Comprendre les changements de la morphologie mitochondriale à l’aide de micrographies à fluorescence dynamiques et tridimensionnelles

Le but de notre recherche est d’observer les changements dans les réseaux mitochondriaux et d’étudier comment ces réseaux mitochondriaux changent en réponse aux conditions cellulaires. Nous utilisons des outils open source tels que Fiji et Python, en combinant des bibliothèques existantes avec des macros et des scripts personnalisés pour automatiser l’analyse de la morphologie mitochondriale à partir de données complexes de microscopie à fluorescence. Obtenir des données quantitatives fiables et des mesures qui décrivent la dynamique de la fission et de la fusion mitochondriales avec leur localisation en 3D reste un défi.

La normalisation pour la production de ces données n’est pas couramment disponible. Par conséquent, les connaissances sur la fréquence de fission et de fusion spécifiques aux cellules et la localisation intracellulaire sont limitées. Nous avons ajouté la détection de la vie de la fission et de la fusion mitochondriales aux paramètres de recherche disponibles.

Et en les combinant avec le nombre de structures mitochondriales, nous avons pu définir une nouvelle métrique pour comprendre la dynamique du réseau mitochondrial. Nos résultats nous permettent de caractériser des paramètres de fission et de fusion spécifiques aux cellules et, pour la première fois, de déterminer si le système mitochondrial est en équilibre ou en déplacement. Cela permet d’éviter les erreurs majeures d’interprétation des phénotypes dans le domaine de la santé et de la maladie et fournit un cadre clair pour des rapports précis.

Pour commencer, ouvrez le fichier brut dans ImageJ. Ajustez les paramètres de couleur pour améliorer la visibilité de la région d’intérêt, mais ne définissez rien. Dupliquez l’image en fonction du nombre de cellules individuelles à analyser.

Si plusieurs cellules sont présentes dans un champ de vision, accédez à Analyser, Outils et utilisez l’outil Windows synchronisé et l’outil Dessin à main levée pour dessiner une région d’intérêt autour d’une cellule d’intérêt, puis sélectionnez Modifier et choisissez Effacer à l’extérieur pour isoler la cellule sélectionnée. Séparez les canaux rouge et bleu l’un de l’autre et enregistrez le canal mitochondrial dans un fichier tif. Pour générer une fonction d’étalement de points ou PSF, rouvrez l’image brute.

Ouvrez ensuite le plugin PSF generator en sélectionnant Plugins, puis PSF Generator et Born wolf 3D Optical Model. Ouvrez les informations d’image de l’image brute en sélectionnant Image, puis Afficher les informations ou en appuyant sur I sur le clavier. Faites défiler vers le bas de la fenêtre d’informations de l’image.

Sélectionnez l’option de taille et de profondeur du voxel et modifiez la longueur d’onde à 568 nanomètres. Réglez la taille de pixel XY sur 166,1 nanomètres, le pas de Z sur 200 nanomètres. Définissez la taille XYZ pour qu’elle corresponde à une résolution d’image de 512 x 512 et configurez la pile Z pour qu’elle contienne 10 tranches Z.

Cliquez sur Exécuter. Enregistrez le PSF sous forme de fichier tif dans son propre dossier. Accédez à Plug-ins, sélectionnez Macros, puis Modifier, puis Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm pour accéder à la macro de déconvolution. Modifiez les lignes d’entrée et de sortie selon vos besoins et appuyez sur Exécuter pour exécuter la macro. Pour améliorer le contraste et le flou de l’image, accédez à Plugins, sélectionnez Macros, choisissez Modifier et ouvrez Pré-traitement.

ijm pour accéder à la macro de prétraitement. Effectuez une soustraction d’arrière-plan en réglant le rayon de la balle roulante sur 6. Réglez le Sigma Filter Plus de telle sorte que le rayon soit défini sur 1 fois le facteur d’échelle.

Le nombre de pixels utilisés est de 2 et la fraction minimale de pixels est de 0,2, ce qui garantit que le plugin est configuré pour être conscient des valeurs aberrantes. Ajustez les paramètres CLAHE en configurant la taille de bloc sur 64, les bacs d’histogramme sur 256, la pente maximale sur 2,5 et le gamma sur 0,8, puis cliquez sur Exécuter. Ouvrez un fichier d’intérêt qui a été modifié à l’aide du Pré-processus.

ijm dans ImageJ. Accédez à Plug-ins et sélectionnez Seuil adaptatif. Définissez le seuil local sur la moyenne pondérée et ajustez la taille du bloc de pixels selon vos besoins.

Cliquez sur Aperçu et ajustez la taille du bloc pour inclure clairement autant de mitochondries que possible. Modifiez la valeur de soustraction de chaque cellule pour éliminer l’arrière-plan inutile et prenez note de la micrographie résultante. Pour optimiser le temps, triez les images dans des fichiers en fonction de la valeur de soustraction appliquée.

Naviguez maintenant vers Plugins, sélectionnez Macros, choisissez Modifier et ouvrez Seuil. ijm pour accéder à la macro de seuillage. Modifiez le script de macro pour définir les chemins d’entrée et de sortie, la taille des blocs et les valeurs de soustraction.

Cliquez sur Exécuter pour exécuter la macro. Ouvrez jusqu’à 10 micrographies seuillées qui appartiennent à la même condition de traitement. Accédez à Image, Piles, Outils et sélectionnez Concaténer, puis appuyez sur OK.To supprimer les petits points résiduels laissés par le seuillage, allez dans Plugins, puis Filtres d’image intégrés, puis sélectionnez Supprimer les valeurs aberrantes.

Utilisez l’aperçu pour affiner les tailles X et Y afin d’éliminer les fragments. Enregistrez le fichier concaténé en tant que fichier TIF. Enfin, accédez à Plugins, Macros, Edit, QuickTest_new.ijm.

Modifiez les lignes de chemin d’entrée et de sortie pour pointer vers les répertoires appropriés, cliquez sur Exécuter et visualisez les résultats du localisateur d’événements mitochondriaux ou MEL. La dynamique mitochondriale a été suivie au fil du temps avec des points rouges marquant les événements de fission et des points verts marquant les événements de fusion dans les vues 3D et 2D. Les réseaux mitochondriaux ont montré des différences de structure spécifiques au traitement au fil du temps, avec des formes plus allongées et interconnectées dans les cellules traitées à la metformine et des réseaux très fragmentés dans les cellules traitées à la metformine CCCP Baf.

Le groupe metformine CCCP Baf a montré une activité de fission et de fusion significativement plus élevée que les groupes témoin ou metformine seule, suggérant une augmentation du remodelage mitochondrial. Ce groupe avait également un nombre mitochondrial significativement plus élevé, ce qui correspond à une fragmentation accrue. Le volume mitochondrial a été significativement réduit dans le même groupe, ce qui a renforcé le passage à la fission.

Cependant, lorsqu’il est normalisé au nombre mitochondrial, le groupe metformine seule présentait l’activité dynamique relative la plus élevée, ce qui suggère que la metformine seule favorise un réseau de remodelage plus actif et plus efficace, tandis que le co-traitement entraîne un renouvellement structurel important mais moins efficace.