Name: PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Découvrez la PCR numérique pour quantifier les microARN circulants comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires. Cette méthode offre une précision supérieure sans courbe étalon pour le diagnostic.

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1. extraction de miRNA du Plasma/sérum
Remarque : Afin de quantifier adéquatement les miARN, l’isolement de microARN correcte du plasma/sérum est une étape cruciale. Un essentiel de garder à l’esprit, surtout parce qu’il existe des protocoles différents, est d’adhérer au même flux de travail lors du traitement des échantillons. Dans ce protocole, miRNA est extrait de 50 µL de sérum. Ne pas utiliser plus de 200 µL comme cette limite le processus d’extraction correcte.
<ol><li>Préparer le sérum ou décongeler les échantillons congelés.</li>
	<li>Ajouter 250 µL (5 volumes) de réactif de lyse commerciale à 50 µL de sérum. Soutenir la lyse au vortex. Placer le tube avec le lysat sur le banc à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Doper le lysat 3,5 µl de contrôle spike (1.6 x 107 copies/µL) et les mélanger au vortex.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de chloroforme (c'est-à-dire, une quantité égale à l’échantillon de sérum départ) pour la séparation de phase. Agiter vigoureusement le tube pour 15 s. Place le tube sur le banc à température ambiante pendant 2-3 min.</li>
	<li>Pour la séparation de phase, centrifuger le tube à 12 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes. Remarque : Les échantillons sont maintenant séparés en phase aqueuse supérieure contenant l’ARN, une interphase blanc et une phase organique inférieure, rose.</li>
	<li>Transférer la phase aqueuse supérieure (100 µL) contenant l’ARN dans un nouveau tube. Ne transférez pas n’importe quel matériel interphase blanc comme cela falsifie le nombre correct de RNA.</li>
	<li>Ajouter 150 µL (c'est-à-dire1,5 fois le volume de l’échantillon transféré) d’éthanol à 100 %. Les matériaux de la composition de leur pipetage de haut en bas. Ne pas centrifuger à eux et rapidement passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Distribuer 250 µL de l’échantillon sur une colonne commerciale dans un tube de prélèvement de 2 mL. Fermer le couvercle. Centrifuger la colonne > 8 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le cheminement.</li>
	<li>Ajouter 700 µL de numéro de tampon de lavage commercial 1 dans la colonne. Fermer le couvercle et centrifuger la colonne > 8 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le tampon de lavage des trains directs.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de numéro de tampon de lavage commercial 2 à la colonne. Fermer le couvercle et centrifuger la colonne > 8, 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le tampon de lavage des trains directs.</li>
	<li>Pipeter 500 µL d’éthanol à 80 % pour la colonne. Fermez le couvercle, centrifuger la colonne > 8, 000 x g à température ambiante pendant 2 min. jetez le tube de prélèvement avec le cheminement.</li>
	<li>Transférer la colonne vers un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Centrifuger la colonne à pleine vitesse avec un couvercle ouvert pour sécher la membrane. Jeter le tube de prélèvement avec le cheminement.</li>
	<li>Transférer la colonne de spin dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 mL. Éluer l’ARN en appliquer 30 µL d’eau exempte de RNase directement au centre de la membrane. Fermer le couvercle. Centrifuger la colonne à pleine vitesse pendant 1 min.</li>
	<li>Magasin l’ARN à-70 ° C. Remarque : Le stockage de l’ARN purifié dans l’eau sans RNase entre-70 ° C à-20 ° C ne garantit aucune dégradation de l’ARN pendant 1 an. Suite de protocole du fabricant, la quantité minimale d’eau exempte de RNase pour diluer l’ARN est de 10 µL. à l’aide de moins de 10 µL peut pas suffisamment hydrater la membrane et réduire le rendement total de RNA.</li>
</ol>2. Transcription inverse
Remarque : L’ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le protocole suivant de la transcription inverse (RT) 15 µL (volume de réaction totale).
<ol><li>Décongeler le kit RT sur la glace. Garder les enzymes dans le congélateur le plus longtemps possible d’empêcher leur dégradants et leur spin down avant utilisation. Décongeler les amorces RT sur la glace et leur spin down avant utilisation.</li>
	<li>Préparer le mélange maître tel que décrit dans le tableau 1.</li>
	<li>Mélanger 10 µL du mélange maître et 5 µL de l’ARN extrait par puits dans une plaque 96 puits.</li>
	<li>Centrifuger la plaque bien à 2 000 x g à 4 ° C pendant 2 min.</li>
	<li>Utiliser le protocole de cycle thermique décrit dans le tableau 2 pour la transcriptase inverse. Remarque : Comme décrit ci-dessous, cDNA peut-être directement être traité dans la machine de PCR numérique (voir Table des matières) ; Alternativement, il peut être conservé à-20 ° C.</li>
</ol>3. droplet Generation et PCR numérique
Remarque : Digital PCR a été réalisée en utilisant le protocole suivant de 40 µL.
<ol><li>Décongeler le mélange commercial dPCR, l’ADNc préparé et les amorces PCR sur la glace. Centrifuger à eux peu avant son utilisation.</li>
	<li>Préparer le mélange maître comme décrit dans tableau 3.
</li>
	<li>Ajouter 1,33 μL/puits du produit RT et il centrifuger brièvement.</li>
	<li>Pipeter 20 μl de l’échantillon dans chaque puits de la cassette de 8 puits (rangée du milieu). Remarque : Si la cassette de 8 puits n’est pas complètement remplie, remplir les puits restants avec contrôles sans modèle (NTCs) omettent d’ADNc (c'est-à-direle produit de RT fabriqué avec de l’eau au lieu de RNA extraction) ou dPCR tampon commercial. Le CNT est un contrôle de la contamination. Eau ne doit pas être utilisée dans les puits restants, car qui nuira à la qualité de la formation de gouttelettes.</li>
	<li>Pipetter 70 μL de l’huile goutte de génération des sondes dans les puits de pétrole (rangée du bas) de la cassette de 8 puits.</li>
	<li>Placer un joint d’étanchéité sur le dessus de la cassette de 8 puits et placez la cassette dans le générateur de gouttelettes. Fermer le générateur de gouttelettes. Attendez que les 3 voyants sont vert fixe. Remarque : Gouttelettes sont maintenant générés.</li>
	<li>Soigneusement et lentement transfert 40 μl de l’échantillon formé de gouttelettes (rangée du haut) dans les puits séparés d’une plaque de 96 puits en pipettant également.</li>
	<li>À l’issue de la formation de gouttelettes sur les échantillons, sceller la plaque PCR avec une feuille de dPCR perçable à 180 ° C pendant 4 s.</li>
	<li>Placer la PCR-plaque aluminium scellées dans le cycleur et il cycle tel que décrit dans le tableau 4, à une vitesse de montée de 2.5 ° C/s.</li>
</ol>4. gouttelette lecture et analyse
<ol><li>Transférez la plaque le thermocycleur jusqu'à la base du support de la plaque. Serrer la plaque PCR en plaçant le haut du support de plaque sur la plaque de la PCR.</li>
	<li>Démarrez le logiciel commercial dPCR.</li>
	<li>Entrez le nom de l’échantillon, le nom de l’expérience et la cible dans la configuration. Sélectionnez la quantification absolue.</li>
	<li>Commencer la gouttelette lecture en cliquant sur exécuter. Sélectionnez FAM/HEX ou FAM/VIC comme chimie détection lorsque vous travaillez avec des sondes d’hydrolyse. Remarque : Le logiciel commercial dPCR va alors auto-analyser les données.</li>
	<li>Vérifier les numéros de gouttelettes dans le tableau de résultats afin d’assurer une génération de gouttelettes correct.</li>
	<li>Sélectionnez tous les puits avec le même miRNA quantifié et cliquez sur ANALYZE. La tache 2D permet de marquer les gouttelettes positives et corriger manuellement les données d’analyse automatique (Figure 1).</li>
</ol>5. corriger les calculs sur l’échantillon
<ol><li>Normaliser l’échantillon en multipliant l’échantillon par le facteur de normalisation (NF). NF = médiane [c. elegans miR-39 mesures]tous les échantillons/ [c. elegans miR-39]échantillon donné
</li>
	<li>Calculer la concentration sérique de miRNA final, ajustement pour les facteurs de dilution (DF). [miRNA] finale = [miRNA]valeur brute x DF,RT , x DFdPCR x DFEx Où : [miRNA] valeur brute = la miRNA quantifié par dPCR commercial software ; DFRT = le facteur de dilution du modèle dans la transcription inverse ; DFdPCR = le facteur de dilution du modèle dans dPCR ; DFEx = le facteur de dilution dans l’extraction.</li>
</ol>6. synthèse d’oligonucléotide Dilution série
<ol><li>Dégelez lyophilisée oligonucléotide synthétique sur la glace. Brièvement, centrifuger il.</li>
	<li>Diluer l’oligonucléotide synthétique lyophilisé dans une eau exempte de nucléase à une concentration finale de 10 pmol / µL. brièvement centrifuger il.</li>
	<li>Le diluer dans de l’eau exempte de nucléase tel que décrit dans le tableau 5. Centrifuger la dilution brièvement entre chaque étape de dilution à 8 000 x g pendant 10 s.</li>
	<li>Poursuivez la transcriptase inverse, tel que décrit à l’étape 2 et analyser les échantillons avec PCR numérique tel que décrit dans les étapes 3 et 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
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<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
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<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
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<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

