Analyse des molécules complexes et de leurs réactions sur les surfaces au moyen de la desorption induite par les grappes/spectrométrie de masse d’ionisation
1 mars 2020
Desamas neutres d’énergie cinétique (lt; 0,8 eV/constituant) sont utilisés pour desorbiser des molécules de surface complexes telles que les peptides ou les lipides pour une analyse plus approfondie au moyen de la spectrométrie de masse à l’aide d’un spectromètre de masse de piège à ions. Aucune préparation spéciale de l’échantillon n’est requise, et une observation en temps réel des réactions est possible.
L’ionisation desorption induite par des clusters SO2 neutres que nous appelons en bref DINeC, est une méthode d’ionisation de désorption douce et efficace. Nous l’utilisons entre autres pour la spectrométrie de masse des biomolécules, comme les peptides et les protéines. Comme DINeC, molécules de désorption intactes à partir des surfaces de l’échantillon, des changements chimiques subtils dans ces molécules sont facilement détectés dans les spectres de masse.
Le processus est illustré dans la simulation suivante. Les amas entrants se brisent à travers l’impact de surface de l’amas. Le dipeptide isotopique de surface est dissous dans l’un des fragments de grappes et désorpté par ce processus.
Dans l’expérience, le faisceau de grappes de SO2 est produit par expansion supersonique à partir d’une buse pulsée. Les molécules dissoutes et ionisées lors de l’impact de surface de l’amas sont transférées dans le piège ipéraux pour la spectrométrie de masse. Les spectres de masse typiques ne montrent que des pics aux valeurs définies mo de la molécule intacte.
Karolin Bomhardt et Pascal Schneider, deux doctorants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour les échantillons standard, couper les substrats des plaquettes de silicium d’une épaisseur d’environ 0,5 à un millimètre en morceaux d’un par un centimètre carré. Nettoyez les substrats de silicium dans un bain à ultrasons d’éthanol et d’acétone pendant 15 minutes chacun.
Sécher les substrats dans un flux de gaz azoté sec. Ensuite, déposer jeté cinq à 30 microlitres de la solution de l’échantillon sur le substrat. Selon la pression de vapeur du solvant, laissez sécher l’échantillon dans des conditions ambiantes ou dans un dessiccateur jusqu’à ce que tout solvant ait été évaporé et qu’un film sec ait été formé.
Considérez le schéma de préparation le plus simple. À titre d’exemple, pour l’étude de l’encre surligneur, il suffit de dessiner un point sur la surface du substrat. Montez les échantillons sur le porte-échantillon avec du ruban adhésif ou des pinces serrées par des vis.
En outre monter un échantillon de référence comme un film micromètre épais de l’angiotensine II sur le porte-échantillon. Ensuite, appuyez sur le verrou de charge d’évent pour évacuer le système de verrouillage de charge. Attendez cinq minutes, ou jusqu’à ce que la pression atmosphérique ait été atteinte.
Ouvrez le verrou de charge et montez le support de l’échantillon. Fermez le verrou de charge et pompez la chambre de verrouillage de charge à une pression inférieure à deux fois 10 à la barre négative de cinq millibar. Ouvrez la vanne à la chambre DINeC et transférez le porte-échantillon avec la tige de transfert au manipulateur principal.
Attachez le porte-échantillon au manipulateur. Rétractez la tige de transfert et fermez la vanne entre le verrou de chargement et la chambre DINeC. Ouvrez la vanne entre la bouteille de gaz et la buse.
Réglez la pression du mélange de dioxyde de soufre et de gaz d’hélium au contour du système de mélange de gaz à 15 barres. Définissez la position du manipulateur à la position de l’échantillon de référence. Pour mesurer les spectres de masse cationiques, réglez l’échantillon et le biais de grille à plus de 40 volts, et plus sept volts respectivement.
Pour conduire la buse pulsée et le spectromètre de masse de piège à ion, réglez le générateur de fonction externe à deux Hertz. Avec le générateur de retard, réglez le délai entre le signal de piégeage clair du piège à ion et le signal de déclenchement de la buse pulsée à cinq millisecondes. Dans le logiciel de contrôle Bruker, dans la page Mode de la fenêtre de dialogue principale, sélectionnez Résolution améliorée pour le mode Scan.
