Split-et-piscine Synthèse et caractérisation de peptides tertiaire Amide Bibliothèque

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment synthétiser des bibliothèques combinatoires contenant des unités de peptide amide tertiaire ou unités PTA. Cela est réalisé en premier lieu en préparant un sous-monomère PTA à partir d'acides aminés naturels. La deuxième étape consiste à synthétiser une région d'ancrage peptidique sur un support solide.

Ensuite, une bibliothèque combinatoire contenant des sous-unités de PTA et de peptides est synthétisée. La dernière étape consiste à caractériser la bibliothèque synthétisée afin de garantir la qualité de la synthèse. En fin de compte, une bibliothèque combinatoire contenant des sous-unités de PTA à conformation restreinte est obtenue, et une telle bibliothèque peut être utilisée pour un criblage à haut débit afin d'obtenir des ligands protéiques et de favoriser la découverte de nouveaux médicaments.

Ainsi, la chimie qui est l'objet de cet article a été développée dans le but de trouver des molécules nettement plus rigides que certains peptides et autres composés avec lesquels nous avions travaillé auparavant. L'idée est que, si l'on identifie des bibliothèques de molécules plus rigides, celles-ci se lieront à des cibles protéiques avec des affinités beaucoup plus élevées, ce que nous avons jugé très, très important pour le développement futur de médicaments ou même de molécules sondes intéressantes. La démonstration visuelle de cette synthèse du sous-ordre PTA est essentielle, car la synthèse est difficile à apprendre, étant donné que le contrôle de la température et du moment est crucial pour une synthèse réussie.

Tout d'abord, ajoutez 8,9 grammes de dine et 11,9 grammes de bromure de potassium dans un ballon à fond rond de 500 millilitres à trois cols muni d'un barreau aimanté. Ensuite, ajoutez 100 millilitres d'une solution d'acide bromhydrique à 30 % préparée au préalable dans le ballon. Après avoir placé le ballon dans un bain de glycol éthylénique et de glace sèche à moins 10 degrés Celsius, faites barboter de l'argon à travers une longue aiguille depuis le fond du ballon pendant 10 minutes.

Agiter la solution à l’aide d’un barreau aimanté à 300 tr/min. Ensuite, ajouter une solution de nitrite de sodium préparée au préalable dans une ampoule de coulée munie d’un dispositif d’équilibrage de pression, fixée sur l’erlenmeyer à trois cols, et sceller avec un septum. Ouvrir lentement la vanne de l’ampoule de coulée, permettant à la solution de nitrite de sodium de goutter progressivement dans l’erlenmeyer.

Régler la vanne pour ajuster le débit de goutte à goutte à environ deux gouttes par seconde. Une fois l'ajout de nitrite de sodium terminé, continuer à agiter la solution pendant trois heures supplémentaires, en laissant la température passer de moins 10 degrés Celsius à la température ambiante. Si la couleur de la solution est trop foncée, appliquer un vide pour éliminer les excès d'oxydes d'azote et le brome éventuellement formé pendant la réaction.

Une fois la solution transférée dans une ampoule à décanter, extraire le produit trois fois avec 35 millilitres d'éther de pétrole. Après avoir réuni la phase organique et lavé avec de la saumure saturée, recueillir celle-ci dans un ballon et sécher sur sulfate de sodium pendant six heures. Après filtration du sulfate de sodium, évaporer le solvant sous vide pour obtenir une huile allant d'incolore à jaune pâle.

Purifiez le produit brut par chromatographie sur colonne de gel de silice avec un mélange de trois à un d'hexane et d'acétate d'éthyle. Pour le marquage isotopique, dissolvez 300 milligrammes de L-alanine avec 10 millilitres d'eau deutérée dans un tube en polyéthylène de 50 millilitres. Après avoir ajouté 10 milligrammes d'alpha-cétoglutarate comme cosubstrat, chauffez le tube à 37 degrés Celsius. Une fois terminé, ajustez le pH à 8,5-8,7 à l'aide d'une solution d'oxyde de sodium deutérié à 1 molaire et de bandelettes de test de pH.

