Name: Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution In Situ Hybridation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Découvrez la détection d'ARNm axonaux localisés dans les sections de cerveau de souris et humain par hybridation in situ haute résolution combinée à l'immunohistochimie. Cette méthode révèle la localisation spatiale des ARNm dans les tissus neuronaux.

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Ce travail a été soutenu par l’Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721 ; à U.H.), le National Institute of Mental Health (MH096702 ; à U.H.), le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333 ; à C.M.T.), et des bourses d’études pilotes du Centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer financé par le National Institute on Aging à l’Université Columbia (AG008702 ; à J.B. et Y.Y.J.) qui soutient également la New York Brain Bank. Nous remercions les membres du laboratoire Hengst pour leurs commentaires et discussions

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<li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506(2014).</li>
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<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li>
<li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li>
<li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+of+SMAD1%2F5%2F8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li>
<li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+poly%28A%29+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li>
<li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li>
<li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li>
<li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079(2012).</li>
<li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li>
<li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li>
<li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li>
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<li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li>
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<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55(2014).</li>
<li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce rapport, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;une technologie de ISH haute résolution dans la détection de l&#39;ARNm axonaux localisée ATF4. Ces précédentes et les études publiées montrent que cette technologie est compatible avec la détection de protéines à base d&#39;anticorps dans les tissus ou même des embryons entiers 33. Surtout, il a été récemment utilisée pour la détection de l&#39;ARNm de l&#39;arc à l&#39;intérieur de dendrites des neurones de l&#39;hippocampe 34.</...

Le recrutement d&#39;ARNm axonale et la traduction locale permettent axones à répondre à des stimuli extracellulaires d&#39;une manière temporellement et spatialement aiguë 1. La synthèse des protéines intra-axonal est mieux compris dans le contexte de développement neurologique où elle joue un rôle crucial dans la croissance cône comportement 8.2, 11.9 et des axones signalisation rétrograde 12,13. Mais loin en sait moins sur la signification fonctionnelle de la synthèse des protéines axonale dans les neurones post-développement lorsque les niveaux d&#39;ARNm et de ribosome axonales sont considérablement réduits 14,15. Axones vertébrés matures ont longtemps été pensé pour être inactive translation 16. Cependant, des études récentes indiquent que la traduction locale est réactivé dans les axones matures dans des conditions pathologiques. Par exemple, un sous-ensemble des ARNm est recruté pour axones après une lésion du nerf et de la synthèse des protéines intra-axonal est nécessaire pour la régénération correcte de ces axones 17. En outre, notre ha de groupes a montré que les ARNm spécifiques sont recrutés pour des axones après une exposition locale à la maladie d&#39;Alzheimer peptide Aß 1-42, et de la traduction locale ATF4 facteur de transcription est nécessaire pour propager les effets neurodégénératifs de Aß 1-42 de axones au soma neuronal 18. Enfin, les analyses à haut débit ont révélé que les axones matures ont un transcriptome plus complexe et dynamique que prévu 18-21, en ​​particulier dans des conditions pathologiques. À la lumière de ces études, une méthode hautement sensible et spécifique pour détecter les ARNm axonaux localisées dans le système nerveux adulte est nécessaire. Une grande partie du travail sur le recrutement de l&#39;ARNm et la traduction locale dans les axones matures a été effectuée sur des neurones en culture. Cela est particulièrement vrai pour les analyses de transcriptome car les méthodes de culture spécialisés existent qui permettent l&#39;isolement des axones de la somato-dendritique compartiment 18-20. Bien que ces études ont donné ins précieusesight dans le rôle de la traduction locale dans les axones matures, la question de savoir si des neurones en culture représentent fidèlement la situation in vivo ou si le recrutement ARNm est une réponse adaptative des axones à conditions de culture est toujours ouverte. Peu d&#39;études ont fourni des preuves de recrutement d&#39;ARNm de mûrir axones in vivo. Par exemple, la transcription codant pour la protéine de marquage olfactif a été détectée dans les axones des neurones sensoriels adultes 22. Un transgène contenant l&#39;extrémité 3 &#39;UTR de l&#39;ARNm de β-actine est transporté vers les axones des neurones du système nerveux central et périphérique chez des souris et se traduit localement après 23 périodes de développement. Lamin de l&#39;ARNm est localisée aux axones de la rétine dans Xenopues laevis têtards et son épuisement affecte l&#39;entretien de l&#39;axone après le développement des axones 21. Interférence avec le transport axonal de l&#39;ARNm codant pour la cytochrome C oxydase IV modifie le comportement de la souris 24. Enfin, ATF4 ARNm se trouve dans un adulteXons des souris et des cerveaux humains dans le contexte de Aß 1-42 induite par la neurodégénérescence 18. Analyses du transcriptome à haut débit se sont avérées utiles pour identifier les profils d&#39;ARNm dans les axones isolés in vitro, mais avoir des limites pour des études in vivo depuis dans les tissus entiers axones ne se trouvent jamais dans l&#39;isolement, mais entremêlées avec les organes de cellules neuronales, cellules gliales et d&#39;autres types de cellules. Ainsi, de telles analyses doivent être combinées avec des techniques d&#39;imagerie qui confirment la localisation subcellulaire des ARNm. Hybridation in situ de l&#39;ARN (ARN ISH) en permet la détection et la visualisation des séquences d&#39;ARN spécifiques dans les cellules et les tissus. Cependant, les tests ARN ISH originaux étaient conviennent que pour l&#39;identification des ARN très abondantes 25, ce qui est rarement le cas pour les ARNm axonaux localisées. Pour les dernières décennies des efforts accrus ont été mis en développant de nouvelles technologies qui permettent la détection des ARNm au niveau d&#39;une seule molécule <sup&gt; 25,26. Par exemple, Singer et ses collègues ont mis au point des sondes ISH pour détecter des ARNm dans des cellules individuelles, consistant à 5 non-chevauchement marqué par fluorescence 50-mères (pour plus de détails se réfèrent à 27). La principale différence entre les techniques mentionnées ci-dessus et celle décrite ici est que le plus tard, utilise 20 à double Z-structure (pas linéaire) sondes qui ciblent typiquement ~ 1 kb région de l&#39;ARN d&#39;intérêt assurant la spécificité et faible niveau de fond. Les sondes sont ensuite hybridées avec préamplificateur et l&#39;amplificateur des séquences qui sont finalement marqué par fluorescence ou conjugués avec des enzymes qui permettent des réactions chromogènes. Ces étapes d&#39;amplification d&#39;améliorer le rapport signal-bruit par rapport à d&#39;autres technologies de ISH 28. Nous décrivons ici deux protocoles utilisant RNAscope associée, soit à fluorescence immunocytochimie ou avec des colorants histologiques permettant contre-coloration axonale. Les deux protocoles sont appropriés pour visualiser la localisation axonale des ATF4 ARNm dans mo adultesutiliser et les cerveaux humains.

<table><tbody><tr><td>sonde personnalisée ciblant les résidus 20-1 381 de l’ARNm de souris Atf4 (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics-sonde</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sonde personnalisée ciblant les résidus 15-1 256 de l’ARNm ATF4 humaine (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics-sonde</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de</td><td>contrôle négatif-sonde</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>310043 DapB Advanced Cell Diagnosticssonde de contrôle positif-souris Polr2A (en option)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td></td></tr><tr><td>sonde de contrôle positif-PPIB humain (en option)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>sonde</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (pour la détection de fluorescence)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>in situ kit d’hybridation</td></tr><tr><td>Kit de réactifs RNAscope 2.0 HD - MARRON (pour la détection chromogène)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>in situ kit d’hybridation</td></tr><tr><td>polyclonal de chèvre anti-ChAT</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify agent nettoyant (substitut de xylène)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage ProLong Gold avec DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage DPX</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de axonaux localisée arnm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; in situ</em&gt; hybridation

