Name: Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez la spectrométrie de masse native pour analyser les complexes protéiques et les interactions ligand-protéine. Cette méthode rapide et sensible permet d'étudier les assemblages macromoléculaires dans leur état natif.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous tenons à remercier Karl-Peter Hopfner et Robert Thomas Byrne pour gentiment échantillons de protéines fournissant HerA et HerA-NurA et pour leur aide à la conception expérimentale. Nous remercions également m. Eamonn Reading pour son examen du manuscrit. Nous remercions sincèrement nos organismes de financement : Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] et la Royal Society [RG150216 à A.P.].

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

MS joue un rôle de plus en plus important pour caractériser la stoechiométrie, les interactions et les architecture de sous-unité de complexes protéiques. IM-MS données peuvent servir à définir les modalités topologiques des sous-unités dans plusieurs composants complexes. Par rapport aux autres méthodes existantes de la biologie structurale, MS a plusieurs avantages. Native MS est une technique rapide et hautement sensible et peut être utilisée pour sonder les échantillons de protéines hétérogènes. Lorsqu’il est couplé avec des expériences de perturbation dans la solution, les voies de dissociation des ensembles de protéines peuvent être surveillés. Ainsi que des structures cristallines ou modèles d’homologie, l’information offerte par Mme structurelles offre un outil pour l’étude des interactions protéine-ligand et fournir des modèles quasi native et Assemblée voies11.
Nous décrivons ici les procédures expérimentales nécessaires pour analyser la stoechiométrie et la composition des interactions de protéine-ligand, avec un ou plusieurs ligands, à l’aide de MS intégrative. Cela comprend la préparation de l’échantillon MS, acquisition de données, analyse de données et l’intégration de données de MS à l’aide d’outils informatiques. Pour ce faire, nous avons utilisé l’ADN-résection HerA-NurA hétéro-oligomériques protéine complexe, lié aux trois ligands (ADN, l’ATP et ADP), que notre système de modèle. Le protocole montre l’utilisation du logiciel actuellement disponible pour faciliter la présentation et l’analyse des données.
Acquisition des spectres de haute qualité est important pour l’analyse de liaison de ligand, étapes de préparation d’échantillon prudent sont critiques, y compris purification de protéine, titrage de ligand et l’échange de mémoire tampon. Une des limitations de nESI native MS lorsque l'on étudie la liaison du ligand est non-spécifiques. Liaison non spécifique se produit au cours de la gouttelette désolvatation durant tout le processus electrospray. Cela augmente la concentration de ligand et modifie donc le ratio de protéine/Ligand29. La liaison des nucléotides se traduit par une différence de masse relativement faible entre apo et nucléotide lié aux protéines qui n’altère pas l’ionisation efficacité50,51.
Nous avons utilisé le système Synapt G2-Si SM pour notre travail, mais les protocoles sont applicables à différentes investigations d’autres complexes de protéine-ligand à l’aide d’autres spectromètres de masse de nano-electrospray disponibles dans le commerce. Intégration structurale MS plus en plus joue un rôle important dans la lutte contre les problèmes biologiques d’une plus grande complexité. Le flux de travail et les techniques décrites ici sont bien adaptées pour comprendre les conséquences structurelles et construire des mécanismes du complexe protéique et de la formation de la protéine-ligand, qui sont par ailleurs difficiles à étudier à l’aide de techniques structurelles classiques .