Ensuite, ajoutez 0,1 milligramme d'alanine transaminase à la solution. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incubez toute la nuit avec un léger agitation à 10 à 30 tr/min. À ce stade, faites gonfler un gramme de billes de 90 microns, de 10 à gel, avec le lien Ram dans 10 millilitres de diméthylformeamide pendant trois heures dans un réacteur de seringue de 12 millilitres avec une agitation douce, éliminez le diméthylformeamide du réacteur et ajoutez 10 millilitres d'une solution de 20 %pi Périne en diméthylformeamide pour déprotéger le groupe FOC du lien amide de Rink.

Après avoir agité les billes avec la solution à 20 % de Pepperdine pendant 30 minutes, lavez-les cinq fois avec de la diméthylformamide pour éliminer tout le Pepperdine. Ensuite, retirez quelques billes de la seringue et testez-les avec un test au chlorure. Ajoutez deux millilitres d'une solution de bromoacide acétique à deux molaire dans du diméthylformamide aux billes et agitez doucement.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d'une solution de diop propyl carbo diamine diméthylformamide à deux molaire aux billes. Après avoir scellé la seringue avec un piston, agitez les billes sur un agitateur pendant 10 minutes. Une fois que les billes ont été soigneusement lavées avec du diméthylformamide, ajoutez-y deux millilitres d'une solution de méthoxy éthyl diméthylformamide à un molaire préparée précédemment.

Après avoir agité les billes et les avoir lavées cinq fois avec de la diméthylformamide, vérifiez quelques billes à l’aide d’un test au chloral. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution de dichlorométhane et de diméthylformamide en rapport un pour un à la seringue utilisée précédemment. Répartissez uniformément toutes les billes d’un gramme en trois réacteurs constitués de seringues de cinq millilitres à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres munie d’une pointe tronquée.

Après avoir rincé les trois seringues trois fois avec du chlorométhane, rincez les seringues marquées r et s trois fois avec du tétrahydrofuranne anhydre, et la seringue marquée B trois fois avec du diméthylformeamide. Pour le couplage de la bromopropanoïque, ajoutez environ 200 milligrammes de tristine dans un flacon sous hotte. Une fois le flacon bouché, pesez la quantité de tristine contenue dans le flacon.

Ensuite, ajouter la quantité appropriée de tétrahydroferrane anhydre dans le flacon afin d'obtenir une solution de trichlorure de carbonate dans le tétrahydroferrane à 20 milligrammes par millilitre. Pour préparer le mélange des acides bromés avec le trichlorure de carbonate, ajouter 89 microlitres d'acide R-2-bromopropanoïque et d'acide S-2-bromopropanoïque D4 dans deux petits flacons séparés ; puis ajouter à chaque flacon 5 millilitres de la solution de tristine dans le tétrahydrofurane. Après avoir scellé les flacons, les placer dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Entre-temps, ajoutez 1 125 microlitres d'une solution de tétrahydrofuranne et de diisopropylamine dans un rapport de deux pour un dans les seringues r et s. Séparément, ajoutez 356 microlitres de 2 4 6-triméthylpurine dans chacun des vials contenant les mélanges refroidis d'acides bromés et de phosgène, obtenant des précipités blancs. Appliquez immédiatement la suspension correspondante directement sur les billes activées, puis placez-les sur un agitateur pour agiter à 120 tr/min pendant deux heures.

