Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

Cette technique peut être utilisée pour générer des sphéroïdes cellulaires à partir de types de cellules individuelles et multiples à l’aide d’une plate-forme lab-on-a-CD, un système pionnier pour la génération rapide de sphéroïdes. La technique utilise la force centrifuge pour déposer les cellules dans des microwells désignés, permettant l’exaltation séquentielle de plusieurs types de cellules pour la production de divers sphéroïdes. Pour la fabrication de copeaux de culture CMS, faites d’abord des moules en polycarbonate pour les couches supérieures et inférieures de la puce de culture par usinage numérique de commande d’ordinateur.

Mélanger ensuite la base PDMS et l’agent curatif PDMS à un rapport de 10 pour un pendant cinq minutes avant de placer le mélange dans un dessiccateur pendant une heure pour enlever les bulles d’air. Verser le mélange PDMS dégazé dans les moules à copeaux de culture CMS, et placer les moules dans le dessiccator pendant une heure de plus pour enlever les bulles d’air. À la fin du deuxième dégazage, guérir le mélange dans une chambre chauffante à 80 degrés Celsius pendant deux heures avant de placer les copeaux dans un aspirateur plasma avec les surfaces à collé face vers le haut.

Exposez les puces de culture au plasma assisté par air à une puissance de 18 watts pendant 30 secondes, et lier les deux couches de la puce dans la chambre de chaleur à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes pour augmenter la force d’adhérence. Ensuite, stérilisez la puce de culture CMS dans un autoclave à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour préparer les cellules à la formation de sphéroïdes, décongeler un flacon d’un millilitre contenant cinq à dix fois 10 aux cinq cellules d’intérêt dans un bain d’eau de 36,5 degrés Celsius pendant deux minutes avant d’ajouter un millilitre de DMEM aux cellules avec un mélange doux.

Ajoutez ensuite les cellules à une boîte petri de 150 millimètres de diamètre contenant 15 millilitres de milieu de 36,5 degrés Celsius, et placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez le supernatant par 15 millilitres de DMEM frais et retournez les cellules à l’incubateur. Pour détacher les cellules, créer la culture avec quatre millilitres de trypsine pendant quatre minutes à 36,5 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, arrêter la réaction avec un milieu frais lorsque les cellules se sont levées du fond du plat.

Pour étiqueter les cellules, réchauffer un colorant de fluorescence cellulaire approprié à température ambiante avant d’ajouter 20 microlitres de sulfure de diméthyle anhydre au flacon pour obtenir une solution millimolaire. Diluer la fluorescence à une concentration de travail finale d’un micromolaire dans le DMEM, et ajouter le colorant à la suspension cellulaire d’intérêt avec mélange doux. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 20 minutes.

Pour la formation de sphéroïdes en monoculture, ajoutez d’abord 2,5 millilitres de solution F-127 pluronique de 4 % au trou d’entrée de la puce de culture CMS tout en faisant pivoter la puce à 500 à 1 000 rotations par minute. Quand toute la solution a été ajoutée, faites pivoter la puce à 4000 rotations par minute pendant trois minutes à l’aide du système CMS. À la fin de la rotation, incuber la puce de culture pendant la nuit à 36,5 degrés Celsius à 5% de dioxyde de carbone.

Le lendemain matin, retirez la solution pluronique et lavez la puce de culture avec du DMEM. Après avoir sécher la puce pendant 12 heures sur un banc propre, ajouter 2,5 millilitres du milieu au port d’entrée, et faire pivoter la puce à 4000 rotations par minute pendant trois minutes. À la fin de la rotation, remplacer 100 microlitres du milieu dans le port d’entrée par 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute.

Puis faites pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant trois minutes pour piéger les cellules de chaque microwell par force centrifuge avant de placer la puce dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours, rafraichissant le milieu comme démontré tous les jours. Pour la généra tion de coculture sphéroïde concentrique, ajoutez la première population de cellules dans 100 microlitres de milieu au port d’entrée de la puce pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivie de trois minutes de rotation à 3000 rotations par minute. À la fin de la rotation, ajouter 100 microlitres de la population de la deuxième cellule pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute, et faire pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant encore trois minutes.

Quand les deux volumes de cellules ont été injectés, placez la puce dans l’incubateur de culture cellulaire à 1000 à 2000 rotations par minute pendant 24 heures. Pour la formation sphéroïde de Janus, ajouter 100 microlitres de la première population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivie de trois minutes à 3000 rotations par minute. À la fin de la rotation, placez la puce dans l’incubateur de culture cellulaire pour une rotation de 1000 à 2000 rotations par minute pendant trois heures.

À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres de la deuxième population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute avant de faire pivoter la puce à 3000 rotations par minute pendant trois minutes. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 1000 à 2000 rotations par minute pendant 24 heures. Pour la formation de sphéroïdes sandwich, ajoutez d’abord 100 microlitres de la première population cellulaire pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute suivies de trois minutes de rotation à 3000 rotations par minute.

À la fin de la rotation, placez la puce sur un rotateur dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures à 1000 à 2000 rotations par minute avant d’ajouter 100 microlitres de la deuxième population de cellules pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute. Faites pivoter la puce à 3000 RPM pendant trois minutes, et placez la puce dans l’incubateur pour une incubation de trois heures avec rotation. Ajoutez ensuite 100 microlitres supplémentaires de la première population cellulaire pendant que la puce tourne à 500 à 1000 rotations par minute, et faites pivoter et culturer les cellules comme cela vient de le démontrer pendant 12 heures.

Suivant le protocole tel que démontré, une puce de culture CMS de six centimètres de diamètre peut être fabriquée avec succès. Le chenal de la puce de culture CMS comprend un port d’entrée, et des régions centrales, slide et microwell. Les images en accéléré de deux types de culture cellulaire prises à 2000 rotations par minute pendant les 24 premières heures de culture au sein des puces CMS individuelles, comme démontré, montrent la formation réussie de sphéroïdes.

L’imagerie des microwells après trois jours de culture montre que les sphéroïdes démontrent une excellente uniformité et sphérique. Des sphéroïdes cocultureux avec des structures conentriques, janus et sandwichs peuvent également être générés. En outre, les cultures cellulaires exposées à une gravité élevée pendant sept jours, suivies de taches vivantes ou mortes, démontrent que la plupart des cellules survivent à la culture à long terme dans les puces.

Les couches supérieures et inférieures de la puce de culture CMS doivent être soigneusement alignées lorsqu’elles sont collées, sinon le nombre de cellules dans chaque microwell peut ne pas être égal. Cette étude peut abaisser la barrière d’entrée pour la recherche sphéroïde de coculture et peut être employée couramment dans des études de coculture, par exemple, pour criblage de nouveaux drogues d’intérêt.