou prénylation) ou par domaines de liaison des lipides (interaction avec les phosphates du phosphatidylinositol, l’acide phosphatidique, etc.).
Liaison la membrane plasmique, les propriétés de ces protéines peuvent être examinés en vivo, par exemple, lorsqu’une protéine fluorescent-étiquetée est modifiée par une mutagenèse dirigée des principaux acides aminés, ou lorsqu’elle est traitée avec divers inhibiteurs affectant signalisation de lipide. Les distributions des protéines de la membrane de plasma périphérique sont principalement évaluées qualitativement, surtout dans les cas, lorsque la redistribution de la protéine est évidente. La méthode présentée est optimale pour des situations lorsque la redistribution de la protéine n’est que partielle et évaluation quantitative est nécessaire. Une approche fréquemment utilisée de quelle association de la membrane plasmique est estimée à partir confocal laser scanning des images de microscopie comme un rapport entre les intensités de fluorescence à la membrane plasmique et le cytoplasme1,2, est simple, mais pas précis. Les intensités de fluorescence à la membrane plasmique reflètent une superposition du signal-membrane plasmique et le cytoplasme en raison de la caractéristique de la diffraction de la lumière pour la technique de microscopie de fluorescence particulière et les éléments d’optique utilisés3. Par conséquent, le signal cytoplasmique est également inclus dans la région de la membrane. Pour cette raison, patron de coloration FM 4-64 ne peut servir comme un masque pour une membrane signal sélection4. En outre, des mesures simples de signal de la membrane à la position définie par la FM 4-64 coloration maximale toujours systématiquement surestiment le signal réel-la membrane plasmique de protéine périphérique associée à la membrane plasmique en raison de la superposition de la membrane et composé cytoplasmique. Aussi, le maximum de signaux observés pour fluorescent-étiquetées de protéines associées à la périphérie ne pas localiser conjointement avec le maximum de la membrane plasmique marqueur (c.-à-d., FM 4-64 styryl colorant), mais est décalé vers le cytoplasme. Une autre limitation est basée sur le fait que la FM pic d’émission 4-64 est plus large en comparaison avec les pics d’émission pour des protéines fluorescentes vertes telles que GFP en raison de la longueur d’onde et de dépendance de la diffraction de la lumière3.
Dans la méthode décrite ici, le signal de la protéine étiqueté est équipé de deux fonctions empiriques décrivant une distribution hypothétique de la membrane plasmique et le cytoplasme signal, respectivement. Cette décomposition du signal est appliquée à des profils de fluorescence linéaire qui sont appliqués à la surface de la cellule perpendiculairement à la membrane plasmique dans les images sources, qui sont des sections confocale régulières, deux canaux d’expression de la protéine fluorescent-étiquetée cellules marquées avec colorant FM 4-64.
La première fonction utilisée pour le montage décrit une diffraction d’un signal de cytoplasme au bord de la cellule. Il est obtenu à partir des profils de fluorescence acquis précédemment qui ont été mesurées dans les cellules exprimant un marqueur de protéine cytoplasme marqué par le chromophore même comme la protéine de périphérique associée à la membrane plasmique d’intérêt. La deuxième fonction décrivant une diffraction d’un signal de la membrane plasmique est dérivée de la fluorescence de FM 4-64. Tout d’abord, ce signal est approximé par une fonction gaussienne qui est utilisée pour une modélisation approximative de diffraction de la lumière d’une source ponctuelle. Deuxièmement, ce modèle, valable pour l’émission de rouge FM 4-64, est mathématiquement transformé au formulaire correspondant à une longueur d’onde d’émission du chromophore utilisé pour le marquage des protéines associées à la périphérie d’intérêt à la membrane plasmique. Les deux fonctions sont normalisées par l’intensité maximale et la moyenne de 10 % des valeurs plus élevées pour le signal FM 4-64 et protéine cytoplasmique, respectivement. Par cette décomposition signal (non-linéaire méthode des moindres carrés ajustement), le ratio de la membrane plasmique et la fraction du cytoplasme de la protéine étudiée peuvent estimer facilement et avec précision. La dimension physique réelle du coefficient de répartition calculée est de l’ordre du micromètre, parce que la concentration du volume cytoplasmique est comparée à la concentration de surface sur la membrane plasmique. Elle définit la distance entre la membrane plasmique et le cytoplasme, au sein duquel la même quantité de protéines est localisée dans la zone adjacente de la membrane plasmique. Cette valeur est équivalente à la partition coefficient K2 introduit précédemment5. La méthode est très rapide, nécessitant des sections confocale seule acquises à l’aide de la routine confocale à balayage laser microscope, et il n’est pas mathématiquement exigeant. Le noyau d’analyse a été implémenté dans un ensemble de R portable et une macro ImageJ supplémentaire a été écrit pour fournir une interface graphique pour exécuter l’analyse de dialogues intuitives. Logiciel et une description plus détaillée de la méthode (publié précédemment6) peut être trouvé à http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Cette méthode convient pour tissus, des cellules isolées et des protoplastes dans la membrane plasmique des cellules individuelles se distingue nettement, exprimant une construction fluorescent-étiquetées d’interrogé protéine associée à la périphérie. Un chromophore compatible avec FM 4-64 la coloration doit être utilisé. FM 4-64 émet une fluorescence rouge ; par conséquent, la protéine étudiée peut être étiquetée par une protéine fluorescente avec bleue, verte ou jaune d’émission (p. ex., GFP, CFP, YFP). La transformation stable de matériel biologique est recommandée car elle permet des observations moins artificielles et plus reproductibles de la distribution des protéines. Il est nécessaire que la protéine étudiée a une distribution relativement homogène cytoplasmique. La localisation d’une protéine dans le réticulum endoplasmique ou d’un autre compartiment membranaire intracellulaire peut produire des résultats artificiels.
En outre, la même matière biologique exprimant un marqueur cytoplasmique doit être utilisée pour la comparaison. Cellules peuvent être transformés par une chomophore libre (le même que pour les protéines périphériques marquage, par exemple, GFP libre) ou étiqueté protéines d’intérêt avec la capacité de fixation de membrane aboli. Capacité de fixation de la membrane peut être supprimée, par exemple, de tailler avec précision le domaine de liaison à membrane ou par mutagénèse dirigée de résidus d’acides aminés essentiels (p. ex., sites pour la N-myristoylation, S-acylation, ou prénylation, etc.).
Pour la microscopie confocale à balayage, les cellules doivent être étiquetés par un marqueur de la membrane comme colorant FM 4-64. Si FM 4-64 la coloration n’est pas approprié pour le matériau étudié (en raison d’autofluorescence interférente, pénétration du colorant pauvres, etc.), la membrane plasmique peuvent être étiquetée, par exemple, par une protéine intégrale de membrane plasmique taggée à un chomophore approprié ( mCherry, DP, etc.). Il est essentiel que le marqueur a une localisation négligeable dans les compartiments de membrane intracellulaire (endomembranes).
Si vous travaillez avec les anticorps et fixe, fixable analogique FM 4-64FX ou membrane plasmique étiquetant par anticorps dirigé contre une cible appropriée peut être utilisé. Dans ce cas, il est essentiel d’évaluer les résultats avec beaucoup d’attention parce que les procédures de fixation peuvent conduire à une perte sélective des protéines à la fois le cytoplasme et la membrane plasmique.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Colorant pour membrane plasmique</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Dye solvent</td></tr><tr><td>Équipement ordinaire (lames microscopiques, pipettes, pointes, tubes)</td><td></td><td></td><td>Équipement pour l’étiquetage cellulaire et la microscopie</td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td></td><td>confocal à balayage laser</td></tr><tr><td>Ordinateur ordinaire</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de la membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Cette méthode fournit une approche rapide pour la détermination de la membrane plasmique partitionnement de toute protéine associée à la périphérie fluorescent-étiquetées en utilisant les profils d’intensité de fluorescence à travers la membrane de plasma. Profilés de fluorescence mesuré sont fixés par un modèle pour la membrane et le cytoplasme distribution de fluorescence le long d’une ligne appliquée perpendiculairement à la périphérie de la cellule. Ce modèle est construit à partir des valeurs d’intensité de fluorescence en exprimant un marqueur fluorescent-étiquetées de cytoplasme et avec FM 4-64-étiqueté la membrane plasmique des cellules de référence. La méthode peut être appliquée à différents types de cellules et des organismes ; Cependant, seulement les membranes plasmiques des cellules non-voisins peuvent être évaluées. Cette méthode rapide axée sur la microscopie est appropriée pour les expériences, où sont attendus des changements subtils et dynamiques des marqueurs associés à la membrane plasmique et il fallait être quantifiée, par exemple, dans l’analyse des versions mutantes de protéines, traitements de l’inhibiteur, et observations de la transduction du signal. La méthode est implémentée dans un ensemble de R multi-plateforme qui est couplé avec une macro ImageJ qui sert d’une interface conviviale.