Pour le couplage de l'acide bromoacétique avec la diisopropylcarbodiamine, ajouter cinq millilitres d'une solution de diméthylformamide à deux molaire d'acide bromoacétique dans la seringue B. Après agitation, ajouter cinq millilitres d'une solution de diméthylformamide à deux molaire de dipropylcarbodiamine dans la même seringue et agiter doucement. Ensuite, placer la seringue B sur le même agitateur que les seringues R et S. Agiter ensuite les seringues pendant deux heures, après avoir soigneusement lavé les seringues avec du dichlorométhane et du diméthylformamide. Rassembler toutes les billes provenant des seringues R, S et B dans un réacteur de seringue de 12 millilitres.

Une fois les billes lavées cinq fois avec du diméthylformamide, ajouter 10 millilitres d'une solution de dichlorométhane et de diméthylformamide en rapport un pour un à la seringue. Répartir toutes les billes uniformément dans sept seringues individuelles de deux millilitres à l'aide d'une pipette de 1000 microlitres munie d'une pointe tronquée pour l'écoulement, puis ajouter cinq millilitres des sept solutions d'amine deux molaire préparées précédemment dans la seringue correspondante. Incuber les sept seringues toute la nuit dans un incubateur à 60 degrés Celsius sous agitation. Après l'incubation.

Lavez les billes devant être clivées cinq fois avec du dichlorométhane. Après avoir agité les billes pendant 15 minutes et les avoir rincées à nouveau avec du dichlorométhane, éliminez le dichlorométhane à l’aide de la seringue. Ensuite, transférez chaque bille individuellement dans une plaque de 96 puits.

À l’aide d’un microscope optique et d’une pipette munie d’une pointe tronquée, couvrir la plaque de 96 puits avec un coverslip et la placer au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois la plaque retirée du congélateur, ajouter 20 microlitres d’une solution préparée au préalable et refroidie, composée à parts égales d’acide trifluoroacétique et de chlorométhane, dans chacun des puits contenant une bille. Remettre le coverslip en place et placer la plaque de 96 puits sur un agitateur, puis la remettre au congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Après agitation pendant 20 minutes, retirez la plaque à 96 puits du congélateur et enlevez le couvre-objet. Séchez chaque puits en soufflant de l'air pour éliminer le dichlorométhane. Lorsqu'elle est clivée à température ambiante à l'aide d'une solution de TFA 50 % dans le dichlorométhane, une dégradation importante est observée.

Les pics à 593 et 484 correspondent respectivement au linker et au trimère PTA, indiquant que la molécule entière a été correctement synthétisée sur la perle, mais s'est dégradée lors du clivage. Lorsque le clivage est effectué à basse température selon les conditions décrites ci-dessus, la dégradation induite par le TFA est fortement réduite. Le mécanisme de clivage a été décrit dans des publications antérieures et passerait par un intermédiaire oléfinique. Les molécules PTA peuvent être séquencées par MS/MS, et leur profil de fragmentation est similaire à celui des peptides.

Les molécules de PTA synthétisées avec l'acide S deux bromo propole D quatre donnent généralement des pics plus larges en spectrométrie de masse (MS) et en msm. Les spectres MS en raison de la présence de produits de durée incomplète, tels que l'acide S deux bromo propanoïque D trois, ce qui pourrait être utilisé comme indicateur de la présence du centre chiral R lors de la procédure de séquençage. Les molécules de PTA ont également tendance à former davantage d'adduits que les peptides. Par conséquent, l'utilisation d'eau faible en sodium et d'appareils en plastique est préférée.

Un autre sous-produit potentiel est l'acrylamide formé par l'élimination du brome lors de l'amination. Une fois l'acrylamide formé, la séquence est interrompue. Ce problème peut être résolu en abaissant la concentration en amine primaire à un molaire afin de réduire la solution.

Basicité Une fois qu'une bibliothèque de bonne taille est maîtrisée, elle peut être préparée en deux jours si la procédure est correctement réalisée. Maintenant que cette chimie est entièrement développée et que la synthèse est très efficace, j'espère que d'autres chercheurs adopteront cette technologie puissante pour fabriquer des analogues peptidiques à conformation contrainte, destinés au développement de médicaments et à la conception de sondes.