Name: Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez un protocole de criblage à haut contenu pour étudier les interactions hôte-pathogène avec C. elegans et P. aeruginosa. Cette méthode liquide à petits volumes facilite la découverte de médicaments.

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Cette étude a été financée par la prévention du Cancer et le Research Institute of Texas (CPRIT) prix RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 et par le National instituts de santé K22 AI110552 attribué à NVK. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Ce dosage (ou essais similaires où les autres pathogènes sont substituées pour P. aeruginosa ou E. faecalis) est utiles pour diverses fins, notamment la découverte de médicaments. Il est également utile pour traiter des questions biologiques fondamentales, telles que les facteurs de virulence, l’élucidation des voies de défense hôte et la détermination du mécanisme réglementaire impliqués dans l’interaction hôte-pathogène.
Bien que l’essai P. aeruginosa Killing liqui...

L’identification et le développement d’antibiotiques efficaces, à large spectre, maintenant il y a près d’un siècle a conduit à un moment décisif dans la santé publique où il y avait une croyance largement répandue qu’infectieuse maladie serait un fléau du passé. Quelques courtes décennies, cet optimisme commença à décliner, comme pathogène après que pathogène mis au point des mécanismes de résistance qui limite ces traitements une fois miraculeuses. Depuis un certain temps, la course aux armements entre les efforts de découverte de drogue et les agents pathogènes semblait équilibrée. Toutefois, la mauvaise utilisation des antimicrobiens a récemment abouti à l’émergence de souches résistantes aux médicaments-pan de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescenset P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa est un, gram négatif, multi-accueil agent pathogène opportuniste qui constitue une menace grave pour les patients atteints de brûlures graves, ceux qui sont immunodéprimés, ou souffrent de fibrose kystique. Il est également de plus en plus identifié comme un agent causal dans les infections nosocomiales graves, notamment en raison de son acquisition en cours de la résistance antimicrobienne. Pour commencer à faire face à cette menace, nous avons utilisé le bien documenté c. elegans-P. aeruginosa infection système5. Notre laboratoire a mis à profit ce système afin de développer une plate-forme de base liquide, haut débit, haute teneur de dépistage pour identifier de nouveaux composés qui limitent la capacité de l’agent pathogène de tuer l' hôte6. Curieusement, ces composés semblent appartenir au moins trois catégories général, y compris les antimicrobiens7 et virulence inhibiteurs8. Autres essais de découverte de drogue forte teneur chez c. elegans ont été rapportés pour Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, et Enterococcus faecalis, entre autres,9,10,11,12,13,14,15,16. Ces types d’analyses ont plusieurs avantages reconnus, comme limiter la fausses hits positifs qui peuvent être toxiques à la fois l’hôte et l’agent pathogène, la probabilité de biodisponibilité par rapport à un écran chimique et la capacité d’identifier les visites au-delà tout simplement limiter la croissance microbienne, comme anti-virulents, des molécules stimulants immunitaires ou des composés qui autrement faire pencher la balance de l’interaction hôte-pathogène, en faveur de l’ancien. En outre, les composés découverts dans ces écrans sont souvent efficaces chez les hôtes mammifères.
Il est à noter qu’il existe au moins deux autres essais17,18 réaliser des écrans de haut-débit chez c. elegans en liquide. Cependant, chacun de ces tests est une modification qui permet le dosage la colonisation de l’intestin prototypique, connu comme lent-assassinat, à effectuer dans un liquide, augmentant le débit et permettant aux composés à subir plus facilement. Attention la caractérisation a démontré avec certitude que les mécanismes de la virulence bactérienne sont différents entre ces tests et notre base liquide Ecran7. Étant donné que les deux types de virulence sont observés dans les systèmes mammaliens, il est important d’examiner quels déterminants de virulence est le plus pertinent pour les intérêts de l’expérimentateur avant la sélection du dosage.
