Name: Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'immunohistochimie par fluorescence proche infrarouge pour quantifier les protéines dans des régions cérébrales spécifiques chez le rat. Cette technique permet d'analyser les voies de signalisation moléculaire liées aux fonctions cognitives.

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La recherche dans ce rapport a été financée par une subvention cible de la NIGMS (1P20GM103653) attribuée à DK.

Le protocole suivant a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Delaware. Des rats mâles Sprague Dawley âgés de 55 à 75 jours environ ont été utilisés pour ce protocole.
1. extraction du cerveau et préparation tissulaire
<ol><li>Anesthésier le rat avec l’isoflurane dans la chambre d’induction d’anesthésie jusqu’à ce que le rat ne montre plus une réponse au pincement de pied.</li>
	<li>Sacrifiez les rats par décapitation rapide à l’aide d’une guillotine.</li>
	<li>Coupez la peau sur le crâne postérieur à antérieur et clair du haut du crâne.</li>
	<li>Utilisez pinces-gouges pour retirer délicatement la partie arrière du crâne, puis en utilisant de petits ciseaux de dissection coupés vers le bas de la ligne médiane du crâne, poussant vers le haut contre le dessus du crâne en tout temps pour éviter d’endommager le tissu cérébral.</li>
	<li>Utilisez pinces-gouges pour décoller à droite et à gauche de la moitié du crâne pour exposer le cerveau.</li>
	<li>Utilisez une petite spatule pour ramasser sous le cerveau et rompre les nerfs, élever soigneusement le cerveau et geler les cerveaux dans l’isopentane réfrigérée sur de la glace carbonique (au moins-20 ° c). Après cela, rangez les cerveaux dans un congélateur de-80 ° c jusqu’à ce que le tranchage.</li>
	<li>Couper les cerveaux dans les régions d’intérêt à 30 – 50 μM dans un cryostat maintenu entre-9 ° c et-12 ° c. Montez directement les tranches sur des lames de verre et rangez-les dans un congélateur de-80 ° c jusqu’au moment de l’immunocytochimie. Remarque: Dans ce protocole, les régions du cerveau d’intérêt étaient l’hippocampe et l’amygdala.</li>
</ol>2. réaction immunohistochimique unique
Remarque: Pour la double réaction immunohistochimique, le protocole est le même que la réaction immunohistochimique unique, sauf que cette réaction a deux anticorps primaires de différents hôtes (par exemple, le lapin et la souris) et deux anticorps secondaires pour les primaires doivent être d’un seul hôte (p. ex., antilapin de chèvre et antisouris de chèvre). Les anticorps secondaires doivent également être de deux spectres différents qui sont disponibles dans les scanners haute résolution. Par exemple, un anticorps secondaire avec un pic de spectre d’émission à 680 nm et un anticorps secondaire 800CW (pic de spectre d’émission à 780 nm).
<ol><li>Retirer les lames de verre du congélateur et laisser s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Sous une hotte, fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M pour 1 − 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les lames dans une solution saline tamponnée de 0,1 M (TBS) trois fois pendant 10 min chacune. Perméabilize membranes cellulaires en incubant les lames dans un détergent doux (p. ex., 0,01% de détergent) pendant 30 − 60 min.</li>
	<li>Rincer les lames au TBS trois fois pendant 15 min chacune.</li>
	<li>Diluer l’anticorps primaire pour la protéine d’intérêt dans le PBS dans la concentration correcte. Par exemple, pour détecter le gène précoce immédiat c-fos, préparez un anticorps anti-c-fos primaire de lapin dans une concentration de 1:500.</li>
	<li>Pipetter la solution d’anticorps primaire directement sur le tissu cérébral (environ 200 μL par glissière de 3 pouces x 1 pouce).</li>
	<li>Utiliser des lamelles pour Incuber le tissu cérébral sur des lames de verre dans la dilution primaire d’anticorps pour 1 − 2 h à la température ambiante ou pendant la nuit (~ 17 h) à 4 ° c.</li>
	<li>Enlevez les lamelles et les lames de lavage dans le SCT qui contient une petite quantité de détergent (p. ex., 0,01% de détergent, «TBS-T») quatre fois pendant 15 min chacune.</li>
	<li>Utiliser des lamelles pour Incuber les sections cérébrales dans un anticorps secondaire à température ambiante pendant 2 h. Remarque: L’anticorps secondaire doit être à la dilution correcte et dans un diluant contenant du SCT, du détergent et 1,5% du sérum hôte. Par exemple, un anticorps secondaire de chèvre dans une dilution de 1:2000 contiendrait 1,5% de sérum de chèvre et 0,05% de détergent.</li>
	<li>Rincez les lames en TBS-T quatre fois pendant 20 min chacune, puis dans TBS quatre fois pendant 20 min chacune.</li>
	<li>Lames sèches à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit. Lorsque les diapositives sont sèches, elles sont prêtes pour l’imagerie.</li>
</ol>3. l’imagerie
<ol><li>Placez les diapositives sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu orienté vers le bas. Soit image une diapositive de verre ou plusieurs diapositives à la fois à l’aide d’un outil de sélection.</li>
	<li>Diapositives d’image utilisant le réglage de la plus haute qualité avec un décalage de 0 nm et une résolution de 21 μm. La numérisation prendra généralement 13 − 19 h en fonction de l’équipement de numérisation utilisé.</li>
	<li>Importez des images dans le logiciel d’analyse d’image (par exemple, ImageStudio) pour afficher et marquer pour l’analyse des protéines semi-quantitatives.</li>
</ol>4. analyse de l’expression protéique
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse d’image et sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée.</li>
	<li>Ouvrez l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’image pour afficher l’analyse et ajustez les longueurs d’onde affichées, ainsi que le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans altérer l’image brute ou l’émission quantifiée totale.</li>
	<li>Identifiez les régions clés pour la quantification et sélectionnez l’onglet analyse en haut de la page, puis sélectionnez dessiner un rectangle (ou dessiner ellipse/dessiner à main levée) pour tracer un rectangle sur la zone qui sera quantifiée.</li>
	<li>Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez formes dans le coin inférieur gauche de l’écran, puis sélectionnez colonnes en bas à droite. Ajouter des colonnes Height et Width pour identifier la taille de la forme. Remarque: Il est important de contrôler la taille de la forme lors de la comparaison de la quantification. Il est recommandé d’utiliser des formes identiques placées dans l’emplacement de quantification désiré, afin d’obtenir un échantillonnage précis des émissions pour cette région.</li>
	<li>Nommez ensuite la forme et répétez. Une fois que toutes les régions sont échantillonnées, les données disponibles à partir de l’onglet colonnes peuvent être agrégées et analysées.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les résultats présentés dans cet article montrent que la quasi-infrarouge immunocytochimie en combinaison avec la numérisation à haute résolution peut être utilisé pour obtenir des mesures semi-quantitatives de l’expression des protéines dans le tissu cérébral. Il peut également être utilisé pour étiqueter deux protéines simultanément dans la même région du cerveau. Nous avons déjà utilisé l’immunohistochimie près de l’infrarouge pour mesurer l’expression précoce immédiate des gènes dans plusieurs régions cérébrales<sup ...