Tapez en M plus de Z 50 à 3000 pour la plage, tapez en 0,1 milliseconde pour le temps d’accumulation, tapez dans 10 cycles pour la moyenne, et pour la polarité, sélectionnez positif pour la mesure des spectres de masse cationiques et négatif pour la mesure des spectres anioniques. Une fois qu’une pression inférieure à trois fois 10 à la barre négative de six millibar a été atteinte dans la chambre DINeC, commencez la mesure. Réglez la valeur M sur Z à la masse respective afin de suivre le signal chromatogramme dépendant du temps.
Appuyez sur Operate dans le logiciel de contrôle. Commencez à enregistrer les mesures en appuyant sur le bouton Enregistrer. Mesurez le spectre d’essai à partir d’un échantillon de référence, comme l’angiotensine II pendant environ 300 secondes.
Optimisez l’intensité du signal en ad réglage du délai entre le signal de piégeage clair et le signal déclenchant la buse pulsée. Avec le délai optimisé, déplacez le manipulateur à la position de l’échantillon à mesurer. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour acquérir des spectres de masse au cours de la période d’intérêt.
Une fois la mesure terminée, chargez l’ensemble de données respectif dans le programme d’analyse des données tel qu’indiqué ici pour la mesure de référence. Sélectionnez la durée d’intérêt pour le chromatogramme avec le bouton droit de la souris. Le spectre moyen est affiché dans une fenêtre séparée.
Cliquez sur Export comme fichier ASCII pour exporter le spectre comme fichier de données pour un traitement ultérieur dans un programme de choix. Le spectre de masse DINeC d’un échantillon d’Angiotensine II a changé avec le temps, car l’échantillon a été chauffé à environ 140 degrés Celsius. Une fois que la température a atteint la valeur finale, le pic de la molécule protinée attaquée à M au-dessus de Z égalant 1047 a chuté et de nouveaux pics ont été observés.
Le processus est résumé dans ces trois graphiques. Les pics additionnels à M au-dessus de Z, soit 932, 1012 et 1029, ont été bien observés. L’analyse de la cinétique de réaction démontre que l’entité avec M au-dessus de Z égalant 1029 est un intermédiaire qui a été encore décomposé en fragments plus petits pendant que l’intensité augmentait d’abord, puis diminuait.
Les caractéristiques les plus importantes de DINeC sont la nature douce du processus de désorption, l’efficacité et la sensibilité élevée à la surface. Ils s’allient tous aux faibles exigences en ce qui concerne la préparation des échantillons. DiNeC peut donc être appliqué à une grande variété d’échantillons différents allant des matériaux organiques d’écorce aux adsorbates de surface complexes dans la région de sous-monocouche.
Dans tous les cas, des informations chimiques complètes peuvent être obtenues en temps réel.
Aperçu
Cette étude présente une nouvelle méthode d'ionisation par désorption utilisant des agrégats neutres de SO2, appelée DINeC, pour l'analyse par spectrométrie de masse de biomolécules. La technique permet l'observation en temps réel des modifications chimiques des peptides et des protéines sans préparation intensive de l'échantillon.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectrométrie de masse
- Analyse biomoléculaire
- Chimie de surface
Contexte
- DINeC est une méthode d'ionisation par désorption douce.
- Elle permet l'analyse de molécules complexes en surface.
- La surveillance en temps réel des réactions est possible.
- Une préparation minimale de l'échantillon est requise.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'efficacité de DINeC pour la spectrométrie de masse.
- Analyser les changements chimiques subtils dans les biomolécules.
- Fournir un protocole détaillé pour la préparation des échantillons et les mesures.
Méthodes utilisées
- Production d'agrégats de SO2 par détente supersonique.
- Désorption de molécules par impact sur la surface de l'agrégat.
- Transfert des molécules ionisées vers un spectromètre de masse à piège d'ions.
- Acquisition et analyse en temps réel des spectres de masse.
Résultats principaux
- Les spectres de masse montrent des pics moléculaires intacts.
- De nouveaux pics apparaissent lorsque la température augmente pendant l'analyse.
- La cinétique de la réaction révèle la formation d'espèces intermédiaires.
- DINeC démontre une grande sensibilité de surface et une efficacité élevée.
Conclusions
- DINeC est une méthode polyvalente applicable à divers échantillons.
- Elle fournit des informations chimiques complètes en temps réel.
