Name: Imagerie de la synapse immunologique humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez l'imagerie de la synapse immunologique humaine formée entre les cellules Raji et les lymphocytes T Jurkat. Cette méthode par microscopie à fluorescence permet d'observer la sécrétion polarisée et le trafic cellulaire en temps réel.

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Nous remercions tous les membres passés et présents du laboratoire pour leur généreuse contribution. Ce travail a été soutenu par des subventions du Ministre espagnol d'Economa y Competitividad (MINECO), Plan Nacional de Investigacion Cient-fica (SAF2016-77561-R à M.I., qui a été en partie accordée avec le financement fedER-CE). Nous remercions Facultad de Medicina (UAM) et Departamento de Audiovisuales de la Faculté de Médicine pour leur soutien et les installations fournies pour produire la vidéo. Nous remercions NIKON-Europe pour son soutien technique et théorique continu et superbe. L'accès gratuit à cet article est parrainé par Nikon.

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Une limitation de ce protocole est que toutes les synapses ne seront pas idéalement orientées perpendiculairement à l'axe optique. En utilisant cette technique, il n'existe aucun moyen de prédire et/ou d'influencer l'orientation idéale pour l'imagerie par synapse immunitaire. Pour résoudre ce problème, nous excluons des analyses ultérieures toutes les synapses capturées au hasard qui ne répondent finalement pas aux critères idéaux. Ces synapses, opportunement, ne sont pas très fréquentes. Cependant, il est possible de contourner cette limitation en utilisant plusieurs approches expérimentales4.
La libération polarisée de CD63 (dégranulation) peut être quantifiée par d'autres techniques complémentaires telles que la coloration de surface cellulaire de CD63 (relocalisation de CD63 à la surface de cellules) dans les cellules vivantes (non fixes et non perméabilisées), après l'étape 6, et la fixation et la fixation et la fixation de lavage et de lavage suivantes, comme indiqué précédemment8. En outre, la libération de CD63 sur les exosomes8,9 et la quantification exosome par des analyses de suivi des nanoparticules9,25 peuvent être effectuées. Ces approches sont certainement compatibles avec notre protocole, à condition que la fixation soit effectuée après l'immunofluorescence de surface cellulaire des cellules vivantes.
Nous avons trouvé le nombre idéal de cellules (pour un puits de 1 cm2 dans la glissière de chambre de 8 puits) est de 4 x 105 cellules (2 x 105 cellules Raji et 2 x 105 cellules Jurkat) car elles adhèrent efficacement au fond du puits. L'efficacité de liaison au plastique (à l'aide de fibronectin), ou le fond de verre (utilisant la poly-L-lysine) microslides n'est généralement pas un problème. Le nombre plus élevé de cellules peut ne pas produire de lacunes entre les cellules adhérentes et, par la suite, les conjugates synaptiques complexes (figure 1); les deux situations ne sont pas souhaitables lorsque les conjuguations unicellulaires doivent être représentées dans, par exemple, des expériences de polarisation des granules MTOC ou sécrétrices. Un nombre plus faible de cellules peut diminuer les chances de trouver des conjugués, en particulier lorsque les cellules Jurkat transfectées sont mises au défi avec APC pour générer des synapses. Veuillez noter qu'un incubateur de stade stabilisé par la température en place sur le stade du microscope X/Y avant le début du protocole (c.-à-d. 1-2 h à l'avance pour stabiliser la configuration de stade/microscope) maintient les paramètres stables de X,Y,Z, ce qui est crucial pour une imagerie appropriée. Le système de mise au point automatique finira par compenser les petites variations Z.
Lorsque certaines techniques de transduction génique telles que l'électroporation sont utilisées pour exprimer des protéines chimériques fluorescentes (c.-à-d. GFP-CD63) dans les clones de Jurkat (Vidéo 1), une fraction considérable des cellules peuvent mourir après l'électroporation. Cela peut être un problème puisque bien que les cellules mortes ne forment pas de synapses, quand elles sont en excès sur les cellules vivantes et transfectées, elles peuvent interférer avec la formation de conjugués faits par les cellules vivantes de Th. Nous avons constaté que l'élimination soigneuse des cellules mortes des cultures transfectées en utilisant un milieu de gradient de densité suivant des protocoles standard avant l'étape de formation conjuguée peut en effet augmenter les chances de bien image conjuguer. En outre, les faibles efficacités de transfection (lt;20%) peut être une mise en garde importante puisque ceci, combiné avec une efficacité modérée de formation conjuguée (environ 60%)25,diminuera la probabilité de trouver des conjugués faits par les cellules transfectées. Ce n'est pas un problème lorsque des cellules non transfectées sont utilisées pour obtenir des conjugués dans les expériences de point final et la fixation ultérieure. Les 8 diapositives de chambre de micropuits sont compatibles avec les protocoles conventionnels d'immunofluorescence. Cela augmente la flexibilité du protocole ci-dessus à des fins différentes. Fixation avec l'acétone peut être un problème à considérer lors de l'utilisation de diapositives de chambre avec des puits de fond en plastique. Cependant, il y a dans le commerce 8 diapositives de chambre de microscope de micropuits disponibles contenant des fonds en verre, qui sont compatibles avec la fixation d'acétone. Retirez les couvercles en plastique lorsque l'acétone est utilisée pour fixer les cellules cultivées dans 8 diapositives de chambre en verre micropuits.
Il est recommandé que le microscope soit équipé d'un stade XY motorisé, d'une tourelle à épifluorescence motorisée et d'un système de mise au point automatique (p. ex., Perfect Focus System) ou de suppléments équivalents. Lorsque l'acquisition multi-puits est nécessaire25, le système de mise au point automatique assurera une orientation stable tout au long de l'expérience. L'expérience antérieure indique qu'en établissant une compensation appropriée de mise au point sur les cellules Raji, le mouvement des lymphocytes T (Vidéo 1) et les mouvements de diapositives de stade/chambre de microscope dans les expériences multi-points de XY, peuvent être compensés. C'est en effet pratique pour la capture multiwell time-lapse.
