Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution In Situ Hybridation

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter des ARNm accidentellement localisés dans des échantillons de cerveau adulte. Ceci est réalisé par le prétraitement. Les échantillons par ébullition et digestion de la protéase pour démasquer les molécules d’ARNm dans un second temps, une hybridation est effectuée, suivie d’étapes d’amplification et de détection, qui permettent de visualiser l’ARNm d’intérêt.

Ensuite, les axones sont colorés avec des anticorps ou des colorants afin de vérifier que l’ARNm d’intérêt est localisé aux axones. Les résultats montrent la présence d’un ARNm TF quatre dans les échantillons de cerveau à l’aide de différentes procédures de démasquage et de compteurs, méthodes de coloration basées sur des analyses de microscopie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions en neurosciences telles que la localisation et la traduction des ARNm sans exons.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la synthèse des protéines intracon, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les dendrites et les cellules et tissus non neuronaux dans lesquels la localisation de l’ARNm se produit. Après avoir fixé les tranches de cerveau, selon les instructions du protocole écrit, préparez un bocal de copin contenant 60 millilitres de solution de récupération d’antigène et plongez les lames dans la solution. Ensuite, remplissez un bécher d’un litre d’eau distillée et placez-le au micro-ondes pour tamponner la chaleur.

Lors du démasquage, placez le bocal coplan contenant les lames et la solution de récupération dans le micro-ondes. Faites bouillir les lames à haute puissance pendant cinq minutes. Immédiatement après que la solution a cessé de bouillir, chauffez à nouveau les lames à haute puissance pendant cinq minutes supplémentaires.

Laissez les lames refroidir à température ambiante Après refroidissement, plongez les lames dans un plat contenant du PBS pour les laver, puis répétez le lavage deux fois de plus Après le lavage, placez les lames sur une surface plane et ajoutez deux à trois gouttes ou 100 microlitres de DAP B.Probe à deux ou trois sections de cerveau comme contrôle. Pour évaluer la coloration de fond, ajoutez deux à trois gouttes de la sonde de ciblage aux coupes expérimentales Pour détecter l’ARN d’intérêt, une sonde ciblant les résidus 20 à 1381 de souris un ARN TF quatre est utilisée ici. Utilisez une pince pour placer le paramètre sur les lames afin d’éviter l’évaporation de la sonde.

Placez ensuite les lames dans la boîte à lames humidifiée à l’intérieur du four d’hybridation et incuberez-les à 40 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois le temps d’incubation écoulé, lavez les lames dans un plat avec un tampon de lavage x pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux à trois gouttes de réactif d’amplification un MP d’un fl à chaque tranche de cerveau.

Ensuite, couvrez d’un film para frais, placez-le dans la boîte à diapositives et incubez à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans le four d’hybridation. Après avoir lavé les lames comme précédemment, ajoutez deux à trois gouttes de réactif d’amplification A MP quatre fl à chaque tranche de cerveau et recouvrez de perfil. Incuber les lames dans la boîte à diapositives à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans le four d’hybridation.

Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes chacune à température ambiante. Comme auparavant, après le dernier lavage, couvrez chaque tranche avec 100 à 200 microlitres de solution bloquante contenant trois milligrammes par millilitre de BSA, 100 millimolaires de glycine et 0,25 % Triton X 100 dans PBS, couvrez chaque lame avec paraform et incubez pendant 30 minutes À température ambiante après l’incubation, ajoutez 100 à 200 microlitres d’anticorps dilués dans une solution bloquante sur les lames. Un anticorps anti-choline acétyl transférase est utilisé ici après avoir recouvert les lames de perfil incubé pendant deux jours à quatre degrés Celsius.

Assurez-vous que les tranches de cerveau ne se dessèchent pas si nécessaire, réappliquez la solution d’anticorps anti-CHATT sur les tranches de cerveau 24 heures après l’incubation. Après avoir lavé les lames trois fois en un XPBS pendant cinq minutes. À température ambiante, ajoutez 100 à 200 microlitres de l’anticorps secondaire conjugué Alexa approprié sur les lames.

Couvrir avec param et incuber pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière une fois l’heure écoulée. Lavez les lames trois fois dans un XPBS pendant cinq minutes chacune comme auparavant, puis lavez-les une fois avec de l’eau distillée. Montez les lames avec un support de montage contenant le DPI, puis visualisez les coupes de cerveau sous le microscope à fluorescence.