Native analyse par spectrométrie de masse des protéines intactes et leurs complexes se fait avec l’électrospray et nano-electrospray ionisation (nESI), qui conservent le repliement des protéines et des interactions non covalentes pendant le processus d’ionisation de1, 2. Dans native MS, la structure des protéines et leurs complexes sont conservées dans un état quasi native dans la phase gazeuse3,4. Native MS détecte plusieurs ions chargés de protéines, qui sont séparées selon leur masse pour charger le ratio (m/z) permettant à la masse de la protéine ou protéine-ligand complexe à calculer. Cette information permet la détermination d’une protéine intacte stoechiométrie, la composition, liaison du ligand et interaction réseaux3,4,5,6. Native MS présente plusieurs avantages par rapport à d’autres techniques telles de spectroscopie résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons x5. Tout d’abord, native MS est une technique rapide et hautement sensible, nécessitant seulement quelques microlitres (2-3 µL) de l’échantillon à des concentrations relativement faibles de complexes finales nm haute et basse µM rang6. Deuxièmement, native MS peut être utilisée pour interroger les échantillons de protéines hétérogènes ce qui permet d’analyser plusieurs protéines et oligomères États simultanément. Troisièmement, native MS ne nécessite pas d’échantillons de protéines pour être modifiés avant l’analyse par réticulation chimique ou marquage des protéines. Ces avantages ont fait MS structurelles un outil puissant pour l’étude structurale des complexes protéiques.
Native MS est cumulable avec la mobilité de l’ion (IM), une technique qui mesure le temps de qu'un ion de protéine prend de voyager à travers un champ électrique, permettant à la section efficace de collision (CCS) à déterminer. Le CCS renseigne basse résolution structurale, qui permet la topologie et les informations d’hétérogénéité conformationnelle des protéines qui doivent être obtenus. En outre, il permet l’examen des modèles structuraux de protéine produite par approches computationnelles.
Stabilité de phase gazeuse des protéines peut être étudiée à l’aide de collision induite déplier (CIU) mesurée par IM-SM. Au cours du processus CIU, ions de protéine sont accélérées et activées par le biais des collisions accélération accrues avec un gaz inerte tampon dans un spectromètre de masse de8,7,9. Ce processus d’activation par collision provoque la protéine se dérouler partiellement, qui se traduit par une augmentation du CCS. Ce changement de CCS et l’énergie nécessaire pour déplier la protéine peut être mesurée à l’aide de l’IM-Mme cette approche, l’effet de la liaison du ligand sur la stabilité des protéines peut être mesuré10. Subcomplexes peuvent être générés en solution en utilisant des méthodes de perturbation dans la solution telle que l’ajout de solvants organiques pour surveiller des topologies de type natif de complexes protéiques. Perturbation des complexes de protéine est principalement dû à la rupture des interactions non-covalentes intra. Les complexes sous maintiennent des topologies de type natif et, en cas de détection de MS, révèlent des informations sur la sous-unité inter connectivité.
Des approches intégratives en biologie structurale combinent diverses méthodes pour étudier la structure et la dynamique des protéines et leurs complexes3,4,5,6. Natif de MS et d’IM-MS ont été utilisés pour découvrir les détails moléculaires des systèmes biologiques difficiles. Il y a eu plusieurs exemples d’applications, y compris l’étude de la protéine Assemblée voies11,12,13,14, étudie l’interaction de protéine-protéine réseaux15 , 16 , 17, membrane protéines6,18,19,20,21et interactions de protéine-ligand comme les acides nucléiques22,23 ,,24.
Cependant, native MS a aussi ses limites. Native MS mesures sont souvent effectuées dans des tampons volatils tels que l’acétate d’ammonium aqueux dans lequel certaines protéines ne conservera pas leur état natif plié3,25. Néanmoins, les travaux récents ont montré que cette limitation peut être surmontée par l’optimisation de pulvérisation diamètre de pointe de l’aiguille (pointes de 0,5 mm), telle que la protéine et protéine ions complexes peuvent être formées directement à partir de tampons non volatile avec force ionique élevée que mieux imiter l' environnement physiologique26. En outre, native MS utilise electrospray pour ioniser et transférer des assemblys non covalents de solution dans la phase gazeuse ; par conséquent, l’abondance relative des complexes détectés ne peut-être entièrement représenter qui en solution5,27. Par ailleurs, en comparaison à en solution, les interactions hydrophobes de phase gaz deviennent plus faibles et les interactions électrostatiques deviennent plus fortes et donc favorisé3,28.
Dans cet article, nous fournissons des protocoles, l’analyse des données et interprétation pour l’identification de protéines et de ligand binding utilisant native MS, IM-MS, CIU, perturbation dans la solution et la modélisation. Le complexe de réparation d’ADN, HerA-NurA, est utilisé comme système modèle. Cassures double-brin d’ADN (CDB) sont une des formes plus cytotoxiques et délétères de dommages à l’ADN, ce qui entraîne une instabilité génétique et le développement ultérieur du cancer chez les humains. La recombinaison homologue est le mécanisme de réparation qui éradique la CDB, un processus qui est orchestrée par l’ATP dépendante helicase-nucléase complexe, HerA-NurA22.
Combinant native MS et IM-MS avec tests fonctionnels et de modélisation a permis à l’enquête de : i) le rôle de NurA dans l’Assemblée, conformation et la stabilité de l’immeuble, ii) l’interaction entre l’ADN double brin et le complexe et son influence sur l’ensemble stabilité de l’immeuble et iii) la stoechiométrie et l’impact de liaison de l’ATP sur l’Assemblée22. Dans l’ensemble, ce travail a conduit à une meilleure compréhension de la base moléculaire du complexe HerA-NurA en liant les changements conformationnels complexes protéiques et la stabilité avec la liaison de nucléotides. Ce protocole est générique pour n’importe quel complex(es) de protéine qui interagit avec un ou plusieurs types de toute.

<table><tbody><tr><td>Adénosine 5&prime ;-(3-thiotriphosphate) sel de tétralithium</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&prime ;-diphosphate&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Micro Bio-Rad</td><td></td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur Vivaspin</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en borosilicate</td><td>Appareil de Harvard</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des architectures de protéine et complexes protéine-ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Les protéines sont une classe importante de macromolécules biologiques qui jouer de nombreux rôles principaux dans des fonctions cellulaires, y compris l’expression des gènes, catalyse des réactions métaboliques, la réplication et la réparation de l’ADN. Donc une compréhension détaillée de ces processus fournit des informations cruciales sur la fonction des cellules. Intégrative structurels MS méthodes offrent des informations structurales et dynamiques sur l’assemblage complexe de protéine, connectivité complexe, sous-unité stoechiométrie, oligomérisation de protéine et la liaison du ligand. Progrès récents en intégration MS structurelles ont permis pour la caractérisation des systèmes biologiques difficiles, y compris les grosses protéines de liaison d’ADN et de protéines membranaires. Ce protocole décrit comment intégrer diverses données MS comme native MS et ion mobility-spectrométrie de masse (IM-MS) avec des simulations de dynamique moléculaire pour nous éclairer dans un ADN hélicase-nucléase réparation complexe protéique. L’approche qui en résulte fournit un cadre pour des études détaillées de liaison du ligand à d’autres complexes de protéines impliquées dans des processus biologiques importants.

Native MS résultats ont révélé l’État oligomère, la composition et la topologie du complexe HerA-NurA (Figure 1). Comme les interactions non covalentes sont conservées dans la phase gazeuse, native MS d’ATP-γ-S et des expériences de titrages ADP détermine la liaison par paires de nucléotides à HerA-NurA (Figure 2) et que l’augmentation de la concentration d’ATP-γ-S augmente la relative intensité de hexamérique HerA (Figure 3). Des informations structurelles concernant les interactions sous-unité provenaient de perturbation solution suivie native MS et étaient en accord avec et masses théoriques (Figure 4 et tableau 1).
Les valeurs expérimentales de CCS de protéines et de leurs complexes a été dérivé d’expériences IM-MS (Figure 5). Ces valeurs sont gazeux par rotation moyenne des calculs transversales de la forme moléculaire et décrivent l’État tridimensionnelle de la protéine. CCS valeurs sont comparées aux mesures théoriques de la cristallographie aux rayons x et un bon accord en déduit que la forme native dans retenus dans la phase gazeuse (tableau 1). Cela valide à l’aide de valeurs de CCS pour construire des modèles basse résolution de l' Assemblée de protéine48.
CCSs expérimentales peuvent être calculés pour chaque ion d’état de charge. Un conformère protéine native peut-être donner lieu à ions de l’état de charge avec des valeurs similaires de CCS. Cependant, les ions état frais plus élevées augmente répulsions coulombiennes pouvant conduire à la protéine phase gazeuse qui se déroule et plus CCS valeurs par rapport à la CCSs théorique. La valeur de CCS de l’état de charge le plus bas, les ions sont donc habituellement utilisée49. Pour HerA-NurA, expériences de la perturbation en solution sur HerA et HerA-NurA avec et sans ADN a incité la génération d’une voie d’assemblage à partir de monomères puis formant l’ensemble hexamérique HerA (HerA6)-complexe dimère de NurA (NurA2) avec l’ADN (Figure 6).
Différences dans les parcelles qui se déroule de CIU entre l’apo (ligand-libre) et un ligand lié définissent le changement en stabilité complexe sur la liaison du ligand. Un supérieur CV50 ou valeur KECOM implique un ion plus stable dans la phase gazeuse. CIU et KECOM analyse révèle que lié aux ADN HerA-NurA est plus stable que le complexe sans ADN (Figure 7Aii). De l’analyse de CIU-MS dans les États respectifs des ATP-binding, quatre-ATP-γ-S État lié réduite stabilité complexe dans la phase gazeuse et l’État lié de six -ATP-γ-S où sont tous les sites est occupés a été le plus stable (Figure 7Bii). Native MS peut révéler le nucléotide discrète, contraignant les États d’Héra ; Toutefois, il ne peut pas distinguer les sous-unités HerA lient ATP et où s’effectue cette liaison. Cette information peut être dérivée des simulations de MD solvants explicites sur la hexamérique HerA et le HerA-NurA suivant le flux de travail succinct (Figure 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> La figure 1. Interroger l’État oligomère, la composition et la topologie du complexe non covalent HerA-NurA. (A) spectres de masse de Héra, HerA-NurA et HerA-NurA, en présence de l’ADN (ADN bicaténaire de 15,4 kDa 25 bp). Le complexe sous HerA existe en tant qu’un hexamère et un PA63. Dimère de NurA lie et à un hexamère de HerA imposant conversion oligomère. L’ADN lie le complexe formé de HerA - NurA (résultats adaptés de Z. Ahdash et al., 201722). (B) les intensités des espèces identifiées sont calculées au moyen de l’UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> La figure 2. Natif de ESI-MS révèle le mécanisme de liaison de nucléotides à HerA-NurA. Spectres de masse (A) HerA-NurA et (B) HerA-NurA-ADN avec des concentrations croissantes de (i) ATP-γ-S et (ii) ADP. Les masses mesurées sont comparés aux masses théoriques et la quantité d’ATP-γ-S ou ADP lié sont déterminés. Les masses mesurées et nombre de nucléotides liés sont indiqués sur les spectres. Les expériences de titrages ATP-γ-S et ADP déterminé la liaison par paires de nucléotides d’HerA-NurA seul et en complexe avec l’ADN, ce qui indique un mécanisme de réaction cyclique (résultats adaptés de Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> La figure 3. Mesurer l’effet de l’augmentation des concentrations d’ATP-γ-S État oligomère HerA. (A) les spectres de masse d’Héra à accroître les concentrations d’ATP-γ-S. (B) graphique illustrant les intensités relatives des différentes espèces de native MS calculées à l’aide de logiciels déconvolution UniDec32. Lorsque la concentration en ATP-γ-S augmente, l’intensité relative des hexamérique HerA augmente également. Nombre de molécules d’ATP-γ-S lié est indiqué sur les spectres (résultats adaptés de Z. Ahdash et al., 201722). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> La figure 4. Masse de spectres et produits de dissociation des complexes de HerA (A) et (B) HerA-NurA (i) seul ou en présence de (ii) l’ADN qui suit d’une perturbation solution. A réalisé des expériences de perturbation dans la solution à l’aide de 10 à 40 % d’acétonitrile, méthanol (MeOH) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) et conduit à la formation de diverses subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figure 5. Ion mobilité arrivée distributions de temps montrées sur un axe de CCS pour complexes et généré des complexes. Icône pour chaque Sub complexe en corrélation avec celles annotées sur les spectres à la Figure 4. Masses expérimentales et calculées et les valeurs de CCS de complexes sous figurent dans le tableau 1 , qui a montré un accord entre valeurs calculées et expérimentales (après compte tenu de l’incertitude typique dans la résolution de voyager ion vague mobilité la spectrométrie de masse de ± 5 - 8 %37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> La figure 6. Voie de l’assemblage du complexe HerA-NurA généré de perturbation solution natives cercles MS et IM-Mme colorées indiquent des conditions où chaque complexe secondaire a été observé : natif (vert, avant l’interruption), méthanol (jaune), DMSO (violet) ou Acétonitrile (rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> La figure 7. Enquête sur l’effet stabilisant de l’ADN (A) sur HerA-NurA et (B) ATP binding à HerA-NurA-ADN. i phase gazeuse CIU-MS parcelles et (ii) Centre-de-masse collision énergies (KEcom) calcul qui montrent que la présence d’ADN double brin stabilise le complexe HerA-NurA et que les six ATP-γ-S lié état est le plus stable. Stabilisation des États de charge différent est affichée. Parcelles ont été générés à l’aide de PULSAR 33. Résultats de (A) adaptés de Z. Ahdash et al., 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> La figure 8. Flux de travail pour les procédures de modélisation pour les simulations de dynamique moléculaire différentielle. (A) générant le complexe sous enquête par la construction de la topologie des existantes sous-unités et reconstruction des résidus manquants. B flux de travail pour l’exécution de simulations de dynamique moléculaire sur la protéine complexe avec et sans ligand. Molecular dynamics simulations sont couru pour la protéine seulement qui agit comme une référence et qui est soustraite de la simulation de protéines plus ligand. Il est suivi par le calcul de la fluctuation de la différentielle quadratique moyenne (FPMR) entre les simulations et détermination de l’effet de liaison du ligand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Complexes / Sub complexe</td>
			<td>Masse théorique (kDa)</td>
			<td>Masse expérimentale (kDa)</td>
			<td>CCS théorique (Å2)</td>
			<td>CCS expérimentale (Å2) [charge]</td>
			<td>Condition HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6NurA -2
</td>
			<td>416,22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 ans]</td>
			<td>10-20 % ACN, DMSO de 10 à 40 %, 10 % MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA, NurA -62- ADN double brin</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>ACN de 10 %, 10 % MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 ans et +]</td>
			<td>10-40 % ACN, MeOH de 10 %, 20-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78,24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>MeOH de 10 à 40 %, 20-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td>ACN DE 10 À 40 %, 40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112,95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>40 % meth, ACN de 10 à 40 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168,99</td>
			<td>169,39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 ans] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, bidon de 10 à 40 %, 40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + ADN</td>
			<td>183,99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226,2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, ACN de 10 à 40 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + ADN</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281,65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>ACN DE 30-40 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339,3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 mené [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, ACN de 10 à 40 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + ADN</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 ans]</td>
			<td>30 % ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA,7
</td>
			<td>394,3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 ans] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40 % MeOH, ACN de 10 à 40 %, 10-40 % DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA,7 + ADN</td>
			<td>409,8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 ans] 14641 [46 +]</td>
			<td>10 % ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Table 1. Les masses expérimentales et calculées et les valeurs de CCS de HerA-NurA et ses complexes sous généré études de perturbation dans la solution de formulaire.

Spectrométrie de masse (MS) est devenue un outil important pour l’enquête de structure et la dynamique des assemblages macromoléculaires. Ici, nous intégrons les approches axées sur les MS pour interroger la formation de complexes protéiques et de liaison du ligand.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Aujourd’hui, la spectrométrie de masse joue un rôle important dans la biologie structurelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les macromolécules biologiques importantes dans leur état natal, en particulier les protéines et les complexes protéiques. La spectrométrie de masse indigène est largement applicable à une variété d’assemblages biomoléculaires, y compris les systèmes de multiprotéines et d’acide nucléique.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et très sensible. Il peut être utilisé pour interroger des échantillons de protéines hétérogènes, ce qui permet d’analyser plusieurs protéines à l’état oligomérique simultanément. Andy Lau, doctorant dans mon groupe, démontrera la procédure.Pour commencer cette procédure, préparez les capillaires à l’interne à la nanoélecrospraie telle qu’elle est décrite dans le protocole textuel. Préparez un échantillon sans ligand comme un contrôle pour chaque course comme échange tampon chacun en acétate d’ammonium. Ensuite, sélectionnez les modes sensibilité, acquisition positive d’ion et mobilité TOF.Ensuite, allumez le piège, l’API et les gaz IMS. Pour la séparation de la GI, utilisez les points de départ de l’azote et de l’argon indiqués ici et ajustez-les au besoin. Définissez une plage d’acquisition m/z appropriée.Pour une protéine inconnue, les étapes initiales d’optimisation doivent utiliser un large éventail. Insérez le capillaire recouvert d’or dans un support capillaire. Chargez ensuite entre deux et trois microlitres de la solution complexe protéique d’intérêt dans le capillaire.Serrez doucement le capillaire et placez-le sur le stade source de l’électrospray. Faites glisser l’étape en position pour commencer à acquérir des données. Appliquez une faible pression de gaz à faible débit jusqu’à ce qu’une goutte se forme à l’extrémité du capillaire.Déplacez le capillaire par rapport au cône et surveillez le courant ion pour atteindre un courant i jion stable. Appliquer une tension capillaire dans la gamme entre 0,9 et 1,6 kilovolts. Réglez ensuite le cône d’échantillonnage, le décalage de source, la température de la source et le flux de gaz c cône tel que décrit dans le protocole de texte.Pour acquérir un spectre de masse bien résolu et maximiser la transmission irionale, ajustez les paramètres de SP et surveillez le changement qui en résulte dans les spectres. Réglez l’énergie de collision du piège à un point de départ initial entre 10 et 50 volts. Si les décalages de tension sont insuffisants, ajustez les énergies de collision du piège.Réglez le piège via sa tension à un point de départ initial entre 20 et 45 volts. Améliorez la désolvation en optimisant cette tension. Après cela, optimisez la vitesse d’onde et la hauteur des vagues telles que décrites dans le texte pour obtenir la meilleure séparation de mobilité.Pour les études impliquant HerA et NurA utiliser une vitesse d’onde de 40 mètres par seconde et une hauteur d’onde entre 550 et 650 volts. Pour l’analyse de liaison d’ADN, mélangez la protéine et l’ADN à un rapport molaire qui permet la formation complexe d’ADN de protéine. Ajoutez des quantités croissantes de l’un des éléments suivants, 5'O-3-thio-triphosphate, sel de tétralithium, ou ADP.À l’aide d’un logiciel approprié, mesurez les masses d’espèces générées et identifiez la liaison ligand, comme les états liants et oligomériques ATP et ADP. Utilisez ensuite les intensités iions observées dans les spectres bruts de la SEp de l’ESI pour quantifier l’abondance relative correspondante des espèces. Après avoir optimiser les conditions de l’instrument pour une transmission stable, réduisez l’énergie collisionnelle et le cône d’échantillonnage aussi bas que possible, tout en conservant une bonne qualité des spectres.Utilisez la vitesse d’onde optimisée précédemment déterminée et la hauteur des ondes pour acquérir im MS. Mesurez le temps de dérive de l’ion à trois vitesses d’onde différentes tout en conservant la même hauteur d’onde. Pour déterminer l’ion protéique CCS mesurer quatre étalons protéiques, deux avec la masse au-dessus de la protéine à l’étude et deux avec la masse ci-dessous, en utilisant les mêmes conditions d’instrumentation. Tout d’abord, préparer les échantillons de protéines et tampon les échanger en acétate d’ammonium tel que décrit dans le protocole texte.Ajouter le solvant par incréments de 10 % jusqu’à ce qu’il atteigne la quantité désirée. Incuber sur la glace pendant une heure. Par la suite, acquérir un spectre DE-SP pour chaque échantillon.À l’aide du logiciel SUMMIT, assignez des sous-complex protéiques et générez des réseaux d’interaction protéique. Alternativement, générer manuellement une liste de masses théoriques pour les espèces attendues. Pour commencer à étudier la stabilité du complexe protéique, enregistrez les données IM-MS tout en augmentant la tension d’accélération du piège de 10 volts à 200 volts, qui se déploiera progressivement vers la protéine et la phase de gaz.Analyser les données à l’aide d’un logiciel approprié et générer des parcelles de déroulement bidimensionnelles en empilant l’intensité normalisée des distributions de CSC à chaque tension d’accélération pour chaque état de charge. Les résultats indigènes de MS révèlent l’état oligomérique, la composition, et la topologie du complexe d’HerA et de NurA. Comme les interactions noncovalentes sont préservées dans la phase de gaz, la SP indigène des expériences de titration ATP gamma S et ADP, sont utilisées pour déterminer la liaison nucléotide en couple dans l’HerA et la NurA.Les spectres de masse des états oligomériques d’HerA révèlent que l’augmentation de la concentration gamma S de l’ATP augmente l’intensité relative de l’Hémémie hexamérique. Les valeurs expérimentales du CSC pour les protéines et leurs complexes sont ensuite dérivées des expériences im-MS. Ces valeurs sont considérées comme ayant un bon accord avec les mesures théoriques de la cristallographie aux rayons X, qui valide l’utilisation des valeurs ccs pour la construction de modèles à basse résolution d’assemblage de protéines.L’analyse ciu et KEcom révèle que l’ADN lié à HerA-NurA est plus stable que le complexe sans ADN. L’analyse ciu ms et les états contraignants ATP respectifs montrent que les quatre ATP gamma S lié état réduit la stabilité complexe dans la phase de gaz. Cependant, les six ATP gamma S liés état dans lequel tous les sites sont occupés, est considéré comme le plus stable.Des mesures précises de la masse moléculaire d’un complexe intact fournissent un aperçu précieux de la caractérisation biomoléculaire. Nous pouvons obtenir des informations sur les voies d’assemblage complexes, l’oligomérisation des protéines et la liaison ligand. La combinaison de toutes ces informations permet de générer des modèles détaillés d’assemblages biologiques fonctionnels.

