Isolement et Identification des cellules immunitaires extravasculaires du coeur

Ce protocole présente une méthode simple et efficace pour isoler, identifier et quantifier les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde de souris pendant l’état d’équilibre ou d’inflammation. Le protocole associe la digestion enzymatique et mécanique pour la génération d’une suspension de cellule unique qui peut être davantage analysée par cytométrie en flux.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la composition des sous-ensembles de cellules immunitaires dans le cœur pendant les états d’équilibre et de maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour l’immunophénotypage précis des populations de cellules immunitaires cardiaques, y compris des sous-ensembles très rares. Ce protocole est relativement simple.

Cependant, les injections dans la veine de la queue peuvent être difficiles, il est donc important de pratiquer cette technique jusqu’à ce que vous soyez à l’aise avant d’utiliser des animaux de laboratoire. Pour marquer les leucocytes circulants, chargez 200 microlitres d’anticorps anti-CD45 conjugués au fluorophore de souris fraîchement préparés dans du PBS dans une seringue à insuline de calibre 28,5, et préchauffez huit souris de 12 semaines sur une couverture d’eau circulante réglée à 35 à 41 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Lorsque la veine de la queue s’est dilatée, immobiliser le premier animal en position sternale dans un dispositif de contention approprié.

Si les veines de la queue ne sont pas suffisamment dilatées, trempez la queue dans de l’eau à 36 à 40 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Lorsque les veines de la queue sont prêtes, tamponnez la zone d’injection avec de la gaze imbibée d’éthanol à 70 % et immobilisez la base de la queue avec l’index et le majeur et la région médio-distale de la queue avec le pouce et l’annulaire. En tenant l’aiguille côté biseauté vers le haut et parallèlement à la veine, insérez l’aiguille dans une veine de la queue dilatée et injectez par voie intraveineuse tout le volume d’anticorps.

Laissez ensuite l’anticorps circuler pendant cinq minutes avant l’euthanasie sans cruauté. Pour récolter le cœur, vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % et soulevez la peau de l’abdomen pour ouvrir l’abdomen le long de la ligne médiane ventrale, des hanches jusqu’au sternum. Ouvrez le péritoine et déplacez le foie pour exposer le diaphragme.

Coupez le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane, en prenant soin de ne pas perforer les poumons et le cœur. Épluchez les côtes pour exposer le cœur avant d’inciser les oreillettes gauche et droite. En saisissant doucement la base du cœur à l’aide d’une pince, insérez une aiguille de calibre 21 attachée à une seringue de 60 millilitres dans le ventricule gauche près de l’apex et perfuser le cœur avec 15 à 20 millilitres de PBS froid.

Une bonne perfusion du cœur est essentielle pour éviter les contaminants intravasculaires. Par conséquent, veillez à disséquer et à perfuser le cœur rapidement après l’euthanasie pour éviter la contamination due au sang coagulé. Après avoir perfusé le ventricule droit comme nous venons de le démontrer, on doit observer des poumons blancs et un foie pâle.

En tenant la base du cœur avec la pince, tirez doucement le cœur vers le haut et coupez les principales artères et veines pulmonaires, l’aorte et le sac péricardique pour détacher le tissu cardiaque. En tenant doucement le cœur entre le pouce et l’index, nettoyez soigneusement le cœur avec une serviette en papier propre et non pelucheuse et utilisez la pince pour retirer les oreillettes et tout reste d’artères et de veines principales ou d’autres contaminants. Placez le cœur nettoyé dans un plat en plastique de cinq centimètres et ajoutez 50 microlitres de PBS froid.

À l’aide de ciseaux de dissection incurvés, hachez le cœur jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux visibles et que le tissu ait une consistance lisse et épaisse. À l’aide d’une pince incurvée, transférez le tissu dans des tubes de microcentrifugation de deux millilitres contenant 800 microlitres de DMEM froid. Complétez avec de la collagénase, de la DNase et de l’hyaluronidase et incubez pendant 45 à 60 minutes à 37 degrés Celsius et 50 tr/min.

À la fin du vortex de digestion, prélevez des échantillons pendant 20 secondes et placez-les immédiatement sur de la glace. L’échantillon doit toujours être conservé à quatre degrés Celsius, sauf indication contraire, car certains antigènes de surface peuvent être internalisés s’ils sont laissés à température ambiante. Ensuite, pré-humidifiez la passoire de cellules de 140 microlitres dans un tube conique de 50 millilitres par échantillon avec un millilitre de HBB froid.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, pipetez les échantillons jusqu’à ce que les suspensions tissulaires soient homogènes et n’obstruent pas la pointe de la pipette et ajoutez les échantillons homogénéisés dans les filtres. Lavez lentement les échantillons à travers les filtres avec 12 à 14 millilitres d’HBB froid par échantillon, et transférez les échantillons filtrés dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté sur de la glace. Une bonne digestion se manifeste par l’absence de restes cardiaques dans le filtre.

Prélever les échantillons par centrifugation et éliminer le surnageant. Ajouter un millilitre de tampon de lyse potassique de chlorure d’ammonium à chaque échantillon. Remettez les échantillons en suspension avec un bref vortex, suivi d’une incubation de cinq minutes à température ambiante.

Arrêtez ensuite l’hémolyse avec cinq à huit millilitres de HBSS froid. Prélever les échantillons par centrifugation et remettre les pastilles en suspension dans un millilitre de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS et transférer dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre pour une autre centrifugation. Pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, remettre les pastilles en suspension dans 50 microlitres d’anticorps anti-CD16/CD32 et un bloqueur de monocytes pour réduire la liaison des anticorps non spécifiques pour une incubation de 15 minutes à température ambiante.

Sans lavage, ajoutez 50 microlitres de mélange maître d’anticorps à chaque échantillon en mélangeant pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec 600 microlitres de tampon FACS par tube et remettre les granulés en suspension dans 300 microlitres de tampon FACS frais ou 1 % de paraformaldéhyde. Analysez ensuite les leucocytes cardiaques par cytométrie en flux selon les protocoles standard d’analyse de flux.

L’analyse de la suspension de cellules uniques cardiaques par cytométrie en flux nécessite un pré-gage avec CD45 pour différencier les cellules immunitaires des cellules non immunes du cœur, suivi d’un gating d’exclusion de cellules uniques et de petites tailles. Les macrophages, identifiés par leur expression de CD64, constituent la principale population de cellules immunitaires du cœur, représentant 60 à 70 % de l’ensemble des cellules immunitaires. Les cellules dendritiques cardiaques conventionnelles sont des cellules CD64-négatives qui expriment des niveaux élevés de CMH de classe II et CD11c.

Ces cellules peuvent être divisées en fonction de leur expression de CD103 ou de CD11b et représentent une sous-population cardiaque beaucoup plus petite que celle des macrophages. L’utilisation de la cytométrie en flux d’une suspension cellulaire unique de myocarde permet d’étudier de petites sous-populations de leucocytes dans le cœur. Par exemple, en utilisant l’analyse par cytométrie en flux pour comparer les cellules immunitaires du myocarde de type sauvage à celles des souris déficientes en Batf3, l’absence de cellules dendritiques CD103 positives peut être confirmée chez les animaux knock-out.

De plus, cette analyse a révélé l’absence d’altération significative de la composition d’autres populations cardiaques chez les animaux déficients en Batf3, démontrant le degré de sensibilité qui peut être atteint en utilisant cette méthode combinée de digestion enzymatique et mécanique pour obtenir une suspension unicellulaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de toujours prendre en compte la viabilité de votre isolat cellulaire. Par conséquent, nous vous recommandons d’optimiser le temps et la concentration enzymatique de la digestion en fonction de vos conditions expérimentales.

Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire, les tests fonctionnels et l’isolement des billes magnétiques, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les fonctions des cellules isolées.