Méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser l’activité des enzymes désubiquitinées dans les cellules. Ceci est réalisé en cultivant des cellules à haute cofluence et en les récoltant pour faciliter la production d’un lysat concentré dans un deuxième temps. La lyse mécanique douce est utilisée pour produire un lysat qui maintient une image métabolique du cytoplasme de la cellule.

Ensuite, les enzymes sont incubées avec des sondes dérivées de l’hémagglutinine afin de marquer les enzymes de ubiquitine en réagissant avec le résidu cystéine du site actif, les résultats montrent les profils d’activité de nombreuses enzymes de ubiquitine basés sur le transfert Western et la détection ultérieure par chimiluminescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le western blot régulier, est qu’elle permet à l’utilisateur de visualiser les activités de plusieurs enzymes. Dans une expérience, Prepare cell culture media d’Ali, citant 30 millilitres de dobe docos, de milieu d’aigle modifié ou de DMEM plus 10 % de sérum bovin fœtal dans un tube conique de 50 millilitres à cultiver.

Les cellules de l’expérience transfèrent des cellules M 17 ou A gelées du stockage d’azote liquide dans un petit bécher avec de l’eau tiède. Transférez ensuite les cellules dans le tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de fluide. Ensuite, ajoutez un peu de milieu dans le flacon de cellules et transférez les cellules remises en suspension dans les cinq secondes suivant la décongélation.

Centrifuger la suspension cellulaire à 450 G pendant cinq minutes pour obtenir une pastille cellulaire. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu dans une fiole T 75. Retirez le fluide des cellules à l’aide de l’aspiration.

Ajoutez cinq millilitres de milieu frais à la pastille cellulaire et réanimez-le. Transférez les cinq millilitres de suspension cellulaire dans les 20 millilitres de milieu dans le ballon T 75 et incubez à 37 degrés Celsius. Changer de milieu tous les trois jours pour récolter les cellules.

Retirez le fluide par aspiration, en faisant attention de ne pas toucher les cellules. Lavez les cellules avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Retirez le PBS à l’aide de l’aspiration.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de tripsin EDTA dans la fiole T 75 et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Après l’incubation, ajouter six millilitres de milieu frais dans la fiole et la réusation. Mettez les cellules en veille.

Transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 290 G pendant cinq minutes, retirez le surnageant et ajoutez cinq millilitres de PBS. Tapotez doucement le bas du tube pour briser la pastille avant la centrifusion à 290 G pendant cinq minutes. Après avoir répété le lavage PBS trois fois, retirez l’ancien PBS et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS frais.

Transférez ensuite les cellules dans un tube einor et faites tourner à 290 GS pendant cinq minutes. Pour effectuer la lyse cellulaire, mesurez le volume approximatif de la pastille à l’aide d’une pipette et pesez les billes de verre et un rapport masse/volume de un pour un. Ajoutez un tampon de lyse à la pastille à deux fois le volume de la pastille.

Ajoutez ensuite les billes de verre au granulé et lysez. Tamponner les cellules dans le tube d’essai à l’agitation maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius en tourbillonnant dans une chambre froide. Centrifuger brièvement à 200 GS pendant 30 secondes.

Pour déposer les perles et recueillir le surnageant. Ajoutez le même volume de billes de verre que précédemment dans le vortex surnageant, une fois de plus à l’agitation maximale pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius après centrifusion brièvement à 200 G pendant 30 secondes. Pour déposer les billes de verre, récupérez le surnageant.

Enfin, centrifuger à 5 030 GS pendant cinq minutes. Pour éliminer les noyaux, les membranes et les cellules ininterrompues, prélevez le surnageant, qui est le lysat cellulaire pour la dérivation tissulaire, effectué par l’analyse de l’acide Cinco Nimic, ou BCA. Dans une plaque à 96 puits, déterminer la concentration en protéines du lysat à l’aide d’un lecteur de plaque à 96 puits, comme spécifié par le protocole du kit de dosage des protéines BCA.