Nous démontrons une version optimisée de la base liquide dosage c. elegans-P. aeruginosa . Nous rapportons également l’adaptation de notre méthode de dosage de base liquide pour accueillir la bactérie pathogène Gram positive Enterococcus faecalis. Comme P. aeruginosa, E. faecalis est plus en plus identifiée comme une menace de graves infections nosocomiales avec un armement croissant de la résistance aux antimicrobiens voies1. Bien que14il existe une méthode précédente pour le criblage à haut débit d’e. faecalis , requiere preinfection avec l’agent pathogène, ce qui complique la procédure et augmente la probabilité de contamination des équipements tels que le FlowSort COPAS. Notre protocole élimine le besoin de préalable à l’infection, améliorer le profil d’innocuité. Enfin, nous présentons un moyen par lequel ou l’autre de ces tests peuvent être combinés avec alimentation Arni, permettant à l’utilisateur de rechercher des facteurs de l’hôte qui jouent un rôle dans la mise en place de, ou résistance à l’infection.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Cytomètre/trieur de vers de grand nombre d’objets</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Distributeur de laveuse</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>Grenacheuse à plaques 384 puits</td><td> Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des nématodes (NGM)</td><td></td><td></td><td>Quantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 2,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon phospate et 973 mL de</td></tr><tr><td>plaques</td><td></td><td></td> <td>Slow Killing (SK) d’eau milli-QQuantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 ml de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon de phospate et 973 mL de</td></tr><tr>milieu <td></td><td></td> à<td>destruction lente (SK)</td> d’eau milli-Q <td>Quantité par litre : 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampon de phosphate et 973 mL d’eau milli-Q</td></tr><tr><td>Bouillon de lysogénie (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> <td>d’eau de JavelQuantité par 100 mL : 10 mL de solution de NaOH 5 M, 20 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 5 % et 70 mL d’eau stérile</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Quantité par litre : 5,85 grammes de NaCl, 6 grammes de KH2PO4, 1 gramme de K2HPO4, et 1 litre d’eau milli-Q</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr>Quantité de tampon <td></td><td></td> de <td>phospate</td><td>par litre : 132 mL de K2HPO4 (1M) et 868 mL de KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5 % Sodium Lumpite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>Solution NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Coloration d’acide nucléique orange</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td><fortes>souches bactériennes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi exprimant bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan et Strome, 1992, PMID : 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1 ::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID : 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Le nombre de nouveaux médicaments identifiés par traditionnel, en vitro écrans a diminué, réduisant le succès de cette approche dans la recherche de nouvelles armes lutter contre la pharmacorésistance multiple. Cela a conduit à la conclusion que les chercheurs ne sont pas seulement la nécessité de trouver de nouveaux médicaments, mais aussi besoin de développer de nouvelles façons de les trouver. Parmi les candidats prometteurs, les méthodes sont tout micro-organisme, in vivo , essais qu’affichages utilisation de haut-débit, phénotypiques et héberge qui vont de Caenorhabditis elegans à Danio rerio. Ces hôtes ont plusieurs avantages puissants, y compris des réductions spectaculaires de fausses positifs hits, comme les composés qui sont toxiques pour l’hôte et/ou biounavailable sont généralement supprimées dans l’écran initial, avant de suivre coûteux vers le haut.
Ici, nous montrons comment notre essai a été utilisée pour interroger la variation d’hôte dans bien documenté c. elegans— pathosystème liquide meurtre dePseudomonas aeruginosa . Nous démontrons également plusieurs extensions de cette technique bien travaillée dehors. Par exemple, nous sommes en mesure de réaliser des écrans génétiques haut-débit à l’aide d’Arni dans 24 ou 96 puits formats de plaque aux facteurs de l’hôte requête dans cette interaction hôte-pathogène. À l’aide de ce test, étude globale du génome entier peut être complété en seulement quelques mois, ce qui peuvent considérablement simplifier la tâche d’identifier des cibles thérapeutiques, potentiellement sans la nécessité d’approches de purification biochimiques laborieux.
