Un protocole de microscopie de localisation multi-marquage à molécule unique pour l’étude de la chromatine dans un environnement nucléaire dense
5 juin 2026
Nous présentons un protocole tricolore de microscopie de localisation de la chromatine à molécule unique (SMLM) qui permet une cartographie reproductible de l’euchromatine, de l’hétérochromatine et du RNAP II pour une analyse spatiale. Ce protocole permet un marquage multicolore efficace dans des environnements nucléaires denses, y compris des cibles associées à la chromatine, permettant une détection simultanée fiable.
Nos recherches examinent la composition épigénétique des domaines d’empaquetement de la chromatine, et la manière dont les facteurs régulateurs influencent leur structure et leur fonction. Ce protocole est particulièrement utile pour étudier les relations spatiales entre cibles et environnements cellulaires denses, tels que le noyau. Pour commencer, peser l’albumine sérique bovine afin que la concentration finale dans le volume tampon requis pour l’expérience soit de 3 %. Ajouter l’albumine sérique bovine dans un tube centrifugeuse.
Inclinez le tube de centrifugeuse à un angle de 45 degrés pour répartir les cristaux d’albumine sérique bovine, puis ajoutez du PBS au tube. Cela empêche l’agglutinement des cristaux. Laissez tous les cristaux d’albumine sérique bovine se dissoudre naturellement à température ambiante et évitez les secousses ou les vortex.
Une fois les cristaux complètement dissous, ajoutez du Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 0,2 %. Si les cristaux restent, pipettez la solution plusieurs fois pour mélanger lentement la solution sans former de bulles. Prenez les cellules vivantes de l’incubateur. Retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque.
Lavez les cellules en ajoutant suffisamment de PBS pour recouvrir les cellules, puis pipettez le PBS. Ensuite, pipetez suffisamment de solution fixative pour recouvrir les cellules et laissez-les fixer pendant 10 minutes. À l’aide d’une balance, peser le borohydrure de sodium pour préparer une solution trempante à 0,1 %.
Ajoutez le borohydrure de sodium dans un tube centrifugeuse. Faites en pipette la solution fixative de la plaque. Ensuite, ajoutez suffisamment de PBS à la plaque pour couvrir la surface cellulaire.
Placez la vaisselle sur un shaker pendant cinq minutes pour laver les cellules. Ensuite, ajoutez le volume requis de PBS au borohydrure de sodium dans le tube centrifugeuse. Faites un vortex dans le tube pour mélanger la solution de trempe.
Retirez le plat du shaker et jetez le PBS du plat. Ajoutez suffisamment de solution trempante pour recouvrir la surface du plat. Ensuite, placez le plat sur un shaker pendant sept minutes pour atténuer l’autofluorescence dans les cellules.
Jetez la solution de trempe restante dans le tube centrifugeuse dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté. Retirez le plat du shaker puis retirez la solution trempante du plat. Ensuite, ajoutez assez de PBS à la plaque pour recouvrir la surface.
Placez la vaisselle sur un shaker pendant cinq minutes pour laver les cellules. Après l’incubation, retirez le PBS et répétez le lavage avec le PBS deux fois supplémentaires. Ajoutez maintenant assez de tampon de blocage à la plaque pour couvrir la surface.
Incubez la plaque sur un shaker pendant au moins une heure pour perméabiliser les membranes cellulaires et bloquer les sites de liaison. Pour préparer la solution primaire de coloration par anticorps, transférez le volume requis de la base tampon de blocage vers un nouveau tube centrifugeuse. Ajouter le volume requis de stock d’anticorps primaire au tampon de blocage pour atteindre la concentration finale spécifiée par le fabricant.
Ensuite, remplacez le tampon de blocage par suffisamment de solution primaire anti-colorant pour couvrir la surface de la plaque et faites éclore sur un shaker pendant une à deux heures ou pendant une nuit. Après l’incubation primaire des anticorps, remplacer la solution primaire par un tampon de lavage. Ensuite, placez la plaque sur un shaker pendant cinq minutes pour laver les cellules.
Répétez le lavage du tampon deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages. Préparez la solution secondaire de coloration par anticorps selon la concentration recommandée. Calculez le volume total de la solution de coloration en ajoutant 0,5 millilitre au volume nécessaire pour recouvrir les cellules.
Transférez le volume calculé du tampon de blocage dans un nouveau tube centrifugeuse pour préparer la solution de coloration. Ensuite, ajoutez le volume approprié de stock d’anticorps secondaire au tampon de blocage pour obtenir la concentration finale correcte. Enveloppez le tube de centrifugeuse contenant la solution secondaire de coloration par anticorps dans du papier aluminium, puis mélangez la solution en pipettant de haut en bas.
Ajoutez suffisamment de solution secondaire anticorps pour tacher la plaque pour recouvrir la surface. Placez la plaque sur un shaker pendant 40 minutes pour fixer les fluorophores sur les cibles cellulaires marquées. Couvrez la plaque de papier aluminium pour éviter la décoloration au fluorophore.
Après 40 minutes, effectuez deux lavages PBS comme démontré précédemment. Si le stockage est préféré, ajoutez suffisamment de PBS à l’antenne pour couvrir la surface de la cellule avant le stockage. Enveloppez le plat dans un parafilm pour éviter l’évaporation du liquide, puis avec du papier aluminium pour éviter le blanchiment fluorophore.
Conservez le plat emballé à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’image. Le protocole de coloration séquentielle a produit des images représentatives en chromatine tricolore dSTORM pour plusieurs lignées cellulaires, y compris les cellules BJ Fibroblast, HeLa et MCF 10A. La chaîne d’analyse a été évaluée à l’aide de jeux de données simulés représentant des distributions toroïdales uniformes normales et spatiales aléatoires ancrées aux positions des groupes d’hétérochromatine.
Des schémas d’organisation spatiale distincts ont produit des profils histogrammes de distance caractéristique lorsque les coordonnées de localisation ont été analysées par rapport aux centroïdes hétérochromatine. Des marqueurs spatialement séparés simulés dans une configuration choroïdale normale produisaient une densité articulaire minimale, aboutissant à un profil de distribution plat. Des motifs de marqueurs qui se chevauchent simulés dans une configuration aléatoire normale produisaient une densité des joints décroissante à mesure que la distance par rapport aux points de référence augmentait.
L’identification des domaines hétérochromatine par balayage de base de données a permis de catégoriser en domaines petit, moyen et grand selon le rayon effectif. L’analyse quantitative des distances a montré que l’ARN polymérase II et H3K27ac se localisaient près des frontières de l’hétérochromatine sur les domaines petits, moyens et grands. L’analyse de densité articulaire a montré une colocalisation maximale de H3K27ac et de polymérase ARN II juste en dehors des limites des clusters d’hétérochromatine.
Grâce à ce protocole, les chercheurs peuvent interroger l’organisation apparemment désordonnée de la chromatine afin d’explorer la relation entre sa structure, ses éléments régulateurs et ses résultats fonctionnels. En suivant cette procédure, diverses analyses computationnelles basées sur des images ou des nuages de points peuvent extraire des caractéristiques structurelles quantitatives des données spatiales, selon la modalité d’imagerie utilisée. Les chercheurs peuvent étendre cette méthode d’étiquetage en optimisant des marqueurs supplémentaires et en tirant parti des données multi-canaux pour permettre des analyses plus avancées et complètes.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
