Name: Méthode de mesure de lactivité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez une méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus. Cette technique utilise des sondes dérivées de l'hémagglutinine et le Western blot pour visualiser les profils d'activité enzymatique.

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Nous tenons à remercier le laboratoire Lee de l&#39;Université du Minnesota pour fournir les échantillons de tissus de la moelle épinière de souris qui ont été utilisés. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense Programme Cancer de l&#39;ovaire de la recherche (OCRP) de OC093424 à MB, par le Fonds communautaire de recherche et cancer Randy Shaver MB et par le Minnesota Cancer de l&#39;ovaire Alliance (MOCA) à MB. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.

1. Préparation Lysis Buffer <ol><li> Dissoudre saccharose dans déminéralisée (DI) de l&#39;eau pour faire un bouillon solution 2 M. Filtrer une solution 2 M de saccharose en utilisant un vide poussé de 0,22 um polyfluorure de vinylidène (PVDF) filtre. </li><li> Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l&#39;eau DI pour faire un mM solution et magasin 500 dans des conditions anaérobies. Dissoudre le chlorure de magnésium (MgCl 2) dans de l&#39;eau DI pour faire un bouillon solution 100 mM. Dissoudre l&#39;adénosine triphosphate (ATP) disodique hydraté dans de l&#39;eau DI pour faire un bouillon solution à 50 mM. </li><li> Préparer une solution de Tris à un pH de 7,4 en dissolvant le chlorhydrate de Trizma dans de l&#39;eau DI et à ajuster le pH avec de l&#39;hydroxyde de sodium (NaOH). </li><li> Moissonneuse parties des solutions mères dans de l&#39;eau désionisée pour faire un tampon de lyse avec une concentration en saccharose de 250 mM, une concentration de DTT de 1 mM, la concentration de MgCl2 5 mM, une concentration en ATP de 1 mM et une concentration de Tris de 50 mM . Par exemple, mélanger 535,3 ul de tris, 500 ul de MgCl2, 1,25 ml de saccharose, 20 ul de DTT, 200 ul d&#39;ATP et de 7,4947 ml d&#39;eau désionisée pour faire 10 ml de tampon de lyse. Ceci peut être utilisé pendant environ 20 expériences. </li></ol> 2. la culture de cellules pour l&#39;expérience <ol><li> Assurez médias par aliquotage 30 ml de DMEM + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Transfert cellules HeLa M17 ou congelés de stockage d&#39;azote liquide à un petit bécher avec de l&#39;eau tiède. </li><li> Transférer les cellules à 50 ml le tube conique. D&#39;abord, ajouter certains médias à la fiole de cellule. Puis transférer les cellules remises en suspension dans les 5 secondes de la décongélation. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 450 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. Ajouter 20 ml de milieu dans un flacon T75. </li><li> Retirez le support des cellules en utilisant aspiration. Ajouter 5 ml de milieu frais au culot cellulaire et remettre en suspension. </li><li> Transférer la suspension cellulaire 5 ml à 20 ml de milieu dans le flacon T75 et incuber à 37 ° C. ChAnge les médias tous les 3 jours. </li></ol> 3. Cellule récolte <ol><li> Retirez les médias par l&#39;intermédiaire aspiration, en faisant attention à ne pas toucher les cellules. </li><li> Laver les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer du PBS en utilisant une aspiration. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA) au flacon T75 et incuber à 37 ° C pendant 3 min. </li><li> Ajouter 6 ml de milieu frais dans le ballon et remettre en suspension les cellules. </li><li> Transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 290 g pendant 5 minutes. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 5 ml de PBS. Tapotez doucement le bas du tube pour briser le culot. Centrifuger à 290 g pendant 5 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.6 trois fois. </li><li> Retirer du PBS et remettre les cellules dans 1 ml de PBS frais. Transfert au tube Eppendorf (1,5 ml). Spin à 290 g pendant 5 min. </li></ol> 4. lyse cellulaire <ol><li> Mesurer le volume approximatif de la pastille en utilisant une pipette d&#39;unD peser perles de verre dans une masse: rapport en volume de 1: 1. Ajouter deux fois le volume du culot dans un tampon de lyse. Note: Ajouter le tampon avant d&#39;ajouter les perles de verre. </li><li> Lyse des cellules dans le tube Eppendorf dans la agitation maximale pendant 30 minutes à 4 ° C par agitation par tourbillonnement dans une chambre froide. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 30 secondes pour régler les perles. Recueillir le surnageant. </li><li> Ajouter le même volume de billes de verre comme précédemment pour le surnageant. </li><li> Vortex nouveau à une agitation maximale pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger brièvement à 200 xg pendant 30 sec à régler les perles de verre. Recueillir le surnageant. </li><li> Centrifuger à 5030 g pendant 5 min pour éliminer les noyaux, les membranes et les cellules non rompues. Récupérer le surnageant, ce qui est le lysat cellulaire. </li></ol> 5. L&#39;homogénéisation tissulaire <ol><li> Faites une masse: volume de 1: 9 solution de tissus de la moelle épinière de souris pour tampon de lyse. Remarque: Cette méthode est applicable à une variété de différerdes échantillons de tissus ENT. </li><li> Homogénéiser le tissu en utilisant un réglage de niveau 2 de l&#39;homogénéisateur pendant 30 s afin d&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de morceaux restants. </li><li> Isoler à 5030 g pendant 3 min pour enlever les noyaux, les membranes et les cellules non rompues. </li><li> Récupérer le surnageant, qui est le lysat. </li></ol> 6. La dérivation de l&#39;échantillon <ol><li> Effectuer un acide bicinchoninique (BCA) dans une analyse de plaque de 96 puits pour déterminer la concentration en protéines du lysat de tissu en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits colorimétrique comme spécifié par le Pierce BCA Protein Assay protocole de la trousse. </li><li> Amener une partie aliquote correspondant à 20 pg de protéine totale à l&#39;aide de 50 ul (DI) de l&#39;eau de-ionisée. </li><li> Ajouter 2 ul de 1,35 M de HA-Ub-vinyle sulfone (VS) à la solution et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Il en résulte 20 pg de lysat de 50 nM de sonde dans le mélange réactionnel final. Ceci est en grand excès molaire d&#39;assurer le marquage de DUBs fonctionnels. </li><li> JEncubate l&#39;échantillon dans le tampon d&#39;échantillon de Laemmli pendant 5 minutes à 95 ° C. Pour un volume de 52 ul de réaction utilisation 26 ul de tampon d&#39;échantillon 2x, 13 ul de tampon d&#39;échantillon 4x ou 8,87 pi de tampon d&#39;échantillon 6x. </li><li> Refroidir sur de la glace avant de charger le gel. </li></ol> 7. Western Blot <ol><li> Charger un 4-20% gel de tris-glycine 12 puits avec 40 pl de l&#39;échantillon préparé </li><li> Exécutez le gel à 95 V jusqu&#39;à ce que le front d&#39;ions atteint le fond. </li><li> Effectuer un transfert durant la nuit du gel sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF). </li><li> Incuber la membrane dans la amido tache noire et de numériser l&#39;membane pour obtenir une image montrant la quantité de protéine dans chaque voie. </li><li> Destain la membrane et incuber dans 5% de lait dans du PBS pendant 1 heure pour bloquer. </li><li> Incuber la membrane dans l&#39;anticorps primaire anti-HA à une concentration de 1: 10000 dans 5% de lait dans du PBS, soit pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à température ambiante. </li><li> Effectuez 3 lavages fou 5 minutes chacun dans du PBS avec 0,1% de Tween-20 détergent. </li><li> Incuber la membrane à une peroxydase de raifort de la souris à une concentration de 1: 10000 dans 5% de lait dans du PBS pendant au moins 2 heures. </li><li> Effectuer trois lavages pendant 5 minutes chacun dans du PBS avec 0,1% de détergent Tween-20. </li><li> Effectuer 1 lavage pendant 5 min dans du PBS. </li><li> Incuber la membrane dans un réactif de détection de chimioluminescence pendant 10 min et la détection en utilisant un détecteur à chimiluminescence. Utilisez le réglage sur le détecteur automatique de l&#39;exposition. </li></ol>

<ol><li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-+based+ubiquitin-specific+%28USP%29+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li>
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<li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li>
<li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li>
<li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li>
<li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+%CE%B1-Synucleinopathy+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Depuis ubiquitination est une activité cellulaire fondamental, la compréhension des mécanismes de régulation pourrait être la clé pour déterrer les processus de la maladie et de la pathologie. L&#39;utilisation de HA marqué sites dirigé sondes actives Ub dérivés rapportés ici fournit une méthode simple, mais très applicable pour l&#39;étude de la dégradation des protéines Ub-médiation. Cette méthode est plus rapide et moins coûteux que d&#39;étudier chacun des DUBs individuellement. Dans ce ...