Une caméra couplée à dispositif couplé (CDD) chargée en noir et blanc, panchromatique et refroidie a été utilisée, mais une caméra semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (sCMOS) à sensibilité plus élevée est souhaitable, car cela réduira les temps d'exposition de la caméra et améliorera la résolution temporelle. Les temps d'exposition à la caméra courte que nous avons utilisés (forme de classement de 100 ms à 500 ms) combinés à l'obturateur de fluorescence automatique permettent une capture prolongée du laps de temps (jusqu'à 24 h) avec une résolution de temps adéquate (1 cadre par minute ou moins, pour un nombre de 16 positions XY) sans blanchiment de fluorescence significative et/ou perte de viabilité cellulaire. L'étape motorisée permet la capture multi-points (XY) et augmente la chance de trouver et d'imager les synapses émergentes et en développement dans l'orientation idéale, mais permet également l'acquisition d'images dans des diapositives de chambre multiwell lorsque différents clones Jurkat doivent être simultanément conjugués25. Une ouverture numérique élevée de l'objectif (c.-à-d. 60x, 1.4) est nécessaire afin d'obtenir les meilleurs résultats lors de l'analyse du trafic de granules sécréteurs.
Le RAJI-SEE-Jurkat constitue un modèle de synapse immunologique bien établi qui a été utilisé par une myriade de chercheurs depuis qu'il a été initialement décrit11. Nous avons adapté notre protocole à ce modèle afin d'imager correctement les premiers stades de la formation de l'EI. Notre objectif était d'améliorer les premières approchessuivies 20 pour étudier la polarisation du MTOC et de la machinerie sécrétrice vers l'EI. Il est remarquable que les conjugués réalisés avec ce protocole produisent F-actin réorganisation à la synapse, la configuration d'un SMAC canonique, en même temps que le trafic polarisé MVB25. Ces événements cruciaux ont également été analysés et validés par microscopieconfocale 25.
Il existe des différences cinétiques dans le trafic polarisé entre les différents types d'IS. Par exemple, le transport polarisé des granules lytiques à partir des LCT se fait en quelques secondes ou en très peu de minutes, alors que plusieurs vésicules contenant de la cytokine des lymphocytes Th prennent de quelques minutes à plusieurs heures de fin. Ces différences temporelles doivent être prises en compte à l'avance, afin de concevoir la meilleure stratégie et de choisir l'approche expérimentale et d'imagerie la plus appropriée, puisque pour certains stratagèmes d'imagerie (c.-à-d., microscopie confocale de balayage laser (LSCM)), le temps peut être un facteur limitant puisque le temps de capture est beaucoup plus élevé que la résolution de temps appropriée (1 min ou moins)4. Ce n'est pas une limitation lorsque la microscopie à fluorescence à large champ (FMFM) est utilisée comme décrit dans le protocole ci-dessus. Puisque dans les CTL, la polarisation du MTOC vers la synapse ne dure que quelques minutes3,6,17, diverses approches spécifiques de microscopie de l'art différentes de celles décrites ici (mais abritant une résolution spatiale et temporelle plus élevée) sont nécessaires afin d'imager correctement ces synapses26,27, principalement lorsque plusieurs champs de microscope (capture multi-point) sont image. Ces nouvelles approches à haute résolution peuvent également être utilisées pour l'imagerie des synapses faites par les lymphocytes Th, bien que des raisons économiques et/ou logistiques (c.-à-d. que l'équipement de base requis pour certaines de ces techniques d'imagerie coûte 6 à 7 fois plus que celui décrit ici) pourraient certainement constituer une limitation pour ces méthodes d'imagerie de pointe4. Le fait que les IS faites par les lymphocytes Th sont de longue durée, et la circonstance que dans th lymphocytes le MTOC, les vésicules sécrétrices de lymphokine contenant et MVB prendre de plusieurs minutes jusqu'à des heures pour le transport et l'amarrage à l'IS22, rend ce protocole une approche idéale et abordable pour l'imagerie de la Th-APC IS.
La FMAM, combinée à la déconvolution d'images post-acquisition, constitue une approche intéressante et non seulement des raisons économiques appuient cette stratégie. La mauvaise résolution intrinsèque dans l'axe Z (la mise en garde la plus importante de la technique) peut être améliorée en utilisant la déconvolution d'image post-acquisition4 (comparez la vidéo 1 avec la vidéo 2). Deconvolution utilise une approche de traitement d'image basée sur le calcul qui peut améliorer le rapport signal/bruit et la résolution de l'image et contraster27 jusqu'à 2 fois, jusqu'à 150-100 nm dans l'axe XY et 500 nm dans l'axe Z4.
L'utilisation d'une sensibilité plus élevée, d'une vitesse de lecture élevée et d'une large plage dynamique, de nouvelles caméras sCMOS à fluorescence amélioreront la qualité des images et réduiront le blanchiment de fluorescence. La flexibilité offerte par le protocole de conjugaison de cellule à cellule décrit ici permet la combinaison de l'approche cellulaire décrite avec plusieurs techniques de microscopie de pointe, à la fois dans les cellules vivantes, mais aussi dans les cellules fixes, et les résultats attendus améliorera en effet notre connaissance de la synapse immunologique.
Bien que nous ayons mis en œuvre et validé le protocole en utilisant des lignées cellulaires faciles à manipuler et bien établies, le potentiel de l'approche peut permettre la visualisation d'interactions plus physiologiques lorsque les lymphocytes T primaires et différents types de cellules présentant des antigènes (comme les cellules dendritiques des macrophages) sont utilisés5. Dans ce contexte, ce protocole a également été étendu et validé en utilisant la lignée cellulaire EL-4 de souris à impulsions de superantigène (SEB) utilisée comme APC, pour défier les lymphoblastes T de souris primaires9. En effet, les lymphocytes T primaires, en particulier les CTL, ont rendu des contacts synaptiques plus éphémères et dynamiques (voir La vidéo supplémentaire 8 en référence9) à ceux observés avec le modèle SEE-Raji et Jurkat. La variabilité des modes de contact synaptiques peut être mieux vu pour les interactions primaires de Cellule T avec les cellules dendritiques ou les cellules B dans les équivalents de tissu in vitro bidimensionnels qui peuvent également être enregistrés et analysés en utilisant ce protocole. En outre, en dehors des superantigènes, la technique peut être utilisée pour l'image d'autres types de synapses. Par exemple, il pourrait être utilisé dans un modèle de lymphocyteT transgénique et spécifique à l'antigène T, par exemple en utilisant le système spécifique d'OValbumin OT1/OT2 ou par transfection de lymphocytes T avec des récepteurs de lymphocytes T spécifiques à l'antigène. Cela ouvre une myriade de possibilités expérimentales pour l'avenir immédiat.