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

ARNm sont souvent localisées aux axones vertébrés et leur traduction locale est nécessaire pour pathfinding axone ou de branchement pendant le développement et pour l&#39;entretien, la réparation ou la neurodégénérescence dans les périodes postdevelopmental. Analyses à haut débit ont récemment révélé que les axones ont un transcriptome plus dynamique et plus complexe que prévu. Ces analyses, mais ont été principalement fait dans des neurones en culture, où les axones peuvent être isolées à partir des compartiments de somato-dendritique. Il est pratiquement impossible de réaliser une telle isolation dans les tissus entiers in vivo. Ainsi, afin de vérifier le recrutement d&#39;ARNm et leur pertinence fonctionnelle dans un animal entier, les analyses de transcriptome devraient idéalement être combinées avec des techniques qui permettent la visualisation des ARNm in situ. Récemment, de nouvelles technologies de l&#39;ISH qui détectent ARN au niveau d&#39;une seule molécule ont été développés. Ceci est particulièrement important lors de l&#39;analyse de la localisation subcellulaire de l&#39;ARNm, ARN depuis localisées se trouvent généralement à des niveaux faibles. Nous décrivons ici deux protocoles pour la détection des ARNm axonaux-localisées en utilisant une technologie ultrasensible nouvel ARN ISH. Nous avons combiné RNAscope ISH avec de contraste axonale par immunohistochimie de fluorescence ou des colorants histologiques de vérifier le recrutement de ATF4 ARNm aux axones in vivo chez la souris adulte et les cerveaux humains.

Un bref résumé des procédures décrites ci-dessus est représentée sur la figure 1. Détection optimale des ATF4 ARNm granules dans les axones cholinergiques utilisant démasquage induite par la chaleur Lors de l&#39;évaluation localisation axonale des ARNm, il est essentiel de pouvoir identifier les axones et d&#39;être en mesure de visualiser faibles ARN abondantes. La technologie de l&#39;ARN ISH décrit ici permet la détection d&#39;ARN à...

