Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Aujourd’hui, la spectrométrie de masse joue un rôle important dans la biologie structurelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les macromolécules biologiques importantes dans leur état natal, en particulier les protéines et les complexes protéiques. La spectrométrie de masse indigène est largement applicable à une variété d’assemblages biomoléculaires, y compris les systèmes de multiprotéines et d’acide nucléique.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et très sensible. Il peut être utilisé pour interroger des échantillons de protéines hétérogènes, ce qui permet d’analyser plusieurs protéines à l’état oligomérique simultanément. Andy Lau, doctorant dans mon groupe, démontrera la procédure.

Pour commencer cette procédure, préparez les capillaires à l’interne à la nanoélecrospraie telle qu’elle est décrite dans le protocole textuel. Préparez un échantillon sans ligand comme un contrôle pour chaque course comme échange tampon chacun en acétate d’ammonium. Ensuite, sélectionnez les modes sensibilité, acquisition positive d’ion et mobilité TOF.

Ensuite, allumez le piège, l’API et les gaz IMS. Pour la séparation de la GI, utilisez les points de départ de l’azote et de l’argon indiqués ici et ajustez-les au besoin. Définissez une plage d’acquisition m/z appropriée.

Pour une protéine inconnue, les étapes initiales d’optimisation doivent utiliser un large éventail. Insérez le capillaire recouvert d’or dans un support capillaire. Chargez ensuite entre deux et trois microlitres de la solution complexe protéique d’intérêt dans le capillaire.

Serrez doucement le capillaire et placez-le sur le stade source de l’électrospray. Faites glisser l’étape en position pour commencer à acquérir des données. Appliquez une faible pression de gaz à faible débit jusqu’à ce qu’une goutte se forme à l’extrémité du capillaire.

Déplacez le capillaire par rapport au cône et surveillez le courant ion pour atteindre un courant i jion stable. Appliquer une tension capillaire dans la gamme entre 0,9 et 1,6 kilovolts. Réglez ensuite le cône d’échantillonnage, le décalage de source, la température de la source et le flux de gaz c cône tel que décrit dans le protocole de texte.

Pour acquérir un spectre de masse bien résolu et maximiser la transmission irionale, ajustez les paramètres de SP et surveillez le changement qui en résulte dans les spectres. Réglez l’énergie de collision du piège à un point de départ initial entre 10 et 50 volts. Si les décalages de tension sont insuffisants, ajustez les énergies de collision du piège.

Réglez le piège via sa tension à un point de départ initial entre 20 et 45 volts. Améliorez la désolvation en optimisant cette tension. Après cela, optimisez la vitesse d’onde et la hauteur des vagues telles que décrites dans le texte pour obtenir la meilleure séparation de mobilité.

Pour les études impliquant HerA et NurA utiliser une vitesse d’onde de 40 mètres par seconde et une hauteur d’onde entre 550 et 650 volts. Pour l’analyse de liaison d’ADN, mélangez la protéine et l’ADN à un rapport molaire qui permet la formation complexe d’ADN de protéine. Ajoutez des quantités croissantes de l’un des éléments suivants, 5'O-3-thio-triphosphate, sel de tétralithium, ou ADP.

À l’aide d’un logiciel approprié, mesurez les masses d’espèces générées et identifiez la liaison ligand, comme les états liants et oligomériques ATP et ADP. Utilisez ensuite les intensités iions observées dans les spectres bruts de la SEp de l’ESI pour quantifier l’abondance relative correspondante des espèces. Après avoir optimiser les conditions de l’instrument pour une transmission stable, réduisez l’énergie collisionnelle et le cône d’échantillonnage aussi bas que possible, tout en conservant une bonne qualité des spectres.

Utilisez la vitesse d’onde optimisée précédemment déterminée et la hauteur des ondes pour acquérir im MS. Mesurez le temps de dérive de l’ion à trois vitesses d’onde différentes tout en conservant la même hauteur d’onde. Pour déterminer l’ion protéique CCS mesurer quatre étalons protéiques, deux avec la masse au-dessus de la protéine à l’étude et deux avec la masse ci-dessous, en utilisant les mêmes conditions d’instrumentation. Tout d’abord, préparer les échantillons de protéines et tampon les échanger en acétate d’ammonium tel que décrit dans le protocole texte.

Ajouter le solvant par incréments de 10 % jusqu’à ce qu’il atteigne la quantité désirée. Incuber sur la glace pendant une heure. Par la suite, acquérir un spectre DE-SP pour chaque échantillon.

À l’aide du logiciel SUMMIT, assignez des sous-complex protéiques et générez des réseaux d’interaction protéique. Alternativement, générer manuellement une liste de masses théoriques pour les espèces attendues. Pour commencer à étudier la stabilité du complexe protéique, enregistrez les données IM-MS tout en augmentant la tension d’accélération du piège de 10 volts à 200 volts, qui se déploiera progressivement vers la protéine et la phase de gaz.

Analyser les données à l’aide d’un logiciel approprié et générer des parcelles de déroulement bidimensionnelles en empilant l’intensité normalisée des distributions de CSC à chaque tension d’accélération pour chaque état de charge. Les résultats indigènes de MS révèlent l’état oligomérique, la composition, et la topologie du complexe d’HerA et de NurA. Comme les interactions noncovalentes sont préservées dans la phase de gaz, la SP indigène des expériences de titration ATP gamma S et ADP, sont utilisées pour déterminer la liaison nucléotide en couple dans l’HerA et la NurA.

Les spectres de masse des états oligomériques d’HerA révèlent que l’augmentation de la concentration gamma S de l’ATP augmente l’intensité relative de l’Hémémie hexamérique. Les valeurs expérimentales du CSC pour les protéines et leurs complexes sont ensuite dérivées des expériences im-MS. Ces valeurs sont considérées comme ayant un bon accord avec les mesures théoriques de la cristallographie aux rayons X, qui valide l’utilisation des valeurs ccs pour la construction de modèles à basse résolution d’assemblage de protéines.

L’analyse ciu et KEcom révèle que l’ADN lié à HerA-NurA est plus stable que le complexe sans ADN. L’analyse ciu ms et les états contraignants ATP respectifs montrent que les quatre ATP gamma S lié état réduit la stabilité complexe dans la phase de gaz. Cependant, les six ATP gamma S liés état dans lequel tous les sites sont occupés, est considéré comme le plus stable.

Des mesures précises de la masse moléculaire d’un complexe intact fournissent un aperçu précieux de la caractérisation biomoléculaire. Nous pouvons obtenir des informations sur les voies d’assemblage complexes, l’oligomérisation des protéines et la liaison ligand. La combinaison de toutes ces informations permet de générer des modèles détaillés d’assemblages biologiques fonctionnels.