L'objectif principal de la méthode est de générer des conjuguations immunologiques de synapse (IS) de cellule à cellule formées par une cellule de présentation d'antigènes (APC) pulsée avec des superantigènes SEE et une cellule Effector Th, et d'enregistrer les images correspondant aux premières étapes de la formation de synapse immunologique et des événements de trafic subséquents (se produisant à la fois dans l'APC et la cellule Th), qui finiront par conduire à la sécrétion polarisée à l'IS. La mise en place de l'IS par lymphocytes T sur la liaison de leur récepteur cellulaire (TCR) aux antigènes liés à MHC-II sur l'APC organise un cas extrêmement dynamique, malléable et critique impliqué dans les réponses immunitaires antigènes spécifiques, humoristiques et cellulaires1,2. L'IS est défini par la formation d'un modèle spécial de complexe d'activation supramoléculaire (SMAC) caractérisé par un processus de réorganisation de l'actine3. Lors de la construction par les lymphocytes T avec un APC, la polarisation des vésicules sécrétrices vers l'EI semble être impliquée dans la sécrétion polarisée à l'écart synaptique. Cette machinerie ciblée semble fournir sans ambiguïté le système immunitaire avec un stratagème superbement réglementé pour améliorer l'efficacité des rôles critiques effecteur sécréteur de sécrétrices des lymphocytes T, tout en réduisant non spécifique, cytokine-arbitrated stimulation des cellules de spectateur, la mise à mort des cellules cibles non pertinentes et le suicide apoptotique par la mort cellulaire induite par l'activation (AICD)4.
La conséquence de l'IS varie en fonction de la nature du lymphocyte T et de l'APC. Le contact synaptique des cellules Th (généralement des cellules CD4) avec l'APC affichant l'antigène associé au MHC-II produit l'activation de la cellule T (sécrétion de cytokine, prolifération, etc.) et, dans certains cas, de l'apoptose via AICD4. Pour les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) (principalement les cellules CD8MD) qui interagissent avec l'antigène aPC présentant un antigène associé au MHC-I, le résultat diffère sur la préstimulation ou non des CTL avec de l'antigène. Ainsi, les CTL naïfs identifiant les complexes antigènes-MHC-I sur l'APC sont « préparés » pour détruire les cellules cibles et diviser. Les CTL apprêtés établissent également des synapses avec des cellules cibles (c.-à-d., cellules infectées par des virus ou des cellules tumorales) produisant l'extermination cellulaire antigène-spécifique5,6.
La sécrétion polarisée des exosomes à la synapse immunologique est un domaine de recherche en développement et stimulant impliqué dans les réponses immunitaires pertinentes7. Il a été démontré que les corps multivésiculaires (MVB) porteurs de vésicules intraluminescentes (ILV) subissent un transport polarisé vers l'IS8,9 ( Vidéo1) sur stimulation TCR avec antigène. La fusion de ces MVB à la membrane synaptique induit leur dégranulation et la libération des ILVs comme exosomes à la fente synaptique8,10. Ceci se produit dans IS formé par les cellules de Jurkat de th-type qui ont été défiées avec les cellules de Raji superantigènes-enduites de SEE agissant comme APC11,CD4 TCR-stimulés- lymphoblastes, et CTLs apprêtés. Ainsi, les synapses fabriquées par les cellules Jurkat constituent un modèle précieux pour étudier le trafic sécréteur polarisé des exosomes. En outre, plusieurs décennies d'enquête ont montré que de nombreuses connaissances fondamentales sur la signalisation TCR provenaient d'études avec des lignées de lymphocytes T transformées, et en effet le plus connu de ces systèmes modèles est la ligne loucopique Jurkat t-cell12.
La formation d'un IS entièrement développé produit plusieurs résultats biologiques cruciaux, y compris l'activation des cellules Th, l'activation des CTL naïfs ou la mise à mort de cellules cibles par les CTL amorcés, en dehors de l'anergie ou AICD5. Par conséquent, il existe deux principaux types de sécrétion est établi par les lymphocytes T qui se traduisent par très diverses, mais tout aussi critique, fonctions de l'effecteur immunitaire1,6,13. D'une part, l'IS des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisé une polarisation rapide (allant de quelques secondes à quelques minutes) de granules lytiques (appelés « lysosomes sécréteurs ») vers l'EI. La dégranulation des granules lytiques induit la perforine de sécrétion et les granzymes à la fente synaptique14, qui sont des molécules pro-apoptotic. La perforine sécrétée et les granzymes induissaient par la suite à tuer les cellules cibles15,16. Les CTL développent des synapses temporaires, qui ne durent que quelques minutes, car les cellules cibles sont assassinées3,17. Cela est probablement dû à la circonstance que la tâche optimale CTL nécessite un contact rapide et temporaire afin de distribuer autant de grèves mortelles que possible à de nombreuses cellules cibles3,17. En revanche, les lymphocytes Th tels que les cellules Dejurkat génèrent des IS stables et de longue date (de 10 à 30 minutes jusqu'à des heures), car cela semble nécessaire à la fois pour la sécrétion directionnelle et incessante de cytokines stimulantes3,17. Les cytokines sont également enfermés dans des vésicules sécrétrices et certains d'entre eux (c.-à-d., IL-2, IFN-) expérience de transport polarisé à l'IS17 et la sécrétion. Une caractéristique essentielle de l'Is est la formation de contacts exploratoires, faibles et transitoires entre la cellule T et l'APC (Vidéo 1) qui peuvent produire une interaction plus forte et l'établissement d'un IS mature, à condition que le TCR identifie les complexes d'antigène-MHC cognate et que des connexions co-stimulantes appropriées soient établies5. Le début des premiers contacts et la fondation d'un IS mature et totalement productif sont intrinsèquement stochastiques, rapides et asynchrones processus5,18. En outre, il y a une fréquence rare dans la création des conjugaisons de cellule à cellule19,qui peuvent constituer un défi pour les techniques d'imagerie (s'il vous plaît se référer aux résultats et aux sections de discussion).
Un autre défi principal en examinant la polarisation du centre d'organisation de microtubule (MTOC) et des granules de sécrétion dans les lymphocytes T est que le processus entier est rapide (secondes à quelques minutes), particulièrement dans Les CTL. Compte tenu de ces faits, la plupart des premières approches ont fait face à une stratégie de point final dans laquelle les cellules APC/cibles et les lymphocytes T sont mélangés conjointement et convergentparés par centrifugation à basse vitesse, pour favoriser la création conjugale de cellule à cellule, incubée pendant plusieurs minutes, fixe et évaluée par la suite pour le relocalisation du MTOC et/ou des vésicules sécrétrices vers l'IS20. Cette approche a deux limites importantes : aucune donnée de trafic animée n'a été obtenue et des niveaux élevés de polarisation des granules MTOC/sécréteurs ont été obtenus, probablement en raison du caractère stochastique de l'établissementIS 18. En outre, toute corrélation entre les événements de signalisation initiale stimulés par le TCR (c.-à-d. augmentations intracellulaires de calcium, réorganisation de l'actine) et polarisation sécrétrice de vésicule est problématique à étudier. Ainsi, les dispositions impératives pour une imagerie appropriée de l'IS dans les cellules vivantes se combinent pour améliorer la matérialisation conjugalisation cellule-cellule, pour synchroniser la génération de l'IS et, dans la mesure du possible, pour garantir l'établissement de conjugués cellulaires aux champs et aux positions Z du microscope défini. Plusieurs stratégies ont été élaborées afin d'éviter tous ces problèmes. Il n'est pas possible d'expliquer ces méthodes, leurs avantages et leurs faiblesses. S'il vous plaît se référer aux commentaires déjà publiés s'attaquant à ces points importants1,4,5,21.
Le fait que les is faites par les lymphocytes Th sont de longue durée, et la circonstance que dans th lymphocytes le MTOC, les granules sécréteurs de lymphokine contenant et MVB prendre de plusieurs minutes jusqu'à des heures pour se déplacer et s'amarrer à l'IS22 rend le Th-APC IS un candidat idéal pour l'imagerie en utilisant le protocole décrit ici.