L’étude des neurosciences concerne une enquête sur la façon dont les cellules du cerveau médient les fonctions spécifiques1. Ceux-ci peuvent être cellulaires dans la nature comme la façon dont les cellules gliales confèrent l’immunité dans le système nerveux central ou peuvent impliquer des expériences qui visent à expliquer comment l’activité des neurones dans l’hippocampe dorsal conduit à la navigation spatiale. Dans un sens large, la fonction cellulaire est déterminée par les protéines qui sont exprimées dans une cellule et l’activité de ces protéines2. En conséquence, la mesure de l’expression et/ou de l’activité des protéines dans les cellules cérébrales est essentielle pour l’étude des neurosciences.
Un certain nombre de techniques sont disponibles pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau. Il s’agit notamment de méthodes in vivo telles que la topographie des émissions de positrons pour les densités des récepteurs3 et la micro-dialyse pour les petits peptides4. Plus communément, les méthodes ex vivo sont utilisées pour examiner la fonction et l’expression des protéines. Il s’agit notamment de techniques de spectrométrie de masse5, de Western Blot et d’immunosorbant enzymatique (ELISA)6, et d’immunocytochimie7. L’immunocytochimie est largement utilisée dans le domaine des neurosciences. Cette technique implique l’utilisation d’un anticorps primaire pour détecter une protéine (ou un antigène) d’intérêt (p. ex. c-fos) et un anticorps secondaire conjugué pour détecter le complexe d’anticorps protéine-primaire (figure 1). Pour permettre la détection du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine, les anticorps secondaires ont des agents oxydants tels que la peroxydase de raifort (HRP) conjugués à eux. Cela permet la formation de précipités dans les cellules qui peuvent être détectées à l’aide de la microscopie photonique7. Les anticorps secondaires peuvent également avoir des substances chimiques fluorescentes conjuguées à elles (c.-à-d. fluorophores). Lorsqu’ils sont stimulés, ces produits chimiques émettent de la lumière, qui peut être utilisé pour détecter les complexes d’anticorps secondaires de protéine-primaire7. Enfin, parfois, les anticorps primaires ont des agents réducteurs et des produits chimiques de fluorescence attachés directement à la nécessité d’anticorps secondaires7 (figure 1).
Fait intéressant, de nombreuses méthodes d’immunocytochimie permettent la visualisation des protéines dans les cellules du cerveau, mais pas la capacité de quantifier la quantité de protéines dans une cellule spécifique ou une région du cerveau. L’utilisation de la microscopie photonique pour détecter les précipités des réactions de réduction permet de visualiser les neurones et les gliales, mais cette méthode ne peut pas être utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans les cellules ou dans une région cérébrale spécifique. En théorie, la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour cela, parce que la lumière émise par l’anticorps secondaire fluorescent est une mesure du complexe anticorps-secondaire anticorps-primaire de protéine. Cependant, l’autofluorescence dans le tissu cérébral peut rendre difficile l’utilisation de la microscopie de fluorescence pour quantifier l’expression des protéines dans le tissu cérébral8. Par conséquent, la lumière émise par les images fluorescentes du tissu cérébral est rarement utilisée pour quantifier l’expression des protéines dans le cerveau.
Beaucoup de ces questions peuvent être abordées en utilisant l’immunocytochimie proche infrarouge en conjonction avec la numérisation à haute résolution9,10. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie couplée avec les fluorophores dans les spectres d’émission proche infrarouge peut être combinée avec une numérisation à haute résolution (par exemple, 10 – 21 μM) pour obtenir des images nettes qui permettent une quantification semi-quantitative des protéines dans des régions du cerveau.

<table><tbody><tr><td>Extraction</td><td></td><td></td><td></td>cérébrale</tr><tr><td>Chambre d’induction d’anesthésie</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>utilisé pour enlever l’arrière du crâne</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection délicats</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-951-5</td><td>utilisé pour couper vers le haut le long de la ligne médiane du crâne</td></tr><tr><td>Micro Spatule</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>utilisé pour évider le cerveau</td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Réaction</td><td></td><td></td><td></td> immunohistochimique</tr><tr><td>&nbsp ; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Utilisé comme détergent doux pour perméabiliser les cellules après fixation dans le paraformaldéhyde, également utilisé comme détergent doux en combinaison avec le sérum de l’hôte et l’anticorps secondaire.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Utilisé comme une petite quantité de détergent ajoutée à TBS&nbsp ; pour produire TBS-T après le recouvrement des lames avec l’anticorps primaire</td></tr><tr><td>Scanner Licor Odyssey</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

La neuroscience est l’étude de la façon dont les cellules du cerveau médient diverses fonctions. La mesure de l’expression des protéines dans les neurones et la Glia est essentielle pour l’étude des neurosciences car la fonction cellulaire est déterminée par la composition et l’activité des protéines cellulaires. Dans cet article, nous décrivons comment l’immunocytochimie peut être combinée avec l’analyse à haute résolution proche infrarouge pour fournir une mesure semi-quantitative de l’expression des protéines dans les régions cérébrales distinctes. Cette technique peut être utilisée pour une expression de protéine simple ou double dans la même région cérébrale. Les protéines de mesure de cette façon peuvent être utilisées pour obtenir un changement relatif dans l’expression des protéines avec une manipulation expérimentale, la signature moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire, l’activité dans les voies moléculaires, et l’activité neuronale dans plusieurs régions cérébrales. En utilisant les bonnes protéines et l’analyse statistique, la connectivité fonctionnelle entre les régions cérébrales peut également être déterminée. Étant donné la facilité de mise en œuvre de l’immunocytochimie dans un laboratoire, l’utilisation de l’immunocytochimie avec un balayage à haute résolution à infrarouge proche peut élargir la capacité du neuroscientifique à examiner les processus neurobiologiques au niveau des systèmes.

Avant d’utiliser l’analyse à haute résolution pour l’immunohistochimie, il faut vérifier que le protocole fonctionne. Cela peut être accompli à l’aide d’un test de validation où les sections cérébrales du même animal sont incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni des anticorps primaires ni secondaires. Les résultats d’un tel test de validation sont illustrés à la figure 2. Dans cette réaction, nous avons déte...

Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet la quantification de deux protéines dans la même région du cerveau. Cela permet à l’expérimentateur d’examiner l’activité dans les voies de signalisation moléculaire dans les régions du cerveau en testant les pans et les phosphoprotéines. Il peut également être utilisé pour apaiser les protéines qui sont des marqueurs de différents phénomènes cognitifs.Nous utilisons une technique relativement simple, comme l’immunohistochimie, pour répondre à des questions qui nécessitent généralement des techniques plus impliquées. Y compris l’examen de l’activité des voies de signalisation moléculaire, l’examen du rapport AMPA/NMDA. À l’aide d’un cryostat maintenu entre moins 9 degrés Celsius et moins 12 degrés Celsius, trancher le cerveau de rat précédemment isolé et congelé dans les régions d’intérêt à 30-50 micromètres.Monter directement les tranches sur des glissières en verre et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’immunocytochimie. Retirer les glissières de verre du congélateur et leur permettre d’équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes. En travaillant sous un capot de fumée, placez les glissières dans 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 molaire PBS pendant une à deux heures à température ambiante pour la fixation des tissus.Rincez ensuite les glissières dans 0,1 tos molaire trois fois pendant 10 minutes chacune. Pour perméabiliser les membranes cellulaires, incuber les glissières dans un détergent doux pendant 30-60 minutes. Et rincer à nouveau dans tbs trois fois pendant 15 minutes chacun.Diluer l’anticorps primaire pour la protéine d’intérêt dans PBS dans la concentration correcte telle que décrite dans le manuscrit. Pipette solution d’anticorps primaires directement sur le tissu cérébral. Placez des glissements de couverture sur les glissières et incubez le tissu cérébral dans la dilution primaire d’anticorps pendant 1-2 heures à température ambiante.Après l’incubation, retirer les feuillets de couvercle et laver les glissières dans le SCT qui a une petite quantité de détergent ajouté à elle, quatre fois pendant 15 minutes chacun. Diluer l’anticorps secondaire dans un diluant contenant du SCT, du détergent et 1,5 % du sérum hôte. Ajouter l’anticorps secondaire aux glissières, couvrir de glissements de couvercle et incuber à température ambiante pendant deux heures.Après l’incubation, rincer les glissières dans le TBS-T quatre fois pendant 20 minutes chacune, puis dans le SCT quatre fois pendant 20 minutes chacun. Séchez les glissières à température ambiante dans l’obscurité, pendant la nuit. Placez les diapositives sur l’interface de balayage proche infrarouge avec le tissu orienté vers le bas.Imagez plusieurs diapositives à la fois à l’aide de l’outil de sélection. Imagez les diapositives en utilisant le réglage de la plus haute qualité avec une résolution de 21 micromètres. Dans un décalage de zéro nanomètre, importer des images dans un logiciel d’analyse d’image pour afficher et marquer l’analyse des protéines semiquantitatives.Après l’ouverture du logiciel d’analyse d’image, sélectionnez la zone de travail dans laquelle l’image a été numérisée. Ouvrez ensuite l’image numérisée dans le logiciel d’analyse d’image pour afficher l’analyse et ajuster les longueurs d’onde, le contraste, la luminosité et le grossissement affichés sans altérer l’image brute ou l’émission quantifiée totale. Après avoir identifié les régions clés pour la quantification, sélectionnez l’onglet analyse le long du haut de la page, puis sélectionnez le rectangle de tirage pour dessiner un rectangle sur la zone qui sera quantifiée.Pour afficher la taille du rectangle, sélectionnez les formes le long du bas à gauche de l’écran. Sélectionnez ensuite les colonnes en bas à droite. Ajoutez ensuite des colonnes de hauteur et de largeur pour identifier la taille de la forme.Enfin, nommez la forme et répétez. Une fois que toutes les régions sont échantillonnées, procédez à la combinaison et à l’analyse des données disponibles à partir de l’onglet colonnes. Pour vérifier que ce protocole fonctionne, les sections cérébrales ont été incubées avec des anticorps primaires et secondaires, des anticorps secondaires seuls, ou ni anticorps primaires ni secondaires.L’expression précoce immédiate de c-jun de gène a été détectée dans l’hippocampe dorsal et l’amygdale seulement quand les anticorps primaires et secondaires ont été appliqués au tissu de cerveau. La sous-unité GluR1 du récepteur AMPA et la sous-unité NR2A du récepteur NMDA ont été analysées dans la détection des protéines des selles dans les noyaux d’amygdale. Cela a permis d’examiner le rapport des récepteurs AMPA NMDA dans les sous-noyaux de l’amygdale qui est une signature neurobiologique de l’apprentissage et de la mémoire.Des mesures moyennes et normalisées de l’expression des protéines ont été obtenues à partir de balayages à haute résolution dans l’hippocampe ventral. À l’aide du logiciel d’analyse d’image, un rectangle est placé dans la région d’intérêt et l’intensité moyenne de la lumière de la forme a été utilisée comme mesure de l’expression fluorophore, qui est une mesure de l’expression des protéines. Pour obtenir la courbe normalisée, une forme a été placée à travers une région qui exprime un signal élevé et un signal faible dans la zone sous la courbe a été utilisé comme mesure de l’expression des protéines.La plus grande lutte avec cette procédure est de trouver un anticorps et de s’assurer qu’il fonctionne. L’application est simple. Mon conseil serait d’abord de tenter une procédure immunohistochimique régulière, puis d’essayer cette technique.Toujours effectuer un test de validation d’abord. La chose la plus importante à retenir est de vérifier votre dilution des anticorps et assurez-vous qu’il est appliqué correctement. Sans ces étapes, la procédure échouera.

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Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

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Quantification de la distribution d’une protéine présynaptique dans le cerveau de la souris à l’aide de l’immunofluorescence

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

Source : Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et du balayage haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2019) Cette vidéo présente une méthode de balayage par fluorescence proche infrarouge et haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs.

Mesure de l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs à l’aide de la fluorescence dans le proche infrarouge et du balayage à haute résolution 

Source : Lacin, E., et al. Construction de neurotransmetteurs fluorescents à base de cellules (CNiFERs) pour la détection optique de neurotransmetteurs in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique d’imagerie de la libération de neurotransmetteurs in vivo à l’aide de neurotransmetteurs à base de cellules CNiFERs, des cellules rapporteures spécialisées pré-injectées dans le cortex de la souris. Positionnée sous un microscope à deux photons, la souris permet de visualiser la...

Imagerie de la libération de neurotransmetteurs à l’aide de rapporteurs fluorescents de neurotransmetteurs à base de cellules

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la technique de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier des types spécifiques de cellules neurales en vue d’une analyse ultérieure de l’expression génique spécifique au type de cellule, des marqueurs épigénétiques et/ou de l’expression des protéines.

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour obtenir des résultats localisation subcellulaire de protéine sur la rétine de poisson-zèbre en corrélant la microscopie photonique Super-résolution et images de microscopie électronique à balayage.

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Découvrez une méthode d'immunohistochimie par fluorescence proche infrarouge pour quantifier les protéines dans des régions cérébrales spécifiques chez le rat. Cette technique permet d'analyser les voies de signalisation moléculaire liées aux fonctions cognitives.

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

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