PCR numérique est une méthode relativement nouvelle butée de PCR qui permet la quantification absolue directe d’acides nucléiques dans un échantillon. La méthode possède des avantages particuliers, notamment une diminution de la variabilité, une reproductibilité quotidienne accrue et une sensibilité supérieure11,12. En outre, en raison de la répartition de l’échantillon dans environ 20 000 réactions simples et des analyses de point de terminaison, dPCR est plus r...

MiARN circulants ont été identifiés comme marqueurs prometteurs pour un certain nombre de maladies, y compris les maladies cardiovasculaires,1. Les miARN est petites, de molécules d’ARN simple brin non codant (environ 22 nucléotides de long) sont impliqués dans la post-transcriptionnelle via la modification de la traduction de l’ARN messager et l’expression de gène influençant2, et sont libérés dans la circulation dans les États physiologiques et pathologiques. L’expression quantitative des miARN spécifique peut être liée à la pathologie, et certains miARN montre tissu haut et spécificité de la maladie1. Dans les maladies cardiovasculaires, miARN est devenus candidats attrayants comme nouveaux biomarqueurs parce qu’ils sont remarquablement stables dans le sérum et peuvent facilement être quantifiées à l’aide de la PCR méthodologie3. La valeur potentielle des miARN comme biomarqueurs pour infarctus du myocarde a été évaluée dans des études de petites envergure, mais une validation dans des cohortes manque2. Par exemple, miR-499 se trouve fortement exprimée dans le muscle myocardique, et il s’est avéré être une augmentation significative chez un AMI4,5,6. En outre, il réglemente programmé la mort cellulaire (apoptose) et la différenciation des cardiomyocytes et participe ainsi à plusieurs mécanismes suivant un AMI7. Mis à part quelques petites études rapports une supériorité et une valeur incrémentielle des miARN pour le diagnostic de l’AMI, la supériorité ou l’égalité à haute sensibilité troponines cardiaques n'a pas encore été prouvée dans des études à grande échelle2,5 ,6,8. Plusieurs études prospectives dans des cohortes sont, par conséquent, nécessaires pour évaluer la valeur diagnostique potentielle des miARN. En outre, méthodes de quantification de miRNA doivent être optimisées et9des protocoles normalisés utilisant comparables. Essais normalisés peuvent réduire des résultats incohérents et peuvent aider les miARN pour devenir des biomarqueurs potentiels pour l’application clinique de routine, comme biomarqueurs doivent être quantifiés de manière reproductible pour assurer leur application clinique.
Récemment, dPCR a été présenté comme une analyse de point final. Il répartit l’échantillon dans environ 20 000 réactions individuelles10. Le système dPCR utilise ensuite une Poisson statistique analyse mathématique des signaux fluorescents (réactions positives et négatives), ce qui permet une quantification absolue sans une courbe standard10. Pour combiner dPCR avec sondes fluorescentes hydrolyse, la quantification absolue directe hautement spécifique des miARN est rendue possible. Réaction en chaîne de polymérase numérique a démontré que présentent des qualités techniques supérieures (y compris une variabilité réduite, une reproductibilité quotidienne accrue, un haut degré de linéarité et une sensibilité élevée) pour quantifier les niveaux de miRNA dans le circulation par rapport à quantitative en temps réel PCR10,11. Ces qualités techniques supérieures pourraient aider à atténuer les limites en vigueur sur l’utilisation des miARN circulant comme biomarqueurs et pourraient mener à l’établissement des miARN comme biomarqueurs dans grands multi-centres les essais cliniques cardiovasculaires et comme une méthode de diagnostic en en général. Dans une étude précédente, nous avons récemment appliqué dPCR pour la quantification absolue des miARN chez les patients avec une AMI en circulation et ont pu démontrer le potentiel de diagnostique supérieure par rapport à la quantification des miARN de qPCR12.
Dans cette publication, nous voulons démontrer que l’utilisation dPCR est une méthode précise et reproductible pour quantifier directement miARN cardiovasculaire en circulation. La quantification absolue de miRNA niveaux dans le sérum par PCR digital, montre potentielle pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons en détail comment effectuer efficacement PCR numérique et comment détecter le nombre de copies de miRNA absolue dans le sérum.