<table><tbody><tr><td>Appareil photo Nikon DS-QI1MC</td><td>Nikon</td><td>MQA11550</td><td>Tête d’appareil photo refroidie</td></tr><tr><td>CMAC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2110</td><td>Cell tracker bleu</td></tr><tr><td>Cellules JURKAT</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-152</td><td>Effecteur Lymphocytes T</td></tr><tr><td>&mu ;-Slide 8 puits ibiTreat, &mu ;-Slide 8 well Glass-Bottom</td><td>IBIDI</td><td>Cat.No : 80826, 80827</td><td>Supports de culture cellulaire et d’imagerie cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td>NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Microscope à fluorescence grand champ, entièrement motorisé, équipé de l’option Perfect Focus System (PFS)</td></tr><tr><td>Incubateur de platine de microscope avec mélangeur de gaz manuel à 3 canaux et module de bulle de gaz/humidité</td><td>OKOLAB</td><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td>Atmosphère de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-86</td><td>APC</td></tr><tr><td>RPMI medium GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21875034</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Streptococcus Enterotoxine E (SEE)</td><td>Toxin Technology, Inc</td><td>EP404</td><td>Logiciel de toxine bactérienne</td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>SVI</td><td>Logiciel de déconvolution d’image</td><td>Huygens Essential</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>NIH</td><td>Image J</td><td>Logiciel d’image</td></tr><tr><td>Nikon NIS-AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements AR</td><td>Logiciel de capture et d’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

