PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation
3 juillet 2018
Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diagnostic, telles que la question de savoir si les micro-ARN sont des biomarqueurs valides dans les maladies cardiovasculaires. Par rapport à la PCR quantitative en temps réel, la PCR numérique présente des qualités techniques supérieures pour quantifier les microARN dans la circulation. Comme l’échantillon est divisé en environ 20 000 gouttelettes, il n’est pas nécessaire de dupliquer les mesures et de quantifier l’utilisation d’une courbe standard.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la quantification des microARN chez les patients cardiovasculaires, elle peut également être appliquée à d’autres patients et maladies, car d’autres microARN se sont révélés prometteurs en tant que biomarqueurs de la progression du cancer, elle peut également être appliquée aux patients oncologiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les gouttelettes générées sont fragiles et doivent être manipulées avec soin. Après avoir isolé l’ARN à partir d’échantillons de sérum, poursuivez la transcription inverse pour obtenir un ADN complémentaire plus stable pour la dPCR.
Pour commencer, décongelez le kit de transcription inverse sur de la glace. Ensuite, faites tourner les enzymes et les amorces vers le bas. Ensuite, préparez le mixage principal comme décrit dans le protocole texte.
Combinez 10 microlitres du mélange principal avec cinq microlitres d’ARN extrait dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, centrifugez la plaque à 2 000 xg à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Procédez à la transcription inverse comme indiqué dans le protocole texte.
Tout d’abord, décongelez le mélange commercial dPCR, l’ADNc et les amorces PCR sur de la glace et centrifugez-les immédiatement avant utilisation. Préparez ensuite le mixage principal comme décrit dans le protocole texte. Ajoutez des volumes de 1,33 microlitre de produit de transcription inverse à des volumes de 18,67 microlitres de mélange maître et centrifugez brièvement.
À l’aide d’une pipette, transférez 20 microlitres de l’échantillon dans chaque puits de la rangée médiane d’une cassette à huit puits. Ensuite, pipetez 70 microlitres d’huile génératrice de gouttelettes dans les puits d’huile de la cassette. Ensuite, placez un joint sur le dessus de la cassette et placez-le dans le générateur de gouttelettes.
Fermez le générateur de gouttelettes et attendez que les trois voyants soient verts fixes. À l’aide d’une pipette, transférez soigneusement 40 microlitres de l’échantillon formé de gouttelettes dans des puits séparés d’une plaque de 96 puits. Scellez ensuite la plaque avec une feuille dPCR à 180 degrés Celsius pendant quatre secondes.
Placez la plaque PCR scellée dans le cycleur et suivez les instructions de cyclisme décrites dans le protocole textuel. Retirez la plaque du thermocycleur et transférez-la à la base d’un porte-plaque. Placez ensuite le haut du support de plaque sur la plaque PCR.
Enfin, lancez le logiciel dPCR commercial. Dans ce protocole, la PCR numérique a été utilisée pour quantifier les microARN dans le sérum de patients atteints de maladies cardiovasculaires. Des échantillons ont été prélevés chez 16 patients avant, huit heures après et 16 heures après l’intervention percutanée.
Les patients atteints d’infarctus du myocarde avec élévation du segment ST ont montré une augmentation significative des taux de miR-499 par rapport aux patients atteints d’une maladie coronarienne stable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure pour la formation de gouttelettes de 96 échantillons si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit de manipuler les gouttelettes avec soin.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer correctement la PCR numérique, en formant correctement les gouttelettes, en cyclant, en lisant et en analysant.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude présente un protocole d'extraction et de quantification des microARN circulants en tant que biomarqueurs potentiels des maladies cardiovasculaires. En utilisant la PCR numérique, la méthode vise à améliorer la précision de la mesure des microARN dans des échantillons de sérum provenant de patients atteints de troubles cardiovasculaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Maladie cardiovasculaire
- Biomaqueurs
- Analyse des microARN
Contexte
- Les microARN sont de petits ARN non codants impliqués dans la régulation des gènes.
- Ils se sont révélés comme des biomarqueurs potentiels pour diverses maladies, notamment les affections cardiovasculaires.
- La PCR numérique présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles pour la quantification des microARN.
- La compréhension des profils de microARN peut contribuer au diagnostic et à la prise en charge des maladies cardiovasculaires.
Objectif de l'étude
- Valider les microARN comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires.
- Démontrer l'efficacité de la PCR numérique pour quantifier les microARN circulants.