Après avoir déterminé la concentration en protéines, apportez une aliquote correspondant à 20 microgrammes de protéines totales à 50 microlitres en utilisant de l’eau désionisée. Ajoutez ensuite deux microlitres de 1,35 micromolaire de téléphone portable en vinyle HAUB à la solution. Le résultat est de 20 microgrammes de lysat pour 50 nanomolaires de sonde dans le mélange réactionnel final.

Il s’agit d’un excès de grosses molaires. Pour assurer le marquage des enzymes de ubiquitine fonctionnelles ou dubs, laissez la solution incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez le tampon d’échantillonnage laly à la solution.

Pour un volume de réaction de 52 microlitres, utilisez 26 microlitres de tampon d’échantillon deux x, 13 microlitres de tampon d’échantillon quatre x ou 8,87 microlitres de tampon d’échantillon six x. Incuber l’échantillon pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Refroidir sur glace.

Avant de charger le gel pour effectuer le western blot, chargez d’abord un gel de glycine de 12, bien quatre à 20 % de tris avec 40 microlitres de l’échantillon préparé. Faites fonctionner le gel à 95 volts jusqu’à ce que le front ionique atteigne le fond. Ensuite, effectuez un transfert nocturne du gel sur une membrane poly vine DI fluorure ou PVDF par la suite.

Transfert Tout d’abord, incubez la membrane dans la coloration noire AMDO et scannez la membrane pour obtenir une image montrant la quantité de protéines dans chaque voie. Ensuite, retenez la membrane et incubez dans du lait à 5 % dans du PBS pendant une heure pour bloquer. Ensuite, incubez la membrane de l’anticorps anti-HA primaire à une concentration de 1 à 10 000 dans du lait à 5 % dans du PBS, soit pendant la nuit à quatre degrés Celsius, soit pendant quatre heures à température ambiante.

Après l’incubation, effectuez trois lavages de cinq minutes chacun dans du PBS avec 0,1 % de détergent tween 20. Ensuite, incubez la membrane dans de la peroxydase de raifort de souris à une concentration de un à 10 000 dans du lait à 5 % dans du PBS pendant au moins deux heures. Effectuez trois lavages comme précédemment, suivis d’un lavage pendant cinq minutes dans PBS.

Enfin, incubez la membrane dans un réactif de détection chimiluminescent pendant 10 minutes et détectez à l’aide d’un détecteur luminescent. Utilisez le réglage d’exposition automatique du détecteur. La charge protéique a été vérifiée à l’aide de la coloration noire AM mito.

Cette étape de contrôle permet de s’assurer que les différences d’activité sont dues à des processus cellulaires réels et non à une charge protéique inégale. Les voies montrées ici indiquent que des quantités égales de protéines ont été utilisées dans la première expérience. Dans la deuxième expérience, des quantités inégales de protéines ont été chargées en raison des différences attendues dans les profils d’activité des différentes lignées cellulaires.

Cela a été fait pour assurer la détection d’un profil d’activité pour la cellule M 17. Les lysats ont été incubés avec de l’éthylmaide, qui est un inhibiteur de la cystine et devrait entraîner une réduction du signal sur le Western blot. Les membranes ont été incubées dans un anticorps primaire anti-HA.

Une souris raicheval radis peroxydase, puis détectée à l’aide de l’imagerie chimiluminescente. Le marquage réussi des dubs à l’aide des sondes permet d’obtenir un profil dans chaque voie de la membrane. L’intensité des bandes à différents poids moléculaires correspond au niveau d’activité de l’enzyme dub.

Les différences de niveaux d’activité de divers dubs entre les lignées cellulaires deviennent évidentes lorsque des protéines similaires telles que U, CHL one sont comparées dans les cellules he, a et M 17. Après cette procédure. D’autres méthodes comme le fractionnement subcellulaire peuvent être effectuées afin de répondre à des questions telles que, comment les processus pathologiques affectent-ils l’activité de l’enzyme ubiquitine dans les organites liés à la membrane ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’activité enzymatique ubiquitinée à l’aide de sondes dirigées vers le site actif.