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) sert comme l&#39;une des principales voies de dégradation dans la cellule de mammifère. Substrats liés à la dégradation dans le protéasome sont étiquetés de manière covalente avec des polymères de l&#39;ubiquitine (Ub) 1. Avant le substrat ciblé entre le protéasome de dégradation, l&#39;étiquette de poly-ubiquitine doit être retiré. Une classe d&#39;enzymes appelées enzymes de dé-ubiquitination (DUB) est responsable de l&#39;élimination et le recyclage des molécules d&#39;ubiquitine 2. Il a été prédite à partir du génome humain qui, il ya près d&#39;une centaine DUBs travaillant dans la cellule 3. Avec un si grand nombre de processus cellulaires DUBs contrôle Ub-médiation, l&#39;étude de ces enzymes représente un défi, car les techniques d&#39;ARNm ne donnent pas d&#39;informations sur l&#39;activité et western blot ne donne des informations sur les niveaux d&#39;expression. L&#39;utilisation de la grippe hémagglutinine (HA) marqué, Ub sondes dérivées de sites actifs dirigée permet un mod covalenteification des DUBs fonctionnels et donc donne une visualisation directe de l&#39;activité de ces enzymes sur un western blot 4. Les sondes ont un groupe réactif thiol C-terminal qui sert de substrat suicide pour le résidu cysteine ​​du site actif 5. Avec ces sondes, il est possible d&#39;étudier l&#39;activité et l&#39;expression de nombreux DUBs potentiel sous les deux états pathologiques et physiologiques de la cellule. Changements dans l&#39;activité DUB ont été impliqués dans une gamme de conditions pathologiques comme la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer, l&#39;anémie et divers cancers 6-10. Cette technique fournit un outil puissant pour l&#39;étude des maladies. Dans le présent article, nous montrons l&#39;application de cette technique dans les cellules HeLa et M17 qui ont été lysées en utilisant des billes de verre. En outre, nous décrivons comment utiliser cette méthode dans des échantillons de tissus de la moelle épinière de souris. L&#39;information obtenue à partir de cette technique peut être utilisée comme un point de départ pour identifiercibles thérapeutiques ainsi que l&#39;établissement de modèles pour l&#39;étude des différents états pathologiques. La véritable utilité de cette technique réside dans sa capacité à fournir des informations sur plusieurs DUBs dans un seul essai.

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (homogénéisateur)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à vide 0.22 &micro ; m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre, lavées à l’acide & ; 106 et micro ; m (~140 Tamis américain)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fischer Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate disodium sel hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture tissulaire 75 cm2 avec gobelet filtrant 250 ml 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-HA produit chez la souris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitine vinyl sulfone (HA-tag)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli’s SDS-Sample Buffer (4x, réducteur)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Kit de dosage</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode de mesure de l&#39;activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Le système ubiquitine-protéasome a été récemment impliqué dans différentes pathologies dont les maladies neurodégénératives et des cancers. À la lumière de cela, des techniques pour étudier le mécanisme de régulation de ce système sont essentielles pour élucider les processus cellulaires et moléculaires des maladies susmentionnées. L&#39;utilisation de l&#39;hémagglutinine dérivée d&#39;ubiquitine sondes décrites dans le présent document constitue un outil précieux pour l&#39;étude de ce système. Ce document décrit en détail une méthode qui permet à l&#39;utilisateur d&#39;effectuer des tests qui donnent une visualisation directe de l&#39;activité enzymatique désubiquitination. Enzymes de dé-ubiquitination contrôlent dégradation par le protéasome et partager homologie fonctionnelle sur leurs sites actifs, ce qui permet à l&#39;utