Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur

La génération et la caractérisation des tumeurs des cellules T spécifiques en utilisant des souris humanisés est décrit ici. Human tissu thymique et génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines sont transplantées dans des souris immunodéprimées. Cela se traduit par la reconstitution d'un système immunitaire humain ingénierie permettant l'examen in vivo des réponses anti-tumorales immunitaires.

L’objectif général de l’expérience suivante est de générer des souris porteuses d’un système immunitaire humain modifié. Ceci est réalisé en préparant d’abord la souris pour la chirurgie, puis en chargeant le trocart avec un morceau de thymus dans la deuxième étape. Matrigel est mélangé avec des cellules transductées négatives et positives de CD 34, puis le mélange est ajouté au trocart.

Ensuite, les constructions matrigel sont transplantées sous la capsule rénale. En fin de compte, le rejet des tumeurs cibles par les cellules T CD huit génétiquement modifiées peut être surveillé par l’imagerie en direct et les mesures physiques des tumeurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes de méthamphétamine existantes comme les modèles entièrement neuronaux, est que cette méthode permet l’étude du développement de cellules souches humaines génétiquement modifiées dans le thymus humain et des tests d’efficacité in vivo ultérieurs de lignées dérivées démontrant la procédure sera par trois techniciens de nos laboratoires, Gregory Bristol, Bernard Levin, et Sean Kim.

Dans ce schéma de principe, le modèle BLT modifié utilisé dans ces études pour la génération de souris chimériques porteuses de mart, une cellule T spécifique est décrite. L’implant est reconstruit à partir de cellules CD 34 transduites et non transduites isolées d’un foie fœtal autologues. Une fraction des cellules transduites est ensuite congelée et injectée dans les souris irradiées quatre à six semaines plus tard.

Dans cette vidéo, l’implantation de la construction vivante est démontrée une fois que les animaux sont devenus léthargiques à cause de l’anesthésie. Commencez par raser le côté gauche de chaque souris de la hanche à l’épaule entre le centre du dos et le ventre. Après avoir noté le poids de chaque animal, percez ses oreilles pour la numérotation et injectez par voie sous-cutanée 0,3 millilitre de carprofène dans chacune de ses épaules.

Ensuite, posez les souris sur leur côté droit face à gauche. Maintenant, rincez le trocart d’une aiguille d’implant cancéreux de calibre 16 avec une pointe de lime ronde avec PBS. À l’aide d’une paire de pinces à bec effilé, ajoutez un morceau de thymus dans le plat de PBS, puis tenez le trocart à l’horizontale avec la tige.

Juste à l’intérieur de l’extrémité, aspirez le tissu. Glisser le trocart sous la capsule rénale et injecter le tissu est l’un des aspects les plus difficiles de cette procédure. Ensuite, ayez une aide.

À l’aide d’une pipette à déplacement positif eend orph, mélangez cinq microlitres de matrigel froid dans un tube de cellules en agitant doucement. Maintien du trocart à l’horizontale. Tirez lentement sur la tige pendant que l’assistant pipette le matri gel.

Mélangez dans le trocart pour chaque souris. Tout d’abord, tamponnez la peau nue de l’animal avec de la bétadine, puis essuyez-la avec une lingette isopropanol. Deux fois déterminent la tache la plus foncée sous la peau, indiquant l’emplacement de la rate.

Le rein se trouve à environ cinq millimètres dorsal de la rate à l’aide d’une pince émoussée pour ramasser la peau au-dessus du rein. Faites une coupure d’environ 15 millimètres de long dans la peau parallèle à la rate. Faites une coupe similaire dans la couche musculaire du péritoine ci-dessous.

Chez les mâles, le rein doit être directement visible. Il suffit de presser l’abdomen pour le faire sortir. En maintenant la pression sur l’abdomen avec la main gauche pour garder le rein exposé, chez les femelles, utilisez d’abord un hémostat pour ramasser l’ovaire, puis tirez le rein vers l’extérieur pour aider à retenir l’organe à l’extérieur du corps.

Creusez un petit trou à l’extrémité postérieure de la capsule rénale, puis glissez le trocart dans ce trou et le long du rein jusqu’à ce que l’orifice du trocart soit complètement recouvert par la capsule rénale. Ensuite, à l’aide de l’auriculaire de la main droite, injectez le tissu. Utilisez maintenant l’hémostat fermé pour repousser doucement le rein en place.

Attachez un point dans le péritoine avec un double arc, en pressant la peau vers le haut comme un sac à main, puis mettez-le dans deux pinces à enroulement. Enfin, mettez une goutte de PBS sur chaque œil et posez la souris sur le côté dans une cage sur une litière. Après avoir implanté toutes les souris de la même manière, confirmez que les animaux sont redevenus couchés sur le ventre avant de les quitter.

Cette première figure montre une image représentative de l’implant vivant THI chez des souris humanisées. Cette figure met en évidence le développement normal du tissu thymique et la distribution physiologique des CD quatre et CD huit positifs T humains. Après reconstitution, les animaux sont porteurs d’un système immunitaire humain avec une distribution normale de lymphocytes T positifs pour les cellules CD quatre et CD.

Ici, une image représentative d’une souris porteuse d’une tumeur de mélanome est présentée. Les zones grises indiquent l’image de la tomodensitométrie. Les zones colorées indiquent l’activité métabolique de la tumeur telle que détectée par la TEP.

Le scanner seul dans cette expérience a indiqué une grande masse tumorale dans la zone indiquée par le cercle blanc. Cependant, comme l’illustre l’imagerie TEP in vivo, cette zone se compose principalement de tissu nécrotique et cicatriciel, ce qui souligne l’utilité de l’imagerie TEP comme moyen plus sensible et plus précis d’évaluer la régression et l’élimination des tumeurs. À la suite de cette procédure, d’autres tests tels que les lymphocytes T, le phénotypage et l’activation ex vivo peuvent être effectués pour répondre à des questions pertinentes sur la fonction des lymphocytes T.