<table><tbody><tr><td><Extraction d’ARN>forte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNkit Sérum/Plasma facile (50)</td><td>Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit pour l’extraction de microARN. Le kit contient un tampon RWT commercial (appelé numéro un dans le manuscrit)&nbsp ; et RPE (appelé numéro deux dans le manuscrit).</td></tr><tr><td>miRNeasy Sérum/Plasma Spike-in-Control ; miARN Syn-cel-miR-39 ; 10pmol</td><td>Qiagen-Échantillon & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in pour la normalisation , Séquence : 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Reverse Transcription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Transcription Kit (1000 Reactions)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4366597</td><td>Kit pour la transcription inverse des microARN</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis</td><td>4440887</td><td>Dosages utilisés en transcription inverse</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis</td><td>4440887</td><td>Numéro de dosage 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis</td><td>4440887</td><td>Numéro de dosage 000200</td></tr><tr><td>Plaque PCR, 96 puits, segmenté, semi-jupe</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AB0900 Plaque</td> à <td>96 puits pour transcription inverse</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; seal Seals</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>MSB1001</td><td>Feuille pour assurer un stockage approprié</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal</td><td>Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1851196</td><td>Cycler utilisé pour la transcription inverse</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td> <td>CustomSéquence : 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix pour sondes (sans dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix utilisé dans la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td></td> <td>4440887Assays used in digital PCR (sonde d’hydrolyse fluorescente)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis</td><td>4440887</td><td>Numéro de dosage 001352, amorces commerciales</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis</td><td>4440887</td><td>Numéro de dosage 000200, amorces commerciales</td></tr><tr><td>DG8 Cartouches et joints</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>La cartouche 1864007</td><td>prend jusqu’à 8 échantillons pour la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>La cartouche DG8 Support</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863051</td><td>Contient des cartouches dans la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes pour sondes</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863005</td><td>Huile utilisée dans la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>ddPCR Plaques à 96 puits</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>12001925</td><td>Plaque à 96 puits pour ddPCR</td></tr><tr><td>Plaque Thermoscellable, feuille, perçable</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1814040</td><td>Feuille perçable, compatible avec le lecteur de gouttelettes</td></tr><tr><td>ddPCR Huile de lecteur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863004</td><td>Huile utilisée dans la lecture de gouttelettes</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863002</td><td>Générateur de gouttelettes, génère les gouttelettes à partir de l’émulsion d’échantillon/huile</td></tr><tr><td>PX1 PCR Scelleuse de plaques</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1814000</td><td>Scelle la plaque avant la PCR</td></tr><tr><td>C1000 Thermocycleur tactile</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1851196</td><td>Cycleur utilisé pour le lecteur de gouttelettes ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863003</td><td>Lecture des gouttelettes PCR positives et PCR négatives à l’aide d’un détecteur optique</td></tr><tr><td>Contrôle tampon ddPCR pour sondes</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis</td><td>1863052</td><td>Contrôle des blancs&nbsp ; et pour remplir les puits restants de cassettes à 8 puits</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>Programme de lecture de gouttelettes</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>Programme d’analyse statistique</td></tr></tbody></table>

pcr numérique pour quantifier les microarn dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulants sérum microARN (miARN) ont montré prometteur comme biomarqueurs pour les maladies cardiovasculaires et infarctus aigu du myocarde (IAM), étant libérée des cellules cardiovasculaires dans la circulation. MiARN circulants est très stables et peut être quantifiées. L’expression quantitative des miARN spécifiques peut être liée à la pathologie et certains miARN Voir la haute tissu et la spécificité de la maladie. Trouver de nouveaux biomarqueurs des maladies cardiovasculaires est d’importance pour la recherche médicale. Tout récemment, réaction en chaîne de polymérase numérique (dPCR) a été inventée. dPCR, combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse, permet une quantification absolue directe spécifique. dPCR présente des qualités techniques supérieures, y compris une faible variabilité, une linéarité élevée et une sensibilité élevée par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). DPCR est donc une méthode plus précise et reproductible pour quantifier directement les miARN, particulièrement pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons comment effectuer efficacement numérique PCR afin d’évaluer le nombre de copies absolue dans le sérum.