DREPP10 est une protéine spécifiques aux plantes associées en périphérie-membrane plasmique qui est associée à la membrane plasmique via un N-myristoylation et une interaction électrostatique avec phosphatidylinositol phosphates11, 12. DREPP a été décrit comme un composant du mécanisme de signalisation calcique dans la cellule végétale et aussi interagit avec le cytosquelette13...

Nous présentons ici un protocole afin d’effectuer une analyse quantitative du niveau de l’association de la membrane plasmique fluorescent-étiquetées de protéine associée à la périphérie. La méthode est basée sur la décomposition computationnelle de membrane et composants cytoplasmiques du signal observé dans les cellules marquées avec la membrane plasmique marqueur fluorescent.

Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, notamment à démêler les voies de signalisation cellulaire. Le principal avantage de cette technique est donc qu’elle ne nécessite pas d’approches microscopiques sophistiquées. Il est également très rapide et donc utilisable pour l’observation en temps réel de la distribution des protéines dans les cellules.L’évaluation et la quantification de la partition membranaire des protéines associées à la périphérie sont compliquées en raison de la diffraction de la lumière qui provoque un mélange de la membrane plasmique et de la fluorescence cytoplasmique au microscope. Commencer cette procédure par la préparation du matériel biologique comme décrit dans le protocole textuel. Teindre le matériau préparé avec un colorant FM 4-64 en appliquant un protocole de coloration adapté au matériau étudié.Pour les cellules BY-2 de tabac, colorer 200 microlitres de suspension cellulaire avec 0,2 microlitre de solution FM 4-64 de 10 millimolaires dans du sulfoxyde de diméthyle. Pour capturer une section confocale équatoriale par cellule, réglez un balayage séquentiel à deux canaux pour le chromophore utilisé comme marqueur

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