- Fournir un protocole fiable aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Extraction des ARNm à partir d'échantillons de sérum.
- Transcription inverse pour synthétiser l'ADN complémentaire.
- PCR numérique pour la quantification absolue des ARNm.
- Comparaison de la PCR numérique avec la PCR quantitative en temps réel.
Résultats principaux
- La PCR numérique a démontré une précision supérieure dans la quantification des miARN.
- La méthode permet l'analyse de milliers de gouttelettes sans nécessiter de courbes standards.
- L'application potentielle de la méthode s'étend au-delà des maladies cardiovasculaires à d'autres affections telles que le cancer.
- Des difficultés dans la manipulation des gouttelettes fragiles ont été signalées par les nouveaux utilisateurs de la technique.
Conclusions
- L'étude soutient l'utilisation des microARN circulants comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires.
- La PCR numérique est un outil prometteur pour la quantification précise des microARN.
- Des recherches supplémentaires pourraient élargir l'application de cette méthode à d'autres maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La quantification des microARN circulants par PCR numérique offre une approche reproductible et très sensible pour la validation de biomarqueurs en recherche sur les maladies cardiovasculaires. Cette méthode permet la validation de cibles et le développement de tests en autorisant une quantification absolue sans courbes standards, réduisant ainsi la variabilité dans les études multicentriques. La technique renforce la fiabilité prédictive en phase de découverte précoce en reliant l'expression des microARN à la pathologie, orientant les décisions de poursuite ou d'abandon lors de l'évaluation d'hypothèses thérapeutiques.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant des miARN spécifiques de la maladie, comme le miR-499 dans l'infarctus aigu du myocarde.
- Valeur opérationnelle : Fournit des nombres absolus de copies de miARN sans courbes standards, améliorant ainsi la reproductibilité entre les sites.
- Valeur prédictive : Facilite le triage orienté biomarqueurs des portefeuilles de projets en associant les niveaux de miARN à la pathologie cardiovasculaire.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des systèmes biologiques validés (ADNc à partir d'ARN sérique) pour des protocoles de criblage en aval.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats présentant une forte linéarité et une faible variabilité, adaptés à la standardisation des tests.
- Extensibilité : Permet le traitement de 96 échantillons en environ une heure une fois maîtrisé, prenant en charge le criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la quantification des ARNmi en phase de découverte à la validation préclinique par le biais de biomarqueurs sériques pertinents pour la maladie.
- Réduction des incertitudes mécanistiques : Diminue l'ambiguïté dans la validation des cibles en corrélant l'expression des ARNmi avec les lésions cardiovasculaires.
- Alignement sur les biomarqueurs : Soutient le développement de biomarqueurs translationnels en quantifiant les ARNmi présentant une forte spécificité tissulaire et pathologique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèse à l'identification de composés candidats, en fournissant des données quantitatives sur les miARN qui permettent d'évaluer la confiance dans la cible et la préparation des tests.
- Découverte biologique : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant la libération de microARN par les cellules cardiovasculaires dans la circulation.
- Dépistage : Génère des résultats standardisés prêts à l'analyse, avec une haute sensibilité pour l'évaluation de candidats biomarqueurs.
- Analytique : Permet une comparaison directe des niveaux de microARN entre différentes conditions grâce à une quantification absolue, sans courbes standards.
- Recherche translationnelle : Favorise la continuité des biomarqueurs en associant les profils de microARN circulants à la pathologie cardiovasculaire.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme de quantification réutilisable, applicable à diverses indications cardiovasculaires et oncologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validité des biomarqueurs grâce à une quantification des ARNmi à faible variabilité et à haute sensibilité.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et la standardisation par le fractionnement basé sur les gouttelettes, éliminant ainsi les mesures en double.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les relations entre biomarqueurs et cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une avancée ajustée au risque grâce à des données quantitatives sur les ARNmi associées à la pathologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en isolement de l'ARN, transcription inverse et manipulation de gouttelettes afin d'éviter la perte d'échantillons.
- Requiert du matériel de génération de gouttelettes, des thermocycleurs et un logiciel de dPCR pour une quantification précise.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de formation et d'étanchéification des gouttelettes afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'application à différents types d'échantillons autres que le sérum, tels que le plasma ou les lysats tissulaires.
- Comprend des limitations pratiques telles qu'une manipulation délicate des gouttelettes, ce qui peut affecter le débit pour les utilisateurs inexpérimentés.