Nous rapportons également une variante de notre méthode qui substitue la bactérie Gram-positive Enterococcus faecalis pour le pathogène Gram négatif de P. aeruginosa. Beaucoup comme c’est le cas pour P. aeruginosa, assassinat par E. faecalis est fonction du temps. Contrairement à la précédente c. elegans— essaisd’e. faecalis , notre essai pour E. faecalis ne nécessite pas de preinfection, améliorer son profil d’innocuité et réduisant les risques de contamination de manutention des liquides. L’essai est très robuste, montrant ~ 95 % taux de mortalité 96 h après l’infection.

Paramètres importants pour la performance du test
Une bonne compréhension de la biologie qui sous-tendent ce dosage est nécessaire pour le dépannage et l’optimisation de l’analyse. À cette fin, nous appelons d’abord plusieurs documents clés élucider les mécanismes de la pathogenèse de P. aeruginosa-mediated tuant liquide7,,20. Pourvu que les étapes décr...

Nous décrivons ici un protocole qui est un hôte adaptable, entier, outil de dépistage de la forte teneur qui peut être utilisé pour étudier les interactions hôte-pathogène et être utilisé pour la découverte de médicaments.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Cette méthode peut répondre à des questions sur l’interaction hôte-pathogène et la découverte de médicaments, telles que l’importance de divers facteurs de virulence et la capacité des petites molécules à s’améliorer avec la genèse. Le principal avantage de cette technique est qu’elle se déroule sous forme liquide avec de petits volumes. Pour commencer, tout en travaillant à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité BSL 2, striez P. aeruginosa d’un bouillon congelé sur une plaque de gélose LB.Incuber l’assiette à 37 degrés C pendant 16 à 24 heures, puis conserver l’assiette à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Deux jours avant de mettre en place les plaques de test, utilisez une seule colonie de la plaque pour inoculer trois à cinq millilitres de bouillon LB stérile. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures.Après avoir préparé le milieu de destruction lente ou SK selon le protocole de texte, avec 350 millilitres de p. Aeruginosa de la culture LB fraîche de nuit, grainez chaque plaque SK de 10 centimètres. Utilisez un épandeur de bactéries stérile pour répartir uniformément les bactéries et laissez les plaques sécher dans l’enceinte de biosécurité.Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour tester plusieurs souches bactériennes d’ARNi en parallèle dans un seul puits d’une plaque de puits profonds de 24 puits, inoculez une seule colonie de chaque clone de bactéries contenant de l’ARNi préalablement préparée dans quatre millilitres de LB supplémentés en carbéninicilline. Placez les plaques dans un incubateur à agitation optimisé pour les plaques multi-puits à 37 degrés Celsius et 950 tr/min pendant 16 heures, puis collectez les bactéries par centrifugation à 2 000 g pendant 5 minutes. Décantez le surnageant en renversant la plaque et en la secouant vigoureusement.En utilisant 100 microlitres de S Basal, les bactéries ARNi sont remises en suspension. Pipeter les bactéries remises en suspension dans un nombre approprié de puits d’une plaque NGM multi-puits complétée par de l’IPTG et de la carbénicilline et laisser sécher la plaque. Après avoir préparé les vers L1 selon le protocole textuel, préparez des plaques pour des expériences de base en pipetant environ 5 000 vers par plaque de 10 centimètres, ensemencés avec de l’ARNi ou un superaliment OP50.Pour préparer un criblage d’ARNi, pipetez environ 300 vers par puits dans une plaque de 24 puits ensemencée d’ARNi. Si la souche utilisée est stérile à la température, incubez les vers à 15 degrés Celsius pendant environ 16 heures, puis transférez-les à 25 degrés Celsius pendant 44 heures pour terminer le développement et prévenir l’embryogenèse. Pour effectuer un test de destruction liquide, utilisez un grattoir cellulaire pour retirer le P. aeruginosa d’une plaque SK et remettre les bactéries en suspension dans environ 5 millilitres de S. Basal.