Après avoir préparé des échantillons de cerveau humain formels et fixés inclus dans la paraffine, conformément aux instructions de la partie écrite du protocole, effectuez le démasquage de l’antigène induit par la chaleur en immergeant les lames dans une solution chaude de prétraitement deux et en les faisant bouillir pendant 15 minutes. Après avoir lavé trois à cinq fois dans de l’eau distillée et trois à cinq fois dans de l’éthanol frais à 100 %, laissez les lames sécher pendant cinq minutes à température ambiante pour effectuer le démasquage de l’antigène induit par la protéase. Ajoutez quatre gouttes de prétraitement, trois recouvrez de perfil et incubez pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation Après avoir lavé trois à cinq fois à l’eau distillée.

Comme précédemment, ajoutez quatre gouttes de la sonde DAP B réglée pour contrôler les tranches de cerveau afin d’évaluer la coloration de fond et quatre gouttes de la sonde de ciblage réglée sur les sections expérimentales. Placez la paire de lames recouvertes de film dans la boîte à diapositives et incubez pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans le four d’hybridation. Après avoir suivi les étapes du protocole écrit pour développer le signal DAB pour l’ARNm d’intérêt, vérifiez la présence d’un signal sous un microscope à fond clair.

Définir des zones de référence dans les échantillons de cerveau dans lesquelles surveiller la présence de points tout au long de la procédure de contre-coloration. Pour contrer les taches. Placez d’abord les lames dans luxal fast blue préchauffé à 60 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius.

Après l’incubation, rincez les lames plusieurs fois dans de l’eau distillée, puis trempez-les plusieurs fois dans une solution de carbonate de lithium à 0,05 % pour commencer la différenciation. Ensuite, trempez les lames deux fois dans de l’éthanol frais à 75 % et rincez-les à l’eau distillée. Vérifiez les tranches de cerveau sous un microscope à champ clair.

Notez que la matière grise et blanche doit commencer à être distinguée et que les granules d’ARN sont toujours visibles sous forme de puncta bleu foncé et noir. Vérifiez que les axones commencent à apparaître sous forme de fibres bleu clair, répétez la procédure de coloration au bleu luxal, en incubant avec du bleu luxal par étapes de 10 à 20 minutes et en surveillant attentivement la contre-coloration et la présence de granules d’ARN lorsque la coloration optimale a été obtenue. Placez les lames de rinçage dans une solution de violet crestal et incubez pendant 10 minutes après l’incubation.

Rincez les lames à l’eau distillée. Trempez les lames dans de l’éthanol à 70 % cinq à 10 fois, puis déshydratez-les en changeant rapidement de l’éthanol à 100 % dans une hotte. Dégagez les tranches de cerveau en les incubant deux fois dans du xylène.

Agent nettoyant alternatif pendant deux minutes et une troisième fois pendant cinq minutes. À température ambiante, montez les tranches de cerveau dans un milieu de montage permanent à base de xylène et analysez-les au microscope à champ clair. L’étude a été réalisée à l’aide d’un démasquage induit par la protéase, suivi d’une détection par anticorps de la choline acétyl transférase indiquée en rouge.

L’anticorps n’a pas réussi à reconnaître le chat lors du traitement à la protéase. Des exemples de résultats obtenus avec une sonde non cible et une sonde de visée TF quatre en utilisant les mêmes paramètres de microscope et réglages d’image sont présentés. Quatre granules positifs ATF verts avec une localisation axonale peu claire sont indiqués par des points d’interrogation.

Les zones bleues sont des noyaux tachés de taches lorsque le poisson a été réalisé à l’aide d’un antigène induit par la chaleur. La coloration immunofluorescente du chat de démasquage, de nouveau indiquée en rouge, a été couronnée de succès. Un TF quatre granules positifs localisés aux axones apparaissent orange et sont marqués comme corrects après que les axones aient été contre-colorés avec du luxal.

Fast blue et neuronal SOTA ont été contre-colorés avec du violet crestal luxal sous-optimal. Une coloration bleue rapide peut survenir si la température est diminuée. Ici, les échantillons ont été colorés avec du bleu vif luxal à 40 degrés Celsius pendant quatre heures.

Un TF quatre granules positifs avec une localisation accidentelle peu claire sont indiqués par des points d’interrogation. Une coloration sous-optimale se produit également lorsque l’intensité de la contre-coloration n’est pas vérifiée après de courtes périodes d’incubation, comme on le voit ici. Des exemples de coloration LFB optimale combinée à l’utilisation d’une sonde non cible ou d’une sonde de ciblage TF quatre sont présentés ici.

L’acquisition d’images a été automatiquement ajustée pour obtenir le meilleur rapport signal/bruit. Axon localisé un TF quatre granules sont marqués comme corrects. Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en un à trois jours selon la méthode de contrecoloration choisie après son développement. Cette technique permet aux neuroscientifiques d’explorer la traduction et la localisation de l’ARNm de manière nuancée.