- La faible préparation des échantillons requise par la méthode accroît son utilité.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
DINeC permet une désorption/ionisation douce et sans matrice de biomolécules complexes à partir de surfaces, soutenant la surveillance en temps réel de modifications chimiques sans préparation intensive des échantillons. Cette capacité améliore la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce, en fournissant des spectres de masse quantitatifs et sans fragmentation de peptides et de protéines avec une sensibilité inférieure à une monocouche. La compatibilité de la méthode avec la spectrométrie de masse en trappe ionique MSn permet une élucidation structurale détaillée, renforçant la confiance prédictive dans l'identification des candidats médicaments et les flux de travail précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en détectant les ions moléculaires intacts et les modifications chimiques subtiles des peptides et des protéines.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à une désorption douce qui préserve les modifications labiles, réduisant ainsi les faux négatifs dans les études d'engagement du ou des cibles.
- Valeur prédictive : Fournit des données quantitatives de recouvrement de surface jusqu'à 0,1 % d'une monocouche, aidant à la sélection de portefeuille en fonction de l'abondance de la cible et de son état de modification.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des spectres de masse quantitatifs exempts de matrice, permettant une détection fiable d'analytes liés à la surface sans suppression de l'ionisation.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des dosages grâce à une génération constante de faisceaux d'agrégats et un transfert reproductible vers le piège à ions, réduisant ainsi la variabilité entre les analyses.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme sur divers types d'échantillons, allant des extraits organiques à des surfaces conçues, soutenant une préparation à l'analyse à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet l'observation en temps réel de réactions à la surface, telles que l'échange H/D ou la décomposition thermique, permettant ainsi une analyse cinétique de la stabilité des biomolécules.
- Continuité translationnelle : Relie les phases de découverte et préclinique en fournissant des informations chimiques continues, allant des adsorbats de surface aux molécules en volume, dans des conditions analytiques identiques.
- Décisions pondérées selon le risque : Appuie les critères de poursuite ou d'abandon en identifiant les intermédiaires de dégradation et les voies réactionnelles susceptibles d'affecter la stabilité ou l'efficacité d'un candidat-médicament.
Intégration des pipelines et des flux de travail
DINeC s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés actifs et l'évaluation préclinique, en particulier pour les études nécessitant une surveillance en temps réel et sensible à la surface des interactions ou modifications biomoléculaires.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en détectant les modifications post-traductionnelles et les changements conformationnels induits par les ligands sur les surfaces.
- Écrans de sélection : Permet la mise en place d'essais grâce à la désorption reproductible de molécules intactes, fournissant des résultats quantitatifs pour la confirmation des hits et l'établissement de relations structure-activité.
- Analytique : Fournit des spectres de masse haute résolution et des capacités de MSn qui permettent aux équipes de comparer les états moléculaires, les sites de modification et les profils de fragmentation selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la validation préclinique en surveillant les modifications chimiques dépendantes du temps dans les peptides et les protéines soumis à un stress thermique ou chimique contrôlé.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité analytique réutilisable à travers différents départements, réduisant ainsi les développements redondants de méthodes et permettant une cohérence des données entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en préservant l'intégrité moléculaire et en permettant la détection d'espèces instables pouvant être perdues lors de méthodes d'ionisation plus agressives.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des paramètres normalisés du faisceau de clusters et une manipulation minimale des échantillons, réduisant ainsi la variance technique.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en supprimant le besoin de matrice et en permettant l'analyse directe d'échantillons natifs, réduisant les coûts en consommables et le temps de préparation.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque grâce à des données cinétiques en temps réel sur les réactions en surface, facilitant l'identification précoce des points de fragilité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génération de faisceaux de clusters, en fonctionnement de piège à ions et en principes de science des surfaces pour une configuration optimale et une interprétation correcte des données.
- Exige un accès à un système d'injecteur pulsé, à des infrastructures de manipulation du dioxyde de soufre et de l'hélium, ainsi qu'à un spectromètre de masse à piège à ions compatible doté de capacités MSn.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de montage des échantillons, de nettoyage des substrats et de séchage, afin d'assurer une homogénéité de surface et une efficacité de désorption reproductible.
- Implique des adaptations lors du passage de peptides modèles à des échantillons natifs complexes ou à des surfaces hétérogènes, nécessitant une optimisation de la couverture de surface.
- Comprend des limites pratiques telles que la nécessité de conditions de vide ultrahaut et les effets potentiels de fragmentation des clusters à des énergies d'impact plus élevées, qui doivent être maîtrisés afin de préserver une désorption douce.