À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la DO 600 de la suspension bactérienne. Préparez 24 millilitres de stock dilué de P. Aeruginosa dans S.Basal à une DO de 600 égale à 09, puis ajoutez 21 millilitres de milieu SK liquide et, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 45 microlitres de bactéries et de milieux dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. Lavez les vers de leur source dans un tube conique de 50 millilitres et laissez-les se déposer sous la force gravitationnelle.Aspirez le surnageant à 5 millilitres, puis utilisez un total de 50 millilitres de S.Basal pour remettre les vers en suspension, et répétez le lavage deux fois de plus. À l’aide d’un trieur de vers, triez environ 22 vers dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, selon le protocole textuel, puis utilisez un film perméable aux gaz pour sceller la plaque et incubez-la à 25 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Au moment souhaité, utilisez un laveur de microplaques et S.Basal pour laver la plaque à 384 puits un total de 5 fois.L’une des erreurs les plus faciles à commettre est d’aspirer la plaque de puits 384 avant que les vers ne se soient complètement installés. Il faut de la pratique pour voir avec précision si les vers se sont complètement installés. Après le lavage final, aspirez le surnageant jusqu’à 20 microlitres.Ensuite, ajoutez 50 microlitres de colorant d’acide nucléique micromolaire de 98 micromolaires par puits, pour une concentration finale de 0,7 micromolaire. Incuber la plaque à température ambiante pendant 12 à 16 heures. Après la période d’incubation souhaitée, utilisez le laveur de microplaques pour laver les plaques au moins trois fois.Pour l’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé pour imager à la fois la lumière transmise et la fluorescence. Ajouter un millilitre de S Basal par puits d’une plaque de 24 puits contenant 300 vers par puits. Agitez doucement les vers en secouant la plaque, puis transférez les vers dans une plaque vide et stérile de 24 puits profonds.Laissez les vers s’installer gravitationnellement, environ cinq minutes. Aspirez le surnageant en laissant environ un millilitre par puits, puis ajoutez 7 millilitres de S Basal dans chaque puits. Répétez le lavage deux fois de plus, puis après le lavage final, aspirez tout sauf environ 400 microlitres de surnageant.Après avoir pipeté les bactéries dans des plaques de 384 puits pour éviter la famine, à l’aide de la fonction de rééchantillonneur du trieur de vers, triez 22 vers dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. Enfin, après le tri, ajoutez de petites molécules ou d’autres matériaux spécifiques à l’expérience. Comme l’illustre ce graphique, lorsque les étapes décrites dans cette vidéo sont suivies, une mise à mort dépendante du temps de C. elegans ne sera observée qu’en présence de P. aeruginosa.En revanche, en l’absence de suppléments nutritionnels bactériens clés, peu ou pas de destruction sera observée. Comme le montre ici, l’incubation en deux étapes de P. aeruginosa à 37 degrés Celsius puis à 25 degrés Celsius, qui est essentielle pour les essais conventionnels de destruction lente, et qui a été mise en œuvre à l’origine dans le traitement liquide, est superflue dans cet essai. Le protocole tolère une large gamme de concentrations bactériennes initiales, allant d’un DO 600 égal à 0025, et présente toujours une destruction dépendante du temps et de la concentration, bien que le moment change.De plus, il suffit souvent d’obtenir des données statistiquement significatives suffisent à partir de quatre puits. Un exemple de l’utilité du traitement est montré ici lorsque le rapport signal/bruit est élevé, comme dans cet exemple, l’analyse est simple et la distinction entre les conditions positives et négatives est triviale. Dans ces cas, même les coups faibles peuvent être facilement identifiés.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 60 à 75 minutes de temps de manipulation par plaque de 384 puits, sans compter le tri. Lors de cette procédure, il est essentiel de ne pas oublier d’ajouter tous les composants à votre média, sinon la virulence sera compromise. Ce test simplifie l’application du criblage basé sur le phénotype de l’organisme entier à la découverte de médicaments dans la recherche hôte-pathogène.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des tests de pathogenèse de C elegans à base de liquide. Cette procédure peut être modifiée en la remplaçant par d’autres agents pathogènes, tels que E.Faecalis pour P.Aeruginiosa, facilitant ainsi la recherche de traitements pour d’autres infections bactériennes. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries infectieuses comme P.Aeruginosa ou E.Faecalis peut être dangereux.Des précautions appropriées, telles qu’une formation appropriée, un bon équipement de protection individuelle et une technique appropriée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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