Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

Cette méthode peut répondre à des questions sur l’interaction hôte-pathogène et la découverte de médicaments, telles que l’importance de divers facteurs de virulence et la capacité des petites molécules à s’améliorer avec la genèse. Le principal avantage de cette technique est qu’elle se déroule sous forme liquide avec de petits volumes. Pour commencer, tout en travaillant à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité BSL 2, striez P. aeruginosa d’un bouillon congelé sur une plaque de gélose LB.

Incuber l’assiette à 37 degrés C pendant 16 à 24 heures, puis conserver l’assiette à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Deux jours avant de mettre en place les plaques de test, utilisez une seule colonie de la plaque pour inoculer trois à cinq millilitres de bouillon LB stérile. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures.

Après avoir préparé le milieu de destruction lente ou SK selon le protocole de texte, avec 350 millilitres de p. Aeruginosa de la culture LB fraîche de nuit, grainez chaque plaque SK de 10 centimètres. Utilisez un épandeur de bactéries stérile pour répartir uniformément les bactéries et laissez les plaques sécher dans l’enceinte de biosécurité.

Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour tester plusieurs souches bactériennes d’ARNi en parallèle dans un seul puits d’une plaque de puits profonds de 24 puits, inoculez une seule colonie de chaque clone de bactéries contenant de l’ARNi préalablement préparée dans quatre millilitres de LB supplémentés en carbéninicilline. Placez les plaques dans un incubateur à agitation optimisé pour les plaques multi-puits à 37 degrés Celsius et 950 tr/min pendant 16 heures, puis collectez les bactéries par centrifugation à 2 000 g pendant 5 minutes. Décantez le surnageant en renversant la plaque et en la secouant vigoureusement.

En utilisant 100 microlitres de S Basal, les bactéries ARNi sont remises en suspension. Pipeter les bactéries remises en suspension dans un nombre approprié de puits d’une plaque NGM multi-puits complétée par de l’IPTG et de la carbénicilline et laisser sécher la plaque. Après avoir préparé les vers L1 selon le protocole textuel, préparez des plaques pour des expériences de base en pipetant environ 5 000 vers par plaque de 10 centimètres, ensemencés avec de l’ARNi ou un superaliment OP50.

Pour préparer un criblage d’ARNi, pipetez environ 300 vers par puits dans une plaque de 24 puits ensemencée d’ARNi. Si la souche utilisée est stérile à la température, incubez les vers à 15 degrés Celsius pendant environ 16 heures, puis transférez-les à 25 degrés Celsius pendant 44 heures pour terminer le développement et prévenir l’embryogenèse. Pour effectuer un test de destruction liquide, utilisez un grattoir cellulaire pour retirer le P. aeruginosa d’une plaque SK et remettre les bactéries en suspension dans environ 5 millilitres de S. Basal.

À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la DO 600 de la suspension bactérienne. Préparez 24 millilitres de stock dilué de P. Aeruginosa dans S.Basal à une DO de 600 égale à 09, puis ajoutez 21 millilitres de milieu SK liquide et, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 45 microlitres de bactéries et de milieux dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. Lavez les vers de leur source dans un tube conique de 50 millilitres et laissez-les se déposer sous la force gravitationnelle.

Aspirez le surnageant à 5 millilitres, puis utilisez un total de 50 millilitres de S.Basal pour remettre les vers en suspension, et répétez le lavage deux fois de plus. À l’aide d’un trieur de vers, triez environ 22 vers dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, selon le protocole textuel, puis utilisez un film perméable aux gaz pour sceller la plaque et incubez-la à 25 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Au moment souhaité, utilisez un laveur de microplaques et S.Basal pour laver la plaque à 384 puits un total de 5 fois.

L’une des erreurs les plus faciles à commettre est d’aspirer la plaque de puits 384 avant que les vers ne se soient complètement installés. Il faut de la pratique pour voir avec précision si les vers se sont complètement installés. Après le lavage final, aspirez le surnageant jusqu’à 20 microlitres.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de colorant d’acide nucléique micromolaire de 98 micromolaires par puits, pour une concentration finale de 0,7 micromolaire. Incuber la plaque à température ambiante pendant 12 à 16 heures. Après la période d’incubation souhaitée, utilisez le laveur de microplaques pour laver les plaques au moins trois fois.

Pour l’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé pour imager à la fois la lumière transmise et la fluorescence. Ajouter un millilitre de S Basal par puits d’une plaque de 24 puits contenant 300 vers par puits. Agitez doucement les vers en secouant la plaque, puis transférez les vers dans une plaque vide et stérile de 24 puits profonds.

Laissez les vers s’installer gravitationnellement, environ cinq minutes. Aspirez le surnageant en laissant environ un millilitre par puits, puis ajoutez 7 millilitres de S Basal dans chaque puits. Répétez le lavage deux fois de plus, puis après le lavage final, aspirez tout sauf environ 400 microlitres de surnageant.

Après avoir pipeté les bactéries dans des plaques de 384 puits pour éviter la famine, à l’aide de la fonction de rééchantillonneur du trieur de vers, triez 22 vers dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. Enfin, après le tri, ajoutez de petites molécules ou d’autres matériaux spécifiques à l’expérience. Comme l’illustre ce graphique, lorsque les étapes décrites dans cette vidéo sont suivies, une mise à mort dépendante du temps de C. elegans ne sera observée qu’en présence de P. aeruginosa.

En revanche, en l’absence de suppléments nutritionnels bactériens clés, peu ou pas de destruction sera observée. Comme le montre ici, l’incubation en deux étapes de P. aeruginosa à 37 degrés Celsius puis à 25 degrés Celsius, qui est essentielle pour les essais conventionnels de destruction lente, et qui a été mise en œuvre à l’origine dans le traitement liquide, est superflue dans cet essai. Le protocole tolère une large gamme de concentrations bactériennes initiales, allant d’un DO 600 égal à 0025, et présente toujours une destruction dépendante du temps et de la concentration, bien que le moment change.

De plus, il suffit souvent d’obtenir des données statistiquement significatives suffisent à partir de quatre puits. Un exemple de l’utilité du traitement est montré ici lorsque le rapport signal/bruit est élevé, comme dans cet exemple, l’analyse est simple et la distinction entre les conditions positives et négatives est triviale. Dans ces cas, même les coups faibles peuvent être facilement identifiés.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 60 à 75 minutes de temps de manipulation par plaque de 384 puits, sans compter le tri. Lors de cette procédure, il est essentiel de ne pas oublier d’ajouter tous les composants à votre média, sinon la virulence sera compromise. Ce test simplifie l’application du criblage basé sur le phénotype de l’organisme entier à la découverte de médicaments dans la recherche hôte-pathogène.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des tests de pathogenèse de C elegans à base de liquide. Cette procédure peut être modifiée en la remplaçant par d’autres agents pathogènes, tels que E.Faecalis pour P.Aeruginiosa, facilitant ainsi la recherche de traitements pour d’autres infections bactériennes. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries infectieuses comme P.Aeruginosa ou E.Faecalis peut être dangereux.

Des précautions appropriées, telles qu’une formation appropriée, un bon équipement de protection individuelle et une technique appropriée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.