Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

L’objectif global de cette procédure est de visualiser des structures telles que l’actine F dans la synapse lytique des cellules NK à l’aide de la microscopie TED. Ceci est accompli en récapitulant d’abord la synapse sur du verre à l’aide d’un anticorps activateur. La deuxième étape de la procédure consiste à fixer le perme et à colorer les cellules pour les structures d’intérêt.

Ensuite, les lames sont imagées par microscopie confocale à balayage laser, suivie de l’application d’une déplétion stable pour une résolution d’image accrue. La dernière étape consiste à traiter les images à l’aide d’un algorithme de déconvolution. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une résolution inférieure à 100 nanomètres des structures cellulaires grâce à la double stabilité des couleurs et à l’endoscopie.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles qu’une relation entre le cytosquelette et l’exocytose. Dans notre cas, nous nous intéressons à la sécrétion de lysosomes spécialisés appelés granules lytiques par des cellules tueuses naturelles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il existe de multiples variables qui peuvent être ajustées dans l’application du laser d’appauvrissement TED.

Une application inappropriée du faisceau d’appauvrissement entraînera une aggravation au lieu d’une amélioration de la résolution En préparation, réchauffez 30 millilitres de support RPMI avec 10 % FCS et séparément. Un millilitre de BD CY fait monter les deux à 37 degrés Celsius. Commencez ensuite le processus d’enrobage des lamelles avec des anticorps.

Prenez les bordereaux de protection numéro 1,5 et utilisez un stylo PAP. Faites des carrés de la taille d’une pièce de dix cents sur les cailloutets. Préparez un carré pour chaque condition testée.

Chargez chaque cercle avec 200 microlitres d’anticorps à cinq microgrammes par millilitre en PBS. Pour l’activation des cellules NK 92, utilisez des anticorps anti CD 18 et anti NK P 30. Incuber les lamelles chargées à 37 degrés Celsius pendant une demi-heure, puis les laver avec un plongeon à température ambiante PBS procéder immédiatement à l’ajout des cellules pour chaque condition testée, 500 000 cellules doivent être prêtes à l’emploi.

Lavez les cellules dans 10 millilitres de milieu préchauffé, puis mettez-les en suspension dans le même milieu réchauffé. À 2,5 millions de cellules par millilitre avec les cellules complètement en suspension, décantez 200 microlitres dans chaque carré d’anticorps sur le couvercle Les feuillets incubent les feuillets avec des cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 dans ce cas. 20 minutes suffisent pour polariser les granules dans les cellules NK après le lavage d’incubation, la housse glisse doucement dans le PBS à température ambiante.

Commencez par ajouter un microlitre de TRITTON X 100 à un millilitre de solution chaude de cyto perm à effets BD CY. Puis vortex. Appliquez 200 microlitres de cette solution sur chaque carré d’état sur les lamelles.

Placez ensuite les cellules dans l’obscurité à température ambiante et attendez 10 minutes. Lorsque l’incubation est terminée, lavez délicatement les lamelles dans un tampon de coloration. Séchez ensuite les bords des régions environnantes avec un coton-tige.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de l’anticorps primaire dans un tampon de coloration aux régions environnantes et laissez les lamelles incuber dans l’obscurité pendant une demi-heure. Parmi les bons anticorps secondaires pour l’imagerie stable, citons Alexa floor 4, 88 Pacific orange et Horizon V 500. Chacun d’entre eux fonctionne bien à une dilution de un à 200.

Après le lavage de l’incubation, le couvercle glisse dans la teinture, tamponne et sèche les tampons. Comme précédemment, appliquez 200 microlitres de l’anticorps secondaire sur chaque carré de condition. Ensuite, laissez-les reposer dans l’obscurité pendant encore 30 minutes.

À ce stade, il est possible d’ajouter des anticorps supplémentaires après des lavages supplémentaires. Par exemple, Phin peut être appliqué à une valeur de un à 200 pour détecter l’actine f. Pour un support de montage, choisissez le prolong plutôt que le shield vectoriel, qui n’est pas compatible avec stead.

Si une coloration phin est utilisée, évitez d’utiliser deux deux thio éthanol alors que cependant est acceptable, appliquez maintenant 10 à 20 microlitres de support de montage sur une lame. Avec la lamelle de couverture inversée, abaissez-la doucement dans le fluide, en évitant les bulles d’air. Ensuite, incubez la lame pendant 24 heures.

Avec la couverture, glissez-la le lendemain, scellez la gaine avec du vernis à ongles et procédez à l’imagerie. Démarrez les lasers et le logiciel. Le laser d’épuisement stable doit se réchauffer à 100 % de puissance et être aligné.

À l’aide de l’oculaire, concentrez-vous sur l’échantillon, puis tournez-vous vers le logiciel. Scannez le premier canal, celui avec la longueur d’onde la plus longue. Au quatrième étage, optimisez la puissance du laser, la position du faisceau d’excitation et la portée du détecteur.

Évitez de régler au-dessus de 100. Ensuite, capturez une image confocale et vérifiez s’il y a des pixels. La saturation, la ligne et la moyenne d’image amélioreront toutes deux la résolution des pixels.

L’objectif est d’être inférieur à 30 nanomètres par pixel. Une certaine saturation est acceptable pour la place. Ensuite, appliquez le faisceau d’épuisement stationnaire à 50 % de puissance et capturez une image.

Si la résolution s’améliore, plus de puissance peut être appliquée. De plus, l’ajustement de la puissance du laser d’excitation ou de la moyenne de ligne ou du gain pourrait également améliorer la résolution. Pour réduire l’arrière-plan, appliquez 0,3 nanoseconde de contrôle temporel et ajustez vers le haut.

La nouvelle résolution doit être estimée à l’aide d’un calcul maximal de demi-largeur. Une fois satisfait, répétez ces étapes avec le deuxième canal lorsque tous les canaux sont modifiés. Vérifiez le chevauchement spectral en imageant des contrôles de coloration unique avec toutes les séquences de balayage.

Le logiciel peut corriger un léger chevauchement à l’aide d’un démixage spectral, mais il est préférable de l’éviter ou de le réduire au minimum. Maintenant, acquérez des images pour l’imagerie quantitative. Obtenir au moins 20 images par condition selon les conditions expérimentales.

Pour déléguer les images enregistrées, ouvrez les fichiers dans le logiciel approprié. Vérifiez les paramètres de chaque canal, en particulier les spectres d’excitation et d’admission, l’émission d’appauvrissement stable et la direction de l’imagerie. Appliquez ensuite les calculs de déconvolution du logiciel.

Les paramètres par défaut suffisent généralement, mais le rapport signal/bruit variera entre la force du sol, de sorte que ce paramètre doit être réglé manuellement pour l’expérience. Il existe quelques pièges courants qui peuvent conduire à une résolution sous-optimale avec fermeté. L’un d’entre eux est en cours d’échantillonnage.

Cela conduit à un grain et à une perte d’informations sur les pixels, comme dans ces filaments d’actine f. L’augmentation de la moyenne de la ligne ou de l’image résout souvent ce problème. Un autre problème est le blanchiment ou le suréchantillonnage causé par un pixel long.

Le temps de séjour, généralement dû à un décalage excessif des lignes avant l’acquisition de l’image, peut également être en cause et peut être corrigé à l’aide d’un balayage plus petit avant l’acquisition des images ou d’une vitesse de balayage plus élevée. Réduire la puissance du laser peut également aider à tout fonctionner. L’image s’améliorera considérablement.

La déconvolution améliorera encore plus l’image. Tant sur le plan quantitatif que qualitatif. Une résolution inférieure à 100 nanomètres doit être systématiquement obtenue lors de cette procédure.

Il est important de se rappeler d’effectuer l’alignement du faisceau stationnaire avant chaque expérience et environ une fois par heure par la suite après cette procédure. D’autres méthodes comme l’analyse quantitative peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la colocalisation, la localisation subcellulaire et les interactions moléculaires.