imagerie de la synapse immunologique humaine

Imaging the Human Immunological Synapse

Le but de la méthode est de générer une synapse immunologique (IS), un exemple de conjugaison cellule-cellule formée par une cellule présentant un antigène (APC) et une cellule de lymphocyte T (Th) d'aide effectrice, et d'enregistrer les images correspondant aux premières étapes de la formation de l'EI et les événements de trafic subséquents (qui se produisent à la fois dans l'APC et dans la cellule Th). Ces événements finiront par conduire à une sécrétion polarisée à l'EI. Dans ce protocole, les cellules de Jurkat ont défié avec staphylococcus entérotoxine E (SEE)-pulsé raji cellules comme modèle de synapse de cellules a été employé, en raison de la proximité de ce système expérimental à la réalité biologique (Th cellules-APC conjugues synaptiques). L'approche présentée ici implique la conjugaison de cellule à cellule, l'acquisition de time-lapse, la microscopie à fluorescence à champ large (WFFM) suivie du traitement d'image (déconvolution post-acquisition). Cela améliore le rapport signal-bruit (SNR) des images, améliore la résolution temporelle, permet l'acquisition synchronisée de plusieurs fluorochromes dans les conjugués synaptiques émergents et diminue le blanchiment de fluorescence. En outre, le protocole est bien assorti avec les protocoles de fixation cellulaire de point final (paraformaldehyde, acétone ou méthanol), qui permettraient davantage de coloration et d'analyses d'immunofluorescence. Ce protocole est également compatible avec la microscopie confocale de balayage laser (LSCM) et d'autres techniques de microscopie de pointe. Comme mise en garde principale, seules les limites de la cellule T-APC (appelées interfaces IS) qui étaient à l'angle droit de 90 degrés par rapport au plan de mise au point le long de l'axe Z pouvaient être correctement imageet analysée. D'autres modèles expérimentaux existent qui simplifient l'imagerie dans la dimension Z et les analyses d'images suivantes, mais ces approches n'émulent pas la surface complexe et irrégulière d'un APC, et peuvent favoriser des interactions non physiologiques dans l'IS. Ainsi, l'approche expérimentale utilisée ici est appropriée pour se reproduire et pour faire face à certaines complexités biologiques se produisant à l'IS.

