Suivi des cellules souches mésenchymales étiquetées à l'oxyde de fer superparamagnetic à l'aide de l'IRM après la livraison intranasale dans un modèle de murine traumatique de lésions cérébrales

Présenté ici est un protocole pour la livraison non-invasive de cellules souches mésenchymales (MSC) et le suivi dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques. Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic sont employées comme sonde d'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour l'étiquetage mSC et le suivi in vivo non invasif suivant la livraison intranasale utilisant l'IRM en temps réel.

Cette méthode peut aider à déterminer la distribution de base de la cellule souche lobitique après l’accouchement intranasal au cerveau. Le principal avantage de cette technique est que facilite la livraison non invasive et le suivi des cellules souches mésenchymales au cerveau. En outre, les dosages multiples sont possibles pour maximiser les effets thérapeutiques des cellules transplantées au stade chronique après les blessures.

Cette technique maximise le nombre de cellules livrées au site de la blessure et minimise la progression de la cellule lobitique dans d’autres tissus. Bien que cette technique donne un aperçu de l’utilisation des cellules souches mésenchymales dans les thérapies traumatiques de lésion cérébrale, elle peut également être employée pour l’investigation des dommages non traumatiques de cerveau. Pour l’étiquetage des cellules souches mésenchymales avec l’oxyde de fer super paramagnetic, ajouter six millilitres d’étiquetage moyen à une culture mésenchymale de cellules souches 80% confluent dans un flacon T 75 pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Le lendemain, aspirez soigneusement le super natant et lavez les cellules deux fois avec six millilitres de PBS par lavage. Pour déterminer si les cellules ont été étiquetées avec succès, vérifiez la culture au microscope florescent. Pour induire une blessure à l’ICC, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, utilisez des tondeuses électroniques pour raser la fourrure de la surface dorsale du crâne et nettoyez la zone rasée à plusieurs reprises avec un coton-tige stérile trempé dans de l’iode.

Utilisez un coton-tige trempé dans 70% d’éthanol pour enlever l’iode après le dernier écouvillon et placer l’animal dans un cadre stéréotaxique. Fixez la souris avec les barres d’oreille et de nez et faites une incision midsagittal de 2,5 centimètres dans la peau rasée pour accéder à la surface du crâne. Utilisez un tampon de coton pour enlever le tissu qui recouvre le crâne et nettoyer la surface du crâne pendant 10 secondes avec un coton-tige imbibé de peroxyde d’hydrogène à 3 %.

Séchez le crâne avec un tampon de coton frais et utilisez un crayon pour dessiner un cercle de quatre millimètres autour des coordonnées de choix sur l’os exposé. À l’aide d’une micro foreuse équipée d’un bur rond de 0,5 millimètre de diamètre, éclaircissez soigneusement le crâne au cercle marqué sans exercer de pression. Enlevez toute poussière osseuse à l’l’huile de coton propre et sèche et utilisez des forceps stériles déposés pour enlever soigneusement le rabat d’os qui en résulte.

Lorsque le dura mater a été exposé, transférez la souris dans le cadre stéréotaxique de l’appareil CCI et fixez l’animal avec les barres de l’oreille et du nez de sorte que la tête soit de niveau dans la direction rostrocaudal. Suivant les instructions sur la boîte de commande, zéro la pointe de l’impacteur à la surface corticale exposée à l’aide des roues de commande X et Y sur la base de l’impacteur pour aligner la pointe de l’impacteur directement au-dessus des coordonnées du cortex désirées à impacter. Utilisez la boîte de commande pour définir les paramètres de l’expérience à une vitesse de cinq mètres par seconde, un temps de vie de 250 millisecondes, et une profondeur de blessure d’un millimètre pour induire une blessure légère.

Ensuite, appuyez sur le bouton d’impact sur la boîte de commande. Écouvillonner tout saignement qui se produit avec un coton-tige stérile et retirer la souris du cadre. Fermez l’incision avec des sutures chirurgicales en soie et appliquez des antibiotiques topiques sur le site avant de placer la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit pleine.

Un jour après la blessure, traiter l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté culture mésenchymale de cellules souches avec trois millilitres de trypsine. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, commencer la réaction avec sept millilitres de milieu DMEM préchauffé, complété par 10% sérum bovin fœtal et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans PBS pour le comptage.

Ensuite, ajustez la concentration cellulaire à 1,5 fois 10 aux cinq cellules par 18 microlitres de PBS. Pour l’accouchement cellulaire, après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement des orteils, débrailler la souris tout en immobilisant le crâne. Placez la pointe d’une pipette contenant quatre unités d’hyaluronidase par microlitre de PBS près de la nare de la souris à un angle de 45 degrés, et administrez trois microlitres de suspension hyaluronidase dans chaque narine.

Placez l’animal face vers le haut sur un tampon propre pendant cinq minutes avant de répéter le traitement quatre fois pour un total de 100 unités de traitement hyaluronidase. Après le dernier traitement, remettre la souris sur le coussin pendant 30 minutes, avant de retenir la souris comme il vient de le démontrer. Une fois la tête immobilisée, administrer trois microlitres de la suspension mésenchymale des cellules souches dans chaque narine sur une période de trois secondes par livraison de solution, en maintenant la souris en position pendant 30 secondes jusqu’à ce que les gouttes de l’échantillon aient complètement disparu.

Après deux minutes, répéter l’accouchement jusqu’à trois fois jusqu’à ce que tout le volume de cellules souches mésenchymiques ait été livré. Ensuite, retournez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence. Pour suivre la migration des cellules souches mésenchymales par IRM, placez la souris anesthésiée sur le support d’imagerie de l’imageur MR.

Ensuite, fixez l’animal en place et déplacez le support au centre de la bobine d’IRM. Réglez le temps de répétition à 1500 millisecondes et le temps d’écho à 2,8 millisecondes. Ensuite, réglez le champ de vision à 16 par 16 millimètres, la matrice d’acquisition à 128 par 128, et l’épaisseur de la tranche à 0,75 par 0,8 millimètres avec quatre moyennes de signal et un angle de retournement de 90 degrés pour acquérir des scans pondérés T2 étoiles à l’aide d’une séquence d’écho spin.

Après avoir terminé les scans, rétractez le porte-souris du centre de bobine d’IRM, et retournez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence. Pour suivre et quantifier les cellules souches mésenchymales étiquetées sur les images pondérées de l’étoile T2, ouvrez les données du logiciel de prise de cas informatique et sélectionnez l’étiquette active. Pour créer des segmentations des zones hypointense et la lésion ou d’autres parties du cerveau d’intérêt, en utilisant différentes couleurs d’étiquette pour chaque segment.

Utilisez l’outil polygone dans la barre d’outils principale pour sélectionner les zones hypointense qui représentent l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté cellules souches mésenchymales et cliquez sur accepter. Les zones segmentées apparaîtront dans la même couleur que l’étiquette active attribuée à ce segment particulier. Lorsque toutes les tranches ont été segmentées, utilisez l’outil scalpel pour développer une carte 3D des zones segmentées pour représenter la distribution des cellules souches mésenchymales dans l’ensemble du cerveau.

Effectuer une analyse quantitative de la moyenne de volume et d’intensité des zones hypointense segmentées représentant les cellules étiquetées, cliquez sur segmentation et sélectionnez le volume et les statistiques. 24 heures après la livraison intranasale, l’oxyde de fer super paramagnetic étiqueté cellules souches mésenchymales sont détectés comme zones hypointense forte médial à la lésion corticale sur les images pondérées étoiles T2, indiquant la migration ciblée de l’oxyde de fer super paramagnetic au site de blessure. Cette migration reste visible jusqu’à 14 jours après la livraison sans aucune réduction notable du signal.

Les animaux blessés traités par PBS n’présentent pas de zones hypointense à aucun moment, ce qui indique que les zones hypointense observées correspondent aux super oxydes de fer paramagnetiques étiquetés cellules souches mésenchymales, et ne sont pas dues à des artefacts de signal. La bio-distribution des cellules souches mésenchymales étiquetées peut être visualisée à l’aide de la reconstruction 3D, histologiquement par coloration bleue prussienne, ou par détection de florescence de l’oxyde de fer super paramagnetic marqué FITC dans les cellules souches mésenchymales étiquetées. Assurez-vous de valider les résultats de l’IRM avec de l’esthologie ou d’autres méthodes.

Comme les particules d’oxyde de fer super magnétique peuvent rester dans les tissus après la mort de la cellule, conduisant à de faux signaux positifs. À la suite de cette procédure, un suivi non invasif possible de la quantification peut être appliqué pour répondre aux questions concernant l’affûtage des capacités et la rétention des cellules souches mésenchymales dans le cerveau. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie pour les chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative à explorer des méthodes pour améliorer le perfectionnement cellulaire à des zones spécifiques du cerveau.