PCR numérique combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse permet aux chercheurs de quantifier directement les quantités absolues des miARN spécifique en copies/µL. Comme l’échantillon en dPCR est partitionnée en environ 20 000 réactions individuelles de PCR, dPCR ne nécessite pas de technique réplique10. Le système dPCR utilise une analyse statistique mathématique de Poisson des signaux fluorescents (différant entre les réactions positives et négatives) qui per...

Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diagnostic, telles que la question de savoir si les micro-ARN sont des biomarqueurs valides dans les maladies cardiovasculaires. Par rapport à la PCR quantitative en temps réel, la PCR numérique présente des qualités techniques supérieures pour quantifier les microARN dans la circulation. Comme l’échantillon est divisé en environ 20 000 gouttelettes, il n’est pas nécessaire de dupliquer les mesures et de quantifier l’utilisation d’une courbe standard.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la quantification des microARN chez les patients cardiovasculaires, elle peut également être appliquée à d’autres patients et maladies, car d’autres microARN se sont révélés prometteurs en tant que biomarqueurs de la progression du cancer, elle peut également être appliquée aux patients oncologiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les gouttelettes générées sont fragiles et doivent être manipulées avec soin. Après avoir isolé l’ARN à partir d’échantillons de sérum, poursuivez la transcription inverse pour obtenir un ADN complémentaire plus stable pour la dPCR.Pour

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Nous décrivons ici une inversion optimisé multiplexe transcriptase PCR quantitative (qRT-PCR) en combinaison avec le protocole d'une plateforme microfluidique comme un coût et le temps moyen efficace de dépistage à haut débit pour microARN (miARN) les niveaux d'expression, surtout quand on travaille avec des quantités limitées de l'échantillon.

Haute profilage de microARN Débit: Multiplex Optimisé qRT-PCR à l&#39;échelle nanolitres sur l&#39;IFC de Fluidigm ArrayTM dynamique

Biomarqueurs de mesure dans des échantillons biologiques complexes est de plus en plus guident prise de décision clinique. Nous décrivons une méthode très sensible pour mesurer simultanément la myosine cardiaque protéine de liaison-C, la créatine kinase MB et la troponine I cardiaque dans le sérum de sujets atteints d'infarctus du myocarde et de sujets témoins en bonne santé.

Une méthode de quantification sensible et spécifique pour la détermination de sérum myosine cardiaque Binding Protein-C par immuno-Electrochemiluminescence

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Une méthode sensible et précise de quantification des microARN acellulaires à l’aide d’une chimie à base de colorants et d’une technologie de PCR numérique en gouttelettes est décrite.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Les microARN jouent un rôle régulateur important et sont en train de devenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour diverses maladies humaines. Il a été montré que les miARN sont transportés dans des lipoprotéines à haute densité. Nous avons mis au point une méthode simplifiée pour isoler rapidement les HDL purifiée convenant pour l'analyse des miARN du plasma humain.

Méthode rapide et simplifié Haut Isolation Grâce-put de miARN de hautement purifiées High Density Lipoprotein

Ce rapport décrit un protocole de mesure des niveaux absolus de miRNA plasma, à l’aide de la transcription inverse en temps réel quantitative PCR avec ou sans pré amplification. Ce protocole permet de mieux comprendre la quantité de plasma miARN et permet une évaluation qualitative des données correspondantes de différentes études ou laboratoires.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.

Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

Cet article présente un protocole de détection de l’expression de microARN dans les reins d’un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse en temps réel. Ce protocole met l’accent sur un modèle murin d’insuffisance rénale ischémique et sur l’extraction minutieuse d’échantillons de microARN.

Méthode de détection quantitative de microARN dans le rein d’un modèle murin de lésion rénale ischémique

Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.

Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Le modèle de rat d'infarctus aigu du myocarde (IAM) est utile d'étudier la conséquence d'un MI sur la fonction physiopathologiques et physiologiques cardiaque.

Infarctus aigu du myocarde chez le rat

Découvrez la PCR numérique pour quantifier les microARN circulants comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires. Cette méthode offre une précision supérieure sans courbe étalon pour le diagnostic.

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

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