Nous avons suivi le protocole décrit afin de générer des conjugués jurkat-Raji synapse immunitaire et d'imager correctement les premiers stades de la formation IS. Notre objectif était d'améliorer les premières approchessuivies 20 pour étudier la polarisation du MTOC et de la machinerie sécrétrice vers l'EI. Ces approches étaient basées sur une stratégie de point final qui ne permettait pas l'imagerie de la formation d'IS ou des événements synaptiques précoces, puisque dans ces stratégies la formation d'IS obligatoire s'est produite dans le granule des cellules mélangées et centrifugées, mais pas sur un microscope. Notre protocole a été conçu pour éviter cette mise en garde principale, puisque l'approche était basée sur l'utilisation d'une concentration cellulaire appropriée (étapes 2 et 3), pour favoriser la formation des conjugués IS de cellule à cellule sur les diapositives de chambre de microscope propres (8 micro glissière de chambre de puits), montés sur l'incubateur de microscope pré-chauffé (à l'étape 4). Cette stratégie induit la formation IS, simultanément à la capture d'imagerie time-lapse (Vidéo 1).
La figure 1 représente les conjuguations jurkat-Raji synaptiques obtenues selon le protocole (étape 5.2). L'image représente la première image d'une expérience représentative en time-lapse. 2 x 105 cellules Raji et 2 x 105 cellules Jurkat ont été ajoutées à un puits de 1 cm2. Le panneau supérieur montre le canal de transmission, le panneau moyen se compose du canal CMAC (bleu) (cellules Raji), et le panneau inférieur montre à la fois la transmission plus les canaux fusionnés CMAC. Les flèches jaunes étiquettent quelques conjugués synaptiques, comme référence, tandis que les flèches vertes indiquent des conjugates synaptiques faites par une cellule de Jurkat et plusieurs cellules de Raji (conjugués complexes). La diminution des concentrations cellulaires (10 cellules de5 ou moins dans le puits de 1 cm2) contournera la formation de conjugués cellulaires complexes, mais il se peut qu'il n'y ait pas assez de conjugués cellulaires pour l'analyse ultérieure du trafic polarisé (voir ci-dessous), ce qui diminuera également les chances de trouver et d'imager les conjugues synaptiques émergentes.
La figure 2 représente des captures d'écran correspondant aux paramètres d'imagerie utilisés pour la capture simultanée des deux fluorochromes différents (CMAC et GFP-CD63) en utilisant un logiciel approprié (c.-à-d. NIKON NIS_AR) dans une expérience de laps de temps représentative correspondant à la vidéo 1.
La vidéo 1 (synapses immunologiques, brutes) représente un lymphocyte Jurkat T exprimant GFP-CD63 (un marqueur de corps multivésiculaires-MVB, vésicules vertes) et la formation d'une double synapse entre 1 cellule Jurkat et 2 cellules Raji étiquetées avec CMAC, en bleu (l'une d'entre elles subit un engloutissement). Le mouvement simultané du MVB à l'intérieur de la cellule de Jurkat vers les zones de synapse a été enregistré (taux d'images de capture 1 cadre toutes les 20 secondes pour GFP-CD63; vitesse de reproduction vidéo à 2 images par s). Les conjugués synaptiques ont été obtenus et photographiés suivant le protocole décrit ci-dessus (étape 6.2), qui a permis l'imagerie des synapses émergentes (Vidéo 1). La capture simultanée des canaux de fluorescence GFP-CD63 et CMAC a été effectuée à l'aide d'un logiciel approprié (c.-à-d. NIS-AR, Table of Materials). La vidéo représente les données brutes d'une expérience représentative en time-lapse. Le système de mise au point automatique a été défini avec un décalage approprié en ce qui concerne les cellules Raji liés au fond de verre, pour assurer une orientation stable le long de l'expérience.
La vidéo 2 (synapses immunologiques, après déconvolution) correspond à la vidéo 1, mais la déconvolution des images du canal de fluorescence GFP-CD63 a été réalisée en utilisant un logiciel de déconvolution approprié (c.-à-d. Huygens), en utilisant l'option optique « champ large » et les paramètres optiques appropriés (étape 8). Ce canal décongestionné a ensuite été fusionné au CMAC, canal brut. L'amélioration du rapport signal-bruit et de la netteté de l'image est évidente. La déconvolution a été effectuée après l'acquisition, comme décrit ci-dessus. Pour plus de détails concernant le logiciel de déconvolution s'il vous plaît se référer à4.
