Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des ARNm localisés de manière accidentelle dans des échantillons de cerveau adulte. Cela est réalisé par un prétraitement des échantillons par ébullition et digestion par protéase afin de démasquer les molécules d'ARNm. Dans une deuxième étape, une hybridation est effectuée, suivie d'étapes d'amplification et de détection, qui permettent la visualisation de l'ARNm d'intérêt.

Ensuite, les axones sont colorés à l'aide d'anticorps ou de colorants afin de vérifier que l'ARNm d'intérêt est localisé dans les axones. Les résultats montrent la présence d'un ARNm de TF quatre dans des échantillons cérébraux à l'aide de différentes procédures de démasquage et de contre-colorations, ainsi que de méthodes de coloration fondées sur des analyses microscopiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions en neurosciences, telles que quels ARNm sont localisés et traduits dans des régions sans exons.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la synthèse protéique intracellulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les dendrites et les cellules et tissus non neuronaux dans lesquels se produit la localisation des ARNm. Après avoir fixé les tranches de cerveau conformément aux instructions du protocole écrit, préparez un bocal Coplin contenant 60 millilitres de solution de récupération d'antigène et immergez les lames dans cette solution. Ensuite, remplissez un bécher d'un litre avec de l'eau distillée et placez-le au micro-ondes pour tamponner la chaleur.

Lors de la démasquage, placez le bocal coplan contenant les lames et la solution de récupération dans le micro-ondes. Portez les lames à ébullition à puissance maximale pendant cinq minutes. Immédiatement après l'arrêt de l'ébullition de la solution, réchauffez les lames à nouveau à puissance maximale pendant cinq minutes supplémentaires.

Laisser refroidir les lames à température ambiante. Après refroidissement, plonger les lames dans un récipient contenant du PBS pour les laver, puis répéter le lavage deux fois supplémentaires. Après le lavage, placer les lames sur une surface plane et ajouter deux à trois gouttes ou 100 microlitres de DAP B. Probe sur deux ou trois sections cérébrales servant de contrôle. Pour évaluer la coloration de fond, ajouter deux à trois gouttes de la sonde ciblée sur les sections expérimentales. Pour détecter l'ARN d'intérêt, une sonde ciblant les résidus 20 à 1381 de l'ARN de souris a TF four est utilisée ici. Utiliser une pince pour placer un parafilm sur les lames afin d'éviter l'évaporation de la sonde.

Ensuite, placez les lames dans la boîte à lames humidifiée à l'intérieur du four d'hybridation et incubez-les à 40 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois le temps d'incubation écoulé, lavez les lames dans une boîte avec un tampon de lavage 1 x pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux à trois gouttes de réactif d'amplification aMP1-fl sur chaque section de cerveau.

Ensuite, couvrir avec du film parafilm frais, placer dans la boîte à diapositives et incuber à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’étuve d’hybridation. Après avoir lavé les diapositives comme précédemment, ajouter deux à trois gouttes de réactif d’amplification A MP quatre fl à chaque coupe de cerveau et couvrir avec du perfil. Incuber les diapositives dans la boîte à diapositives à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’étuve d’hybridation.

Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage 1x pendant deux minutes chacune à température ambiante. Comme précédemment, après le dernier lavage, recouvrez chaque coupe de 100 à 200 microlitres de solution de blocage contenant 3 milligrammes par millilitre d'albumine sérique de bœuf (BSA), 100 millimolaire de glycine et 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS, recouvrez chaque lame de parafilm et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajoutez 100 à 200 microlitres d'anticorps dilué dans la solution de blocage sur les lames. Un anticorps anti-choline acétyltransférase est utilisé ici ; après avoir recouvert les lames de parafilm, incubez pendant deux jours à quatre degrés Celsius.

Veillez à ce que les tranches de cerveau ne s'assèchent pas ; si nécessaire, réappliquez la solution d'anticorps anti-CHATT sur les tranches de cerveau 24 heures après l'incubation. Après trois lavages des lames dans du PBS 1X pendant cinq minutes chacun, ajoutez 100 à 200 microlitres d'anticorps secondaire marqué à l’Alexa, approprié, aux lames à température ambiante.

Couvrir avec du param et incuber pendant une heure à température ambiante en protégeant de la lumière ; après l'écoulement de l'heure, laver les lames trois fois dans du XPBS pendant cinq minutes chacune, comme précédemment, puis laver une fois avec de l'eau distillée. Monter les lames avec un milieu de montage contenant du DPI, puis visualiser les tranches de cerveau au microscope à fluorescence.

Après avoir préparé des échantillons de cerveau humain en paraffine formolée et fixée conformément aux instructions de la partie écrite du protocole, effectuez un démasquage antigénique induit par la chaleur en immergeant les lames dans une solution chaude de prétraitement deux et en portant à ébullition pendant 15 minutes. Après avoir lavé les lames de trois à cinq fois dans de l'eau distillée et de trois à cinq fois dans de l'éthanol absolu frais, laissez les lames sécher pendant cinq minutes à température ambiante afin d'effectuer un démasquage antigénique induit par les protéases. Ajoutez quatre gouttes de prétraitement trois, recouvrez de perfil et incubez pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius dans l'étuve d'hybridation, après avoir lavé de trois à cinq fois dans de l'eau distillée.

Comme précédemment, ajouter quatre gouttes du jeu de sondes DAP B sur les tranches de cerveau témoins afin d'évaluer la coloration de fond, et quatre gouttes du jeu de sondes ciblées sur les sections expérimentales. Placer la paire de lames recouverte de film dans la boîte à lames et incuber pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans l'étuve d'hybridation. Après avoir suivi les étapes du protocole écrit pour révéler le signal DAB correspondant à l'ARNm d'intérêt, vérifier la présence d'un signal au microscope en champ clair.

Définir les zones de référence dans les échantillons cérébraux où surveiller la présence de ponctuations tout au long du protocole de contre-coloration. Pour effectuer la contre-coloration, placer d'abord les lames dans du bleu luxal rapide préchauffé à 60 degrés Celsius et incuber pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius.

Après l'incubation, rincez les lames plusieurs fois dans de l'eau distillée, puis plongez-les plusieurs fois dans une solution de carbonate de lithium à 0,05 % pour débuter la différenciation. Ensuite, plongez les lames deux fois dans de l'éthanol à 75 % frais et rincez à l'eau distillée. Examinez les tranches de cerveau au microscope en champ clair.

Remarquez que la matière grise et la matière blanche devraient commencer à être distinguables et que les granules d'ARN restent visibles sous forme de ponctuations noires bleutées. Vérifiez que les axones commencent à apparaître comme des fibres bleu clair, répétez la procédure de coloration au bleu luxal en incubant avec le bleu luxal par étapes de 10 à 20 minutes, et surveillez attentivement la contre-coloration ainsi que la présence des granules d'ARN jusqu'à ce qu'une coloration optimale soit obtenue. Placez les lames rincées dans la solution de violet de crête et incubez pendant 10 minutes après l'incubation.

Rincez les lames à l'eau distillée. Plongez les lames dans de l'éthanol à 70 % cinq à dix fois, puis déshydratez-les par trois changements rapides d'éthanol à 100 % sous hotte chimique. Clarifiez les tranches cérébrales en les incubant deux fois dans le xylène.

Agent de clarification alternatif pendant deux minutes, puis une troisième fois pendant cinq minutes. Monter les coupes de cerveau à température ambiante dans un milieu de montage permanent à base de xylène et analyser au microscope en champ clair. La technique de Fish a été réalisée à l’aide d’un démasquage induit par protéase, suivi d’une détection par anticorps de la choline acétyltransférase, en rouge.

L'anticorps n'a pas réussi à reconnaître chat lorsque le traitement par protéase a été effectué. Des exemples de résultats obtenus avec une sonde non ciblée et une sonde ciblant TF quatre, en utilisant les mêmes paramètres du microscope et ajustements d'image, sont présentés. Des granules positifs verts pour ATF quatre, avec une localisation axonale non claire, sont indiqués par des points d'interrogation.

Les zones bleues sont les noyaux colorés en DAPI lorsque la coloration a été réalisée en utilisant un antigène démasqué par la chaleur. La coloration immunofluorescente, montrée en rouge, a de nouveau été réussie. Des granules positifs pour TF4, localisés dans les axones, apparaissent en orange et sont indiqués comme étant corrects ; les axones suivants ont été contre-colorés avec du Luxol.

Le bleu rapide et le SOTA neuronal ont été contre-colorés avec du violet de crête luxal sous-optimal. Une coloration par le bleu rapide peut survenir si la température est abaissée. Ici, les échantillons ont été colorés avec du bleu rapide luxal à 40 degrés Celsius pendant quatre heures.

Des granules TF quatre positifs dont la localisation accidentelle est imprécise sont indiqués par des points d'interrogation. Une coloration sous-optimale se produit également lorsque l'intensité de la contre-coloration n'est pas vérifiée après de courtes périodes d'incubation, comme observé ici. Des exemples de coloration LFB optimale combinée à l'hybridation in situ utilisant une sonde non ciblée ou la sonde ciblant TF quatre sont présentés ici.

L'acquisition des images a été automatiquement ajustée pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit. L'axone localise quatre granules de facteur de transcription marqués comme étant corrects. Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en un à trois jours, selon la méthode de contre-coloration choisie après son développement. Elle ouvre la voie aux neuroscientifiques pour explorer la traduction et la localisation des ARNm avec nuance.