Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Cette méthode peut aider au début des modèles génétiquement modifiés de souris du cancer de la prostate et de l’investigation du mécanisme de cancer de la prostate par l’analyse in vivo et in vitro. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse complète du modèle de souris du cancer de la prostate, de la dissection tissulaire à l’isolement cellulaire et à la culture. Après avoir exposé le système urogène, ou UGS, saisir fermement la vessie urinaire avec des forceps contondants moyens, et soulever l’ensemble du système de l’abdomen de la souris.

Faites glisser une paire de ciseaux sous la vessie et la prostate jusqu’à la colonne vertébrale pour faire une incision à travers la moelle épinière, et couper à travers toutes les connexions restantes à la cavité abdominale pour permettre l’ablation de l’ensemble de l’UGS. Transférer l’UGS dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant de deux à six millilitres de PBS au microscope disséquant. Et utilisez une paire de forceps fins et ciseaux de microdissection pour effacer soigneusement toute la graisse des côtés dorsale et ventrale du système tissulaire sans snipping aucun tissu prostatique.

Lorsque toute la graisse a été enlevée, tirez la vessie avec les forceps et excisez la vessie à sa base. Placez le côté ventral de tissu restant vers le haut et maintenez un conduit se termine avec les forceps, suivez le navire à sa base avec des ciseaux et excisez le navire à sa base. Retirez le même vaisseau de l’autre côté et insérez les forceps entre les vésicules séminal et la prostate pour permettre le snipping de n’importe quel tissu conjonctif adjacent si nécessaire.

Puis tracez les vésicules séminal à leur base à l’urètre et retirez les vaisseaux sans les percer. Lorsque les deux vésicules ont été enlevées, placez le côté dorsale des tissus vers le haut afin que les lobes dorsal qui ressemblent aux ailes d’un papillon soient visibles. Tenir chaque lobe dorsal avec des forceps, couper le tissu à sa base avec des ciseaux pour recueillir les lobes dorsal et tourner le tissu vers le côté ventral.

Recueillir les lobes latéraux, qui sont petits et enveloppent habituellement l’urètre sur le côté et sont coincés entre les lobes antérieurs, ventrals et dorsales de la même manière. Recueillir les lobes ventral, qui sont plus grands que les lobes lauraux et se trouvent sur l’urètre ventrally. Ensuite, coupez et jetez l’urètre pour récolter les lobes antérieurs.

Pour traiter le tissu prostatique pour la culture 3D, transférez les lobes à un plat de 10 centimètres contenant deux à trois millilitres de DMEM, et utilisez un scalpel pour hacher les tubules de prostate aussi finement et uniformément que possible. Transférer les fragments de tissu dans une hotte stérile de culture tissulaire et ajouter la solution tissulaire à un nouveau tube de 15 millilitres. Porter le volume dans le tube jusqu’à neuf millilitres avec un milieu frais, et ajouter un millilitre de tenx collagenase solution de bouillon au mélange de tissus.

Après vortex, incuber le tube en secouant pendant deux heures à 37 degrés Celsius pour dégrader la matrice extracellulaire. À la fin de l’incubation, recueillir le tissu par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en deux millilitres de bandes chaudes de 05 % dans l’EDTA. Après cinq minutes de 37 degrés Celsius pour faciliter le cleaving des adhérences de cellule à cellule et de cellule à matrice, utilisez une tête de tuyau P1000 avec une pointe large de planche pour triturer le tissu huit à dix fois pour décomposer toutes les touffes.

Répétez la dissociation avec une pointe de tête de pipe P200. Ensuite, neutralisez la trypsine avec trois millilitres de milieu complet. Mélangez 500 unités d’ADNSE1 dans le lisier tissulaire et passez la solution cinq à dix fois à travers une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18, suivie de cinq fois à travers une aiguille de calibre 20.

Lorsqu’il n’y a plus de gros morceaux de tissu visibles, filtrez la suspension à travers un filtre de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres et recueillez les cellules par centrifugation. Pour le placage cellulaire et la culture, re-suspendre la pastille en 0,5 millilitres de milieu complet de croissance des cellules épithéliales de la prostate, et faire allusion aux cellules à cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de prostate épithéliale croissance moyenne de la concentration. Mélangez les cellules avec la matrice extracellulaire de membrane de sous-sol à un rapport de deux à trois volumes de solution, et plaquez la suspension cellulaire dans le récipient expérimental approprié de culture cellulaire.

Ensuite, placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes. Lorsque la matrice extracellulaire s’est solidifiée, couvrez la culture d’un milieu de croissance épithélial de la prostate complet préchauffé, en prenant soin de ne pas perturber le bouchon de matrice extracellulaire de la membrane du sous-sol. Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq à dix jours, rafraichissant la moitié du milieu tous les deux à trois jours.

Pour récolter les sphères, aspirez soigneusement le milieu sans perturber le bouchon de gel extracellulaire de membrane de sous-sol, et ajoutez un millilitre de solution disbase pour 100 microlitres de matrice extracellulaire de membrane de sous-sol. À l’aide d’un grattoir cellulaire, gratter le long du fond de la plaque pour soulever les gels extracellulaires de la membrane du sous-sol du fond de la plaque dans le supernatant, et pipe jusqu’à la solution entière une fois pour briser la fiche en petits morceaux. Incuber les morceaux de matrice extracellulaire dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une à deux heures jusqu’à ce que la matrice extracellulaire de membrane de sous-sol ait complètement dissous.

Transférer ensuite la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Et recueillir les cellules par centrifugation pour une manipulation plus en aval. La prostate de souris est composée de quatre paires de lobes situés dorsalement et ventrally aux vésicules séminal et à l’urètre.

Les lobes de prostate sont composés de profils multiples de glande, chacun composé d’un lumen, entouré par des cellules épithéliales sécrétrices. Les formes des lobes, l’organisation des cellules et la nature de la sécrétion varient d’un lobe à lobe. Les cellules de prostate isolées commencent à se développer en organoïdes dès quatre jours après la culture extracellulaire de matrice de membrane de sous-sol.

Au cours des six jours suivants, la plupart des cellules se développent en sphères solides avec une fraction des sphères présentant un lumen partiel ou complet. Les sphéroïdes démontrent également une forte coloration bêta de caténine aux jonctions de cellule à cellule qui co-localisent avec la coloration de F-actin. Tout en essayant cette procédure, il est très important de suivre méticuleusement les étapes de microdissection.

Par exemple, isoler les lobes de prostate alors qu’ils sont encore attachés à l’urètre, de sorte que vous savez quel lobe est qui est basé sur l’endroit où ils sont par rapport à l’urètre. Après la procédure de dissection, les lobes isolés peuvent être utilisés pour l’analyse en aval, comme le séquençage RMA, le ballonnement occidental ou l’immunostaining. La technique primaire de culture 3D vous permet d’obtenir d’autres informations sur le mécanisme du cancer de la prostate, parce que vous pouvez surveiller la vie avec des sphéroïdes pour la morphologie et les changements de comportement et d’identifier tous les changements néoplastiques dans le même.

En résumé, cette dissection de prostate et méthodes de culture peuvent incorporer à diverses applications en aval pour fournir l’information valable pour étudier le mécanisme du cancer de la prostate utilisant des modèles génétiquement modifiés de souris.