La vidéo 3 (synapse immunologique, après fixation et coloration immunofluorescence) représente une pile Z (taille de l'étape Z à 0,8 m, 5 cadres) d'un conjugaison IS fixe après l'étape 6 du protocole (fixation de l'acétone). Après fixation, l'immunofluorescence a été exécutée suivant les protocoles standard25 en utilisant Phalloidin pour visualiser le F-actin (vert), anti-CD63 pour visualiser MVB (magenta), anti-tubulin pour visualiser MTOC (rouge). Le CMAC (bleu) étiquette la cellule Raji. Par la suite, le conjugaison a été photographié par épifluorescence et plusieurs canaux décongestionné en utilisant l'option optique « champ large » et les paramètres optiques appropriés (étape 7). Les canaux décongestionnés ont par la suite été fusionnés au CMAC, canal brut, comme indiqué dans les différents panneaux (CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CMac63 et CMAC plus anti-tubulin, respectivement). La flèche blanche étiquette la synapse, tandis que la flèche verte étiquette le MVB et la flèche jaune étiquette le MTOC. La quantification détaillée de la polarisation MVB et MTOC a été expliquée ailleurs25.
L'approche présentée ici implique la formation de conjugués de cellule à cellule et, simultanément, l'acquisition en time-lapse par microscopie à fluorescence à large champ (FMFM) suivie du traitement de l'image (déconvolution post-acquisition). Cette tactique a amélioré le rapport signal-bruit (SNR) des images, amélioré leur résolution temporelle, et a permis l'acquisition synchronisée de plusieurs fluorochromes dans les conjuguations synaptiques émergentes4. En outre, le protocole est bien assorti avec les méthodes ultérieures de fixation des cellules point final (paraformaldéhyde, acétone ou méthanol), ce qui permettrait d'autres taches d'immunofluorescence et d'analyses25 (Vidéo 3). Ce protocole est également compatible avec la microscopie confocale de balayage laser et d'autres techniques de microscopie de pointe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig1.jpg"> Figure 1 : Champ de microscopie double représentatif des conjugués synaptiques. L'image représente la première image d'une expérience représentative en time-lapse suivant le protocole. Le panneau supérieur montre le canal de transmission, le canal CMAC du panneau moyen (cellules Raji) et le panneau inférieur les deux canaux fusionnés. Les flèches jaunes étiquettent quelques conjugates synaptiques, comme référence. Les flèches vertes indiquent des conjugués synaptiques complexes (c.-à-d. une cellule Jurkat établissant des synapses avec plus d'une cellule Raji). Capturé avec un objectif 40x EWD (0.6 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig2a.jpg"> Figure 2 : Réglages du microscope laps de temps. L'image correspond à plusieurs captures d'écran correspondant aux paramètres d'imagerie utilisés pour la capture simultanée des deux fluorochromes différents (CMAC et GFP-CD63) à l'aide d'un logiciel approprié (c.-à-d. NIKON NIS_AR) dans une expérience de laps de temps représentative correspondant à la vidéo 1. Chaque image pour le canal GFP-CD63 a été capturée tous les 20 s. Un seul cadre pour un canal UV sur huit images pour le canal GFP a été capturé afin de maintenir la viabilité cellulaire tout au long de l'expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig2alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid1.jpg"> Vidéo 1 : Synapses immunologiques faites par une cellule Jurkat exprimant GFP-CD63, données brutes. Les cellules Raji B étiquetées avec le bleu de traqueur de cellules (CMAC, bleu) ont été pulsées avec LE pendant 30 min et des synapses avec des cellules de Jurkat exprimant GFP-CD638 ont été formées. Des time-lapses correspondant aux canaux GFP-CD63 et CMAC ont été capturés (20 s par image; vitesse de reproduction vidéo à 2 images par s) et un exemple représentatif est montré. Capturé avec un objectif 60x PLAN APO (1.4 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_1.mov" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid2.jpg"> Vidéo 2 : Synapses immunologiques faites par une cellule Dejurkat exprimant GFP-CD63, après la déconvolution. Idem que la vidéo 1, mais les images ont été décongestionnelles à l'aide d'un logiciel de déconvolution. L'amélioration du rapport signal-bruit et l'amélioration de la netteté, en raison de l'élimination de la fluorescence hors foyer de contaminants, sont évidentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_2.mov" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/60312/60312vid3v2.jpg"> Vidéo 3 : Synapse immunologique fixe et immunostained. L'image montre un conjugaison synaptique fixe représentatif après l'étape 7 du protocole et l'immunofluorescence suivante. CMAC (bleu) étiquette les cellules raji, la transmission (TRANS) pour montrer les conjugués synaptiques (flèche blanche), Phalloidin étiquettes F-actin (vert), anti-CD63 étiquettes MVB (magenta, flèche verte) et anti-tubulin étiquettes MTOC (rouge, flèche jaune), respectivement. Ces canaux ont été imagepar épifluorescence, décongestionné et fusionné comme indiqué. La vidéo comprend une pile Z (taille de l'étape z de 0,8 m, 5 images). La flèche blanche étiquette la zone de contact synaptique, tandis que la flèche verte étiquette le MVB et la flèche jaune étiquette le MTOC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_3.mov" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).</a>