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des ARNm localisés de manière accidentelle dans des échantillons de cerveau adulte. Cela est réalisé par un prétraitement des échantillons par ébullition et digestion par protéase afin de démasquer les molécules d'ARNm. Dans une deuxième étape, une hybridation est effectuée, suivie d'étapes d'amplification et de détection, qui permettent la visualisation de l'ARNm d'intérêt.Ensuite, les axones sont colorés à l'aide d'anticorps ou de colorants afin de vérifier que l'ARNm d'intérêt est localisé dans les axones. Les résultats montrent la présence d'un ARNm de TF quatre dans des échantillons cérébraux à l'aide de différentes procédures de démasquage et de contre-colorations, ainsi que de méthodes de coloration fondées sur des analyses microscopiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions en neurosciences, telles que quels ARNm sont localisés et traduits dans des régions sans exons.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la synthèse protéique intracellulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les dendrites et les cellules et tissus non neuronaux dans lesquels se produit la localisation des ARNm. Après avoir fixé les tranches de cerveau conformément aux instructions du protocole écrit, préparez un bocal Coplin contenant 60 millilitres de solution de récupération d'antigène et immergez les lames dans cette solution. Ensuite, remplissez un bécher d'un litre avec de l'eau distillée et placez-le au micro-ondes pour tamponner la chaleur.Lors de la démasquage, placez le bocal coplan contenant les lames et la solution de récupération dans le micro-ondes. Portez les lames à ébullition à puissance maximale pendant cinq minutes. Immédiatement après l'arrêt de l'ébullition de la solution, réchauffez les lames à nouveau à puissance maximale pendant cinq minutes supplémentaires.Laisser refroidir les lames à température ambiante. Après refroidissement, plonger les lames dans un récipient contenant du PBS pour les laver, puis répéter le lavage deux fois supplémentaires. Après le lavage, placer les lames sur une surface plane et ajouter deux à trois gouttes ou 100 microlitres de DAP B. Probe sur deux ou trois sections cérébrales servant de contrôle. Pour évaluer la coloration de fond, ajouter deux à trois gouttes de la sonde ciblée sur les sections expérimentales. Pour détecter l'ARN d'intérêt, une sonde ciblant les résidus 20 à 1381 de l'ARN de souris a TF four est utilisée ici. Utiliser une pince pour placer un parafilm sur les lames afin d'éviter l'évaporation de la sonde.Ensuite, placez les lames dans la boîte à lames humidifiée à l'intérieur du four d'hybridation et incubez-les à 40 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois le temps d'incubation écoulé, lavez les lames dans une boîte avec un tampon de lavage 1 x pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux à trois gouttes de réactif d'amplification aMP1-fl sur chaque section de cerveau.Ensuite, couvrir avec du film parafilm frais, placer dans la boîte à diapositives et incuber à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’étuve d’hybridation. Après avoir lavé les diapositives comme précédemment, ajouter deux à trois gouttes de réactif d’amplification A MP quatre fl à chaque coupe de cerveau et couvrir avec du perfil. Incuber les diapositives dans la boîte à diapositives à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’étuve d’hybridation.Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage 1x pendant deux minutes chacune à température ambiante. Comme précédemment, après le dernier lavage, recouvrez chaque coupe de 100 à 200 microlitres de solution de blocage contenant 3 milligrammes par millilitre d'albumine sérique de bœuf (BSA), 100 millimolaire de glycine et 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS, recouvrez chaque lame de parafilm et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajoutez 100 à 200 microlitres d'anticorps dilué dans la solution de blocage sur les lames. Un anticorps anti-choline acétyltransférase est utilisé ici ; après avoir recouvert les lames de parafilm, incubez pendant deux jours à quatre degrés Celsius.Veillez à ce que les tranches de cerveau ne s'assèchent pas ; si nécessaire, réappliquez la solution d'anticorps anti-CHATT sur les tranches de cerveau 24 heures après l'incubation. Après trois lavages des lames dans du PBS 1X pendant cinq minutes chacun, ajoutez 100 à 200 microlitres d'anticorps secondaire marqué à l’Alexa, approprié, aux lames à température ambiante.Couvrir avec du param et incuber pendant une heure à température ambiante en protégeant de la lumière ; après l'écoulement de l'heure, laver les lames trois fois dans du XPBS pendant cinq minutes chacune, comme précédemment, puis laver une fois avec de l'eau distillée. Monter les lames avec un milieu de montage contenant du DPI, puis visualiser les tranches de cerveau au microscope à fluorescence.Après avoir préparé des échantillons de cerveau humain en paraffine formolée et fixée conformément aux instructions de la partie écrite du protocole, effectuez un démasquage antigénique induit par la chaleur en immergeant