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

La spectrométrie de masse s'est avérée être un outil précieux pour l'analyse des complexes protéiques importants. Cette méthode permet un aperçu de l'architecture composition, la stoechiométrie et générale de la multi-unité assemblées. Ici, nous décrivons, étape par étape, comment réaliser une analyse par spectrométrie de masse structurel, et de caractériser des structures macromoléculaires.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

De mobilité ionique et spectrométrie de masse est une société émergente en phase gazeuse technologie qui sépare les ions, basée sur leur collision section transversale et la masse. La méthode fournit des informations tridimensionnelles sur la topologie et la forme générale de complexes protéiques. Ici, nous présentons une procédure de base pour réglage de l'appareil et l'optimisation, l'étalonnage du temps de dérive, et l'interprétation des données.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Mesure précise de la masse représente une étape importante lors de l'enquête de protéines. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) la spectrométrie de masse (MS) peut être utilisée pour cette détermination et son principal avantage est la tolérance aux sels, des détergents et des contaminants. Ici, nous illustrons une approche accessible pour l'analyse des protéines de plus de 100 kDa par MALDI-MS.

Soutenue par une matrice désorption / ionisation laser temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse Analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa

Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la spectrométrie de masse par échange d’hydrogène/deutérium amide à l’état solide (ssHDX-MS) et la spectrométrie de masse de marquage photolytique à l’état solide (ssPL-MS) pour les protéines dans les poudres solides. Les méthodes fournissent des informations à haute résolution sur la conformation et les interactions des protéines à l’état solide amorphe, ce qui peut être utile dans la conception de formulations.

Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Nous présentons ici un protocole visant à contrôler le montage et le démontage de la toxine du charbon à l’aide de biolayer l’interférométrie (BLI). Suite de montage/démontage sur la surface du biocapteur, les complexes de protéine importante sont dispensés de la surface pour la visualisation et l’identification des composantes des complexes à l’aide de la microscopie électronique et microanalyse, respectivement.

Analyse des Complexes protéiques dynamique assemblés sur et libéré de Biolayer interférométrie biocapteur à l’aide de la spectrométrie de masse et de microscopie électronique

Les procédures expérimentales pour effectuer un marquage covalent à base de diéthylpyrocarbonate avec détection spectrométrique de masse sont décrites. Le diéthylpyrocarbonate est simplement mélangé avec la protéine ou le complexe protéique d’intérêt, conduisant à la modification des résidus d’acides aminés accessibles aux solvants. Les résidus modifiés peuvent être identifiés après digestion protéolytique et analyse chromatographie liquide/spectrométrie de masse.

Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l'obtention de matériel d'étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l'analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d'autres applications analytiques.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

La structure en solution RMN d’un peptide modèle de métallopérone avec Cu (I) a été déterminée, et un protocole détaillé allant de la préparation de l’échantillon et de la collecte de données 1D et 2D à une structure tridimensionnelle est décrit.

Détermination de la structure et de la coordination de complexes peptides-métalliques à l’aide de la RMN 1D et 2D 1H

Découvrez la spectrométrie de masse native pour analyser les complexes protéiques et les interactions ligand-protéine. Cette méthode rapide et sensible permet d'étudier les assemblages macromoléculaires dans leur état natif.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Explorer plus de vidéos