Ce protocole image à la fois la formation de synapse immunologique et le trafic sécréteur polarisé suivant vers la synapse immunologique. Des conjugués cellulaires ont été formés entre une cellule Raji à impulsion de superantigène (agissant comme cellule de présentation d'antigène) et un clone de Jurkat (agissant comme lymphocyte T d'aide d'effecteur).

Imagerie de la synapse immunologique humaine

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Le but de la méthode est de générer une synapse immunologique qui est un exemple de conjugaison de cellule à cellule formée par une cellule antigène-présentation et un lymphocyte de T-helper. Notre objectif est d’enregistrer les premiers stades de la formation de synapse immunitaire et d’enregistrer les événements de trafic qui se produisent dans le lymphocyte T-helper. Ceux-ci mèneront par la suite à la sécrétion polarisée à la synapse immunisée.L’approche présentée ici implique la conjugaison de cellule à cellule, l’acquisition de time-lapse, la microscopie de fluorescence à champ large, et le traitement ultérieur d’image. Cela améliore le rapport signal-bruit des images, améliore la résolution temporelle et permet l’acquisition simultanée de plusieurs fluorochromes dans les conjugués synaptiques émergents et diminue le blanchiment par fluorescence. En outre, le protocole est compatible avec les protocoles de fixation cellulaire de point final qui permettront la coloration et l’analyse d’immunofluorescence.Ce protocole est également compatible avec la microscopie fluorescente à balayage laser et d’autres techniques de microscopie à la fine pointe de la technologie. Ana Bello, étudiante diplômée, Alejandro Garrido, technicien, et Solange Moreno, étudiante diplômée, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, ajouter 150 microlitres de fibronectine à chaque puits d’une diapositive de chambre de huit microwell et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure.Après la période d’incubation, aspirer la fibronectine et bien laver avec 200 microlitres de PVS pendant deux minutes avec des secousses douces. Répétez ce lavage une fois de plus et laissez le deuxième lavage dans le puits. Transférer 10 millilitres d’une préculture confluente de cellules Raji dans un tube v-fond de 15 millilitres.Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement la pastille cellulaire dans un milieu chaud et complet à une concentration de 1 million de cellules par millilitre. Pour étiqueter les cellules Raji, transférer le nombre requis de cellules dans le milieu de la culture à un tube de deux millilitres.Pour la diapositive de chambre de huit micro puits, un total de 1,6 millilitres de suspension cellulaire est nécessaire. Ajouter le bleu de traqueur cellulaire à une concentration finale de 10 micromolaires. Resuspendez les cellules tachées de bleu de traqueur de cellules et transférez 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits des glissières préparées de chambre fibronectin-enduites.Incuber la chambre glisser à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes à une heure. Après cela, secouez doucement les glissières de chambre sur le microscope pour s’assurer que les cellules Raji sont respectées. Lavez chaque puits soigneusement avec le milieu chaud et complet de culture cellulaire pour éliminer l’excès de bleu de traqueur de cellules.Assurez-vous que les cellules Raji sont adhérentes au fond des plaques, et qu’elles présentent des lacunes entre elles et qu’elles ne sont pas confluentes. 50-60% de la confluence cellulaire est appropriée. Tout d’abord, ajouter Staphylococcal Enterotoxin E à une concentration d’un microgramme par millilitre à chaque puits.Assurez-vous que les cellules Raji sont pulsées avec superantigen sinon le récepteur des cellules T des cellules Jurkat ne reconnaîtra pas le SCE et synapse ne sera pas formé. Incuber la chambre glisser à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes. Ensuite, obtenez une culture précédemment croissante des cellules de Jurkat à une concentration comprise entre 1 et 2 millions de cellules par millimètre.Observez les cellules sous un microscope à contraste de phase, puis transférez les cellules dans un tube v-bottom de 15 millilitres. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement les cellules dans un milieu de culture chaud et complet à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.Ensuite, maintenir les cellules de Jurkat en culture à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Récupérez les diapositives de chambre contenant les cellules Raji de l’incubateur, étiquetées bleu staphylococcus Enterotoxin E. Aspirez soigneusement le milieu de culture de chaque puits un par un avec une pipette placée dans un coin du puits.Remplacez immédiatement le milieu par 200 microlitres des cellules de Jurkat résuspendées dans le milieu de culture cellulaire. Si un laps de temps est effectué, passez rapidement au microscope. Localisez la glissière chambée sur le serveur de mise en scène au microscope et sélectionnez quelques champs appropriés.Préparer le microscope et la chambre d’incubation avant l’imagerie. Après que les cellules de Jurkat ont été ajoutées à chaque puits contenant les cellules raji, localisez rapidement la glissière de chambre micro-gonflée sur l’incubateur mis en scène au microscope préchauffé et sélectionnez quelques positions XY. Si seulement une expérience de point de terminaison est prévue, incuber la glissière de chambre à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une à deux heures.Après la période de culture, vérifiez la formation conjuguée et réparez ensuite les conjugués tels qu’ils sont décrits dans le protocole du texte. Pour fixer les cellules, ajouter le RPMI chaud sans FCS et secouer doucement. Aspirez le RMPI et ajoutez 200 microlitres d’acétone PFA ou préchilled à chaque puits.Incuber la glissière de chambre à température ambiante ou sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, lavez chaque puits deux fois avec pvs et ajouter 200 microlitres de solution d’assaisons. Dans cette étude, des conjugués immunos synapse de Jurkat-Raji sont générés et les premiers stades de la formation immunologique de synapse sont correctement imités.Cette stratégie induit la formation immunologique de synapse tout en exécutant simultanément la formation image de laps de temps. Les conjugués synaptiques représentatifs Jurkat-Raji obtenus à partir de cette technique sont montrés ici, y compris une image du canal de transmission, du canal bleu de traqueur cellulaire, et ces deux canaux ont fusionné. Certains conjugués synaptiques peuvent être vus, y compris ceux composé d’une seule cellule Jurkat et plusieurs cellules Raji, qui sont des conjugués complexes.La diminution des concentrations cellulaires contournera la formation de conjugués cellulaires complexes, mais pourrait ne pas fournir suffisamment de conjugués cellulaires pour l’analyse subséquente du trafic polarisé, ce qui diminuera les chances de trouver et d’imager les conjugués synaptiques émergents. Une déconvolution des images du canal de fluorescence GFP-CD63 est effectuée avec un logiciel de déconvolution approprié utilisant l’option optique à champ large et les paramètres optiques appropriés. Ce canal déconterté a ensuite été fusionné au canal large bleu de traqueur cellulaire.Il y a une amélioration du rapport signal-bruit et de la netteté. Une pile Z représentative d’un conjugué synapse immunologique fixe est montrée ici. L’immunofluorescence est effectuée à l’aide de la phalloidine pour visualiser la F-actine, anti-CD63 pour visualiser le MVB, et anti-gamma-tubulin pour visualiser MTOC tandis que le traqueur cellulaire bleu étiqueté les cellules Raji.Le transfixage facultatif des cellules de Jurkat permettra la visualisation du trafic des granules sécrétaires dans les cellules vivantes. Par exemple, lorsque GFP-CD63 est exprimé, le mouvement des vésicules décorées GFP-CD63 peut être enregistré. Le protocole est compatible avec les protocoles de fixation des points de fin qui permettront d’autres protocoles et analyses de coloration de l’immunofluorescence.Il existe des modèles expérimentaux de productivité qui peuvent simplifier l’imagerie dans la synapse immunitaire, mais ces modèles n’imitent pas la surface complexe et irrégulière des cellules antigènes-présentateurs qui peuvent produire des interactions non physiologiques à la synapse immunitaire. L’approche décrite ici est appropriée pour reproduire et confirmer certaines complexités biologiques se produisant à la synapse immunisée. Superantigen est une toxine dangereuse alors s’il vous plaît assurez-vous de porter des gants, et laisser tomber la pointe utilisée sur la boîte dangereuse.

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Ici, nous montrons le protocole pour l'imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

Découvrez l'imagerie de la synapse immunologique humaine formée entre les cellules Raji et les lymphocytes T Jurkat. Cette méthode par microscopie à fluorescence permet d'observer la sécrétion polarisée et le trafic cellulaire en temps réel.

Imagerie de la synapse immunologique humaine

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