les lames dans une solution chaude de prétraitement deux et en portant à ébullition pendant 15 minutes. Après avoir lavé les lames de trois à cinq fois dans de l'eau distillée et de trois à cinq fois dans de l'éthanol absolu frais, laissez les lames sécher pendant cinq minutes à température ambiante afin d'effectuer un démasquage antigénique induit par les protéases. Ajoutez quatre gouttes de prétraitement trois, recouvrez de perfil et incubez pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius dans l'étuve d'hybridation, après avoir lavé de trois à cinq fois dans de l'eau distillée.Comme précédemment, ajouter quatre gouttes du jeu de sondes DAP B sur les tranches de cerveau témoins afin d'évaluer la coloration de fond, et quatre gouttes du jeu de sondes ciblées sur les sections expérimentales. Placer la paire de lames recouverte de film dans la boîte à lames et incuber pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans l'étuve d'hybridation. Après avoir suivi les étapes du protocole écrit pour révéler le signal DAB correspondant à l'ARNm d'intérêt, vérifier la présence d'un signal au microscope en champ clair.Définir les zones de référence dans les échantillons cérébraux où surveiller la présence de ponctuations tout au long du protocole de contre-coloration. Pour effectuer la contre-coloration, placer d'abord les lames dans du bleu luxal rapide préchauffé à 60 degrés Celsius et incuber pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius.Après l'incubation, rincez les lames plusieurs fois dans de l'eau distillée, puis plongez-les plusieurs fois dans une solution de carbonate de lithium à 0,05 % pour débuter la différenciation. Ensuite, plongez les lames deux fois dans de l'éthanol à 75 % frais et rincez à l'eau distillée. Examinez les tranches de cerveau au microscope en champ clair.Remarquez que la matière grise et la matière blanche devraient commencer à être distinguables et que les granules d'ARN restent visibles sous forme de ponctuations noires bleutées. Vérifiez que les axones commencent à apparaître comme des fibres bleu clair, répétez la procédure de coloration au bleu luxal en incubant avec le bleu luxal par étapes de 10 à 20 minutes, et surveillez attentivement la contre-coloration ainsi que la présence des granules d'ARN jusqu'à ce qu'une coloration optimale soit obtenue. Placez les lames rincées dans la solution de violet de crête et incubez pendant 10 minutes après l'incubation.Rincez les lames à l'eau distillée. Plongez les lames dans de l'éthanol à 70 % cinq à dix fois, puis déshydratez-les par trois changements rapides d'éthanol à 100 % sous hotte chimique. Clarifiez les tranches cérébrales en les incubant deux fois dans le xylène.Agent de clarification alternatif pendant deux minutes, puis une troisième fois pendant cinq minutes. Monter les coupes de cerveau à température ambiante dans un milieu de montage permanent à base de xylène et analyser au microscope en champ clair. La technique de Fish a été réalisée à l’aide d’un démasquage induit par protéase, suivi d’une détection par anticorps de la choline acétyltransférase, en rouge.L'anticorps n'a pas réussi à reconnaître chat lorsque le traitement par protéase a été effectué. Des exemples de résultats obtenus avec une sonde non ciblée et une sonde ciblant TF quatre, en utilisant les mêmes paramètres du microscope et ajustements d'image, sont présentés. Des granules positifs verts pour ATF quatre, avec une localisation axonale non claire, sont indiqués par des points d'interrogation.Les zones bleues sont les noyaux colorés en DAPI lorsque la coloration a été réalisée en utilisant un antigène démasqué par la chaleur. La coloration immunofluorescente, montrée en rouge, a de nouveau été réussie. Des granules positifs pour TF4, localisés dans les axones, apparaissent en orange et sont indiqués comme étant corrects ; les axones suivants ont été contre-colorés avec du Luxol.Le bleu rapide et le SOTA neuronal ont été contre-colorés avec du violet de crête luxal sous-optimal. Une coloration par le bleu rapide peut survenir si la température est abaissée. Ici, les échantillons ont été colorés avec du bleu rapide luxal à 40 degrés Celsius pendant quatre heures.Des granules TF quatre positifs dont la localisation accidentelle est imprécise sont indiqués par des points d'interrogation. Une coloration sous-optimale se produit également lorsque l'intensité de la contre-coloration n'est pas vérifiée après de courtes périodes d'incubation, comme observé ici. Des exemples de coloration LFB optimale combinée à l'hybridation in situ utilisant une sonde non ciblée ou la sonde ciblant TF quatre sont présentés ici.L'acquisition des images a été automatiquement ajustée pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit. L'axone localise quatre granules de facteur de transcription marqués comme étant corrects. Une fois maîtrisé.Cette technique peut être réalisée en un à trois jours, selon la méthode de contre-coloration choisie après son développement. Elle ouvre la voie aux neuroscientifiques pour explorer la traduction et la localisation des ARNm avec nuance.

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