Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment synthétiser des banques combinatoires contenant des unités peptidiques tertiaires ou PTA. Ceci est accompli en préparant d’abord un sous-monomère PTA à partir d’acides aminés naturels. La deuxième étape consiste à synthétiser une région de liaison peptidique sur un support solide.

Ensuite, une bibliothèque combinatoire contenant des sous-unités PTA et peptidiques est synthétisée. La dernière étape consiste à caractériser la bibliothèque synthétisée pour s’assurer de la qualité de la synthèse. En fin de compte, une banque combinatoire contenant des sous-unités PTA restreintes de confirmation est synthétisée et une telle banque peut être utilisée pour le criblage à haut débit afin de fournir des ligands protéiques et de conduire à la découverte de nouveaux médicaments.

La chimie qui fait l’objet de cet article a donc été développée dans le but d’essayer de trouver des molécules beaucoup plus rigides que certains des peptides et d’autres choses avec lesquelles nous avions travaillé auparavant. L’idée est que si l’on identifie des bibliothèques de molécules plus rigides, elles se lient à des cibles protéiques avec des affinités beaucoup plus élevées, et nous avons pensé que c’était très, très important pour essayer de développer des médicaments à l’avenir ou, ou même des molécules de sonde intéressantes. La démonstration visuelle de cette synthèse de sous-ordre PTA est vraiment critique car la synthèse est difficile à apprendre car la température et le contrôle du temps sont vraiment essentiels à une synthèse réussie.

Tout d’abord, ajoutez 8,9 grammes de dine et 11,9 grammes de bromure de potassium dans une fiole à fond rond à trois cols de 500 millilitres avec une barre d’agitation magnétique. Ajoutez ensuite 100 millilitres d’une solution de bromure d’hydrogène à 30 % préalablement préparée dans le ballon. Après avoir placé le ballon dans une température d’éthylène glycol de moins 10 degrés Celsius, faites buller de la glace carbonique dans un bain de glace carbonique à travers une longue aiguille à partir du fond du ballon pendant 10 minutes.

Agitez la solution avec la barre d’agitation magnétique à 300 tr/min. Ensuite, ajoutez une solution de nitrite de sodium préalablement préparée dans un entonnoir de goutte égalisant la pression fixé au flacon à trois cols à fond rond et scellez-le avec un septum. Ouvrez lentement la valve de l’entonnoir compte-gouttes, permettant à la solution de nitrite de sodium de s’égoutter dans le flacon.

Contrôlez la valve pour ajuster le taux d’égouttement à environ deux gouttes par seconde. Une fois l’ajout de nitrite de sodium terminé, continuez à remuer la solution pendant trois heures de plus, en laissant la température se réchauffer de moins 10 degrés Celsius à la température ambiante. Si la couleur de la solution est trop foncée, appliquez un vide pour éliminer l’excès d’oxydes d’azote et d’éventuel brome généré pendant la réaction.

Une fois la solution transférée dans un entonnoir d’extraction, extrayez le produit trois fois avec 35 millilitres d’éther dathylique. Après avoir combiné la phase organique et le lavage avec de la saumure saturée, recueillez-le dans un flacon et séchez-le sur du sulfate de sodium pendant six heures. Après la filtration du sulfate de sodium, évaporez le solvant sous vide pour obtenir une huile claire à jaune pâle.

Purifier le produit brut par chromatographie sur colonne de gel de silice avec trois à un acétate d’éthyle d’hexane pour le marquage isotopique, dissoudre 300 milligrammes de L-alanine avec 10 millilitres d’eau deutérée dans un tube en polyéthylène de 50 millilitres. Après avoir ajouté 10 milligrammes d’alpha cétoglutarate comme substrat cos, réchauffez le tube à 37 degrés Celsius. Lorsque vous avez terminé, ajustez le pH à 8,5 à 8,7 à l’aide d’une solution molaire d’oxyde de sodium et de bandelettes de test de pH.

Ensuite, ajoutez 0,1 milligramme d’alanine transaminase à la solution. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incubez pendant la nuit en secouant doucement à 10 à 30 tr/min. À ce stade, gonflez un gramme de 90 microns, 10 à des billes de gel avec un linker Ram dans 10 millilitres de diméthylformamide pendant trois heures dans un réacteur à seringue de 12 millilitres avec une légère agitation, vidangez le diméthylformamide du réacteur et ajoutez 10 millilitres de solution de diméthylformamide de périne à 20 % pour protéger le groupe FOC de la patinoire au milieu de l’intenseur.

Après avoir secoué les perles avec la solution de Pepperdine à 20 % pendant 30 minutes, lavez-les cinq fois avec de la viande de diméthyl forma pour retirer toute la Pepperdine. Ensuite, retirez quelques billes de la seringue et testez-les avec un test au chloral. Ajoutez deux millilitres d’une solution de diméthylformamide d’acide bromo-acétique à deux molaires aux billes et agitez doucement.

Ajoutez ensuite deux millilitres d’une solution de diméthylformamide de propylcarbo diamine à deux molaires aux billes. Après avoir scellé la seringue à l’aide d’un piston, secouez les perles sur un agitateur pendant 10 minutes. Une fois que les billes ont été soigneusement lavées avec du diméthylformamide, ajoutez-y deux millilitres d’une solution molaire de méthoxy-éthyl diméthylformamide préalablement préparée.

Après avoir secoué les billes et les avoir lavées cinq fois avec du diméthylformamide, vérifiez quelques-unes des billes avec un test au chloral. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution individuelle de dichloral méthane diméthylformamide à la seringue précédemment utilisée. Divisez uniformément toutes les billes d’un gramme en trois réacteurs à seringue de cinq millilitres à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres avec une pointe de pipette tronquée.

Après avoir lavé les trois seringues trois fois avec du chlorométhane, laver trois fois les seringues marquées r et s avec de l’hydrofumine anhydre et trois fois la seringue marquée B avec du diméthylformamide. Pour le couplage de la tristine avec l’acide NOIC bromo-propan, ajoutez environ 200 milligrammes de tristine dans un flacon dans une hotte. Une fois que le flacon a été bouché, pesez la quantité de tristine dans le flacon.

Ajoutez ensuite la quantité appropriée de tétra hydro ferran anhydre dans le flacon pour obtenir une solution de tri phosgène tétra ferran de 20 milligrammes par millilitre. Pour préparer le mélange d’acides bromo tri phosgène, ajoutez 89 microlitres de R deux Bromo propan acide NOIC et S deux Bromo propan NOIC acide D quatre dans deux petits flacons séparément à chaque flacon, ajoutez cinq millilitres de la solution de tristine tétra hydro furane. Après avoir scellé les flacons, placez-les dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Dans l’intervalle, ajouter 1 125 microlitres d’une solution de tétrahydro furane di isopropylamine à deux pour un dans les seringues r et s. Séparément, ajouter 356 microlitres de 2 4 6 triméthyl purine à chacun des flacons contenant les mélanges de bromo acides phosgéniques refroidis donnant des précipités blancs. Appliquez immédiatement la suspension correspondante directement sur les billes ifiées, puis placez-les sur un agitateur pour les agiter à moins de 120 tr/min pendant deux heures.

Pour le couplage de l’acide bromo-acétique avec le di-isopropylcarbo diamine, ajoutez cinq millilitres d’une solution de diméthylformamide d’acide bromo-acétique à deux molaires dans la seringue B.Après avoir agité, ajoutez cinq millilitres d’une solution de diméthylformamide di propyl carbo diamine diméthylformamide à deux molaires dans la même seringue et agitez doucement en suivant cette position seringue B sur le même agitateur que la seringue r et s. Ensuite, secouez les seringues pendant deux heures après les avoir soigneusement lavées avec du chlorométhane et du diméthylformamide. Regroupez toutes les billes des seringues R, S et B dans un réacteur à seringue de 12 millilitres.

Une fois que les billes ont été lavées cinq fois avec du diméthylformamide, ajoutez 10 millilitres d’une solution individuelle de diméthylformamide de chlorométhane diméthylformamide dans la seringue. Divisez uniformément toutes les billes en sept seringues individuelles de deux millilitres à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres avec une pointe de pipette tronquée pour l’émanation, ajoutez cinq millilitres de sept solutions de deux molaires amines préalablement préparées dans la seringue correspondante. Incuber les sept seringues dans un incubateur à 60 degrés Celsius et agiter pendant la nuit suivant l’incubation.

Lavez les perles qui doivent être clivées cinq fois avec du méthane de chloral. Après avoir secoué les billes pendant 15 minutes et les avoir lavées à nouveau avec du chlorométhane, égouttez le chlorométhane de la seringue. Transférez ensuite chaque perle individuelle dans une plaque à 96 puits.

À l’aide d’un microscope optique et d’une pipette à pointe tronquée, couvrez la plaque à 96 puits d’une lamelle et placez-la dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois la plaque sortie du congélateur, ajoutez 20 microlitres d’une solution de chlorométhane TFA DI refroidie préalablement préparée dans chacun des puits contenant une bille. Replacez la lamelle de recouvrement et placez la plaque murale 96 sur un shaker dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Après avoir secoué pendant 20 minutes, retirez la plaque murale 96 du congélateur et décollez la lamelle. Séchez le dichlorométhane de chaque puits en soufflant de l’air dessus. Lorsqu’il est clivé à température ambiante à l’aide d’une solution de méthane à 50 % de TFA DI CHLORO, une dégradation significative est observée.

Les pics 593 et 484 correspondent respectivement à l’agent de liaison et au trimère PTA, montrant que la molécule entière a été synthétisée avec succès sur la bille mais dégradée lors du clivage. Lorsqu’il est clivé dans des conditions de basse température comme décrit ci-dessus, la quantité de dégradation induite par le TFA est considérablement supprimée. Le mécanisme de clivage a été décrit dans la littérature antérieure et on pense qu’il passe par un intermédiaire d’OLEE. Les molécules PTA peuvent être séquencées par Ms.MS, et le modèle de fragmentation est similaire à celui des peptides et des peptides.

Les molécules de PTA synthétisées avec S deux acide bromo propôle D quatre donnent généralement des pics plus larges dans MS et MSM. En raison de la présence de produits de durée incomplets tels que S deux bromo propan, l’acide NOIC D trois, cela pourrait être utilisé comme une indication de la présence du centre chiral R pendant la procédure de séquençage, les molécules PTA ont également tendance à former plus d’adduit que le peptide peptide. Par conséquent, l’eau à faible teneur en sodium et les appareils en plastique sont préférés.

Un autre sous-produit potentiel est l’acrylamide formé à partir de l’élimination du brome lors de l’amination. Une fois que l’acrylamide est formé, la séquence est terminée. Cela peut être résolu en abaissant la concentration d’amines primaires à une molaire afin de réduire la solution.

Une fois maîtrisée, une bibliothèque de bonne taille peut être préparée en deux jours si elle est correctement exécutée. Maintenant que cette chimie a été entièrement développée et que la synthèse est assez efficace, j’espère que d’autres chercheurs adopteront cette technologie puissante pour fabriquer des mimétiques peptidiques conformationnellement contraints pour le développement de médicaments et le développement de sondes.