Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

Nous présentons ici un protocole afin d’effectuer une analyse quantitative du niveau de l’association de la membrane plasmique fluorescent-étiquetées de protéine associée à la périphérie. La méthode est basée sur la décomposition computationnelle de membrane et composants cytoplasmiques du signal observé dans les cellules marquées avec la membrane plasmique marqueur fluorescent.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, notamment à démêler les voies de signalisation cellulaire. Le principal avantage de cette technique est donc qu’elle ne nécessite pas d’approches microscopiques sophistiquées. Il est également très rapide et donc utilisable pour l’observation en temps réel de la distribution des protéines dans les cellules.

L’évaluation et la quantification de la partition membranaire des protéines associées à la périphérie sont compliquées en raison de la diffraction de la lumière qui provoque un mélange de la membrane plasmique et de la fluorescence cytoplasmique au microscope. Commencer cette procédure par la préparation du matériel biologique comme décrit dans le protocole textuel. Teindre le matériau préparé avec un colorant FM 4-64 en appliquant un protocole de coloration adapté au matériau étudié.

Pour les cellules BY-2 de tabac, colorer 200 microlitres de suspension cellulaire avec 0,2 microlitre de solution FM 4-64 de 10 millimolaires dans du sulfoxyde de diméthyle. Pour capturer une section confocale équatoriale par cellule, réglez un balayage séquentiel à deux canaux pour le chromophore utilisé comme marqueur de protéine et pour FM 4-64. Réglez également une résolution optique plus élevée.

Un exemple de configuration est un objectif à immersion dans l’huile 63 fois avec une ouverture numérique de 1,3 et une taille d’image de 1 024 x 1 024 pixels. Installez Fiji ImageJ Distribution et le périphérique macro requis. Aux Fidji, sélectionnez plugins, puis macros, puis installez dans le menu principal et spécifiez le chemin d’accès au fichier téléchargé avec le périphérique de macro ImageJ.

Installez le logiciel R Project et les packages requis. Exécutez l’interface utilisateur graphique R, sélectionnez les paquets, puis installez les paquets dans le menu principal, et spécifiez le dépôt le plus proche ainsi que le paquet ggplot2 pour l’installation. Téléchargez le périphérique R Package.

Installez-les en sélectionnant les paquets, puis installez les paquets à partir des fichiers locaux. Traiter les images confocales du marqueur cytoplasmique. Pour ce faire, importez les images aux Fidji à l’aide de plugins puis de bioformats, puis d’importateur de bioformats depuis le menu Fidji avec les paramètres par défaut.

Exécutez la macro d’options d’importation pour une configuration d’analyse. Activez la macro en sélectionnant le même élément après avoir cliqué sur l’outil de menu menu protéines périphériques. Définissez la valeur appropriée dans le champ Pixel de rayon de flou gaussien.

Cela influence le lissage de l’image et la réduction du bruit. Une valeur faible est suffisante et n’entraîne aucune perte d’informations sur l’image. Définissez maintenant une valeur dans le pixel de largeur de ligne de profil de champ.

Une ligne plus épaisse entraîne un lissage plus élevé des courbes du profil. Une valeur par défaut de 10 pixels est recommandée. Définissez le titre d’une image, en analysant par la définition des délimiteurs d’échantillons et des éléments exportés.

Cliquez sur OK. Vérifiez l’analyse du titre dans la fenêtre de dialogue suivante et cliquez sur OK ou retour pour réinitialiser. Ensuite, effectuez une sélection linéaire dans la région de la membrane plasmique dans les images traitées et mesurez les profils de fluorescence. Pour ce faire, sélectionnez la ligne droite de l’outil Fidji dans la barre d’outils Fidji.

Cliquez sur l’image et faites glisser une ligne sur la région de la membrane plasmique. La ligne doit commencer dans l’espace extracellulaire et doit être perpendiculaire à la membrane plasmique. Choisissez des régions avec une couche plus épaisse et plus homogène de cytoplasme cortical.

La longueur optimale de la sélection linéaire est de cinq à 10 microns. Exécutez la macro de profil de prise en cliquant sur l’outil de profil de prise dans la barre d’outils Fidji. La mesure automatique des profils de fluorescence dans les deux canaux sera effectuée et les données seront affichées dans la fenêtre des résultats.

En fonction de la variabilité du signal individuel, prenez des numéros représentatifs des profils pour chaque cellule. Exécutez la macro de données de profil de tracé pour visualiser graphiquement les profils mesurés. Définissez le paramètre dans la boîte de dialogue de la macro appelée.

Ne cochez pas la case Utiliser le filtrage pour les données d’entrée. Indiquez si le tracé doit être créé à partir des données récentes de la fenêtre de résultats à partir d’un seul fichier CSV ou de tous les fichiers CSV d’un répertoire spécifié en cliquant sur la case d’option appropriée. Spécifiez les facteurs de regroupement à utiliser pour le traçage en cochant les cases appropriées.

Sélectionnez le facteur I si tous les profils doivent être affichés dans des graphiques uniques. Ne cochez pas les cases si toutes les données doivent être tracées dans un seul graphique. Cliquez sur OK. Spécifiez le chemin d’accès et le nom de fichier pour l’enregistrement des résultats ou pour l’importation éventuelle des données dans la fenêtre de dialogue suivante.

Confirmez l’analyse en cliquant sur OK dans les fenêtres de dialogue, qui affiche le code R effectué. Exécutez la macro de configuration du filtrage de profil si certains profils tracés ont des signaux excessifs dans l’espace extracellulaire ou intracellulaire. Poursuivez en définissant les paramètres dans la fenêtre de dialogue de la macro appelée.

Pour chaque canal, définissez le seuil d’intensité approprié dans le fichier, supprimez les mesures avec un signal extracellulaire ou intracellulaire excessif. Spécifiez la région dans laquelle le seuil d’intensité sera appliqué dans le champ aux coordonnées X inférieures ou supérieures à, puis cliquez sur OK. Exécutez à nouveau la macro de données de profil de tracé avec la case à cocher Utiliser le filtrage pour l’entrée de données sélectionnée. Ajoutez maintenant les données du fichier précédemment enregistré.

Assurez-vous que tous les profils aberrants ont été supprimés avec succès, sinon, améliorez les paramètres de filtrage. Exécutez la macro create model pour créer un modèle de la distribution de fluorescence de la membrane plasmique et du cytoplasme en fonction des données d’étalonnage. Après avoir défini les paramètres dans la boîte de dialogue de la macro appelée, comme indiqué dans le protocole de texte, cliquez sur OK. Spécifiez le chemin d’accès et le nom du fichier d’entrée dans les fenêtres de dialogue suivantes et confirmez l’analyse en cliquant sur OK dans la fenêtre de dialogue affichant le code R effectué.

Ensuite, traitez les images des cellules exprimant la protéine d’intérêt. Importez les images et configurez l’analyse comme précédemment. Le lissage et la largeur de trait doivent être identiques.

Procédez à la mesure des profilés. Vérifiez la précision des profils en traçant et définissez le filtrage si vous le souhaitez, comme décrit précédemment. Exécutez la macro de distribution calculate pour le calcul d’une répartition protéique entre la membrane plasmique et dans le cytoplasme.

Spécifiez les données d’entrée et les sources du modèle, puis définissez un filtrage des données. Maintenez la case à cocher activée pour supprimer les résultats dont la variabilité résiduelle est supérieure à celle d’un filtrage des résultats. Spécifiez le seuil de la variabilité résiduelle maximale autorisée qui peut être inexpliquée par la décomposition du signal de la mesure de profil individuelle.

Sélectionnez des facteurs de regroupement d’échantillons, qui peuvent être utilisés pour créer une boîte à moustaches. Cliquez sur OK, spécifiez les chemins d’entrée ou de sortie et confirmez l’analyse en cliquant sur OK dans la fenêtre de dialogue affichant le code R exécuté. Voici une image d’une cellule colorée FM 4-64 exprimant une protéine végétale, associée à la membrane plasmique via la N-myristoylation et l’interaction électrostatique avec les phosphoinositides.

Ces interactions ont été perturbées expérimentalement par la wortmannine. L’importance de la N-myristoylation a été testée par mutation de la glycine sur la position du deuxième acide aminé qui sert de site de N-myristoylation. L’effet d’une élimination des deux capacités de liaison de la membrane plasmique a été testé par troncature du domaine N-terminal de la protéine.

La boîte à moustaches résultante montre une diminution de l’affinité de la membrane plasmique après mutation du site de N-myristoylation et après un traitement médicamenteux. Leur effet mutuel est comparable à l’effet de suppression du domaine N-terminal. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer les principales étapes de l’analyse dans le bon ordre et de définir leurs paramètres.

Suite à cette analyse, une méthode statistique telle que l’ANOVA peut être effectuée pour l’évaluation statistique des données obtenues. Bien que cette méthode ait été développée pour les cellules en suspension végétale, elle peut également être appliquée à d’autres cellules ou tissus avec des membranes plasmiques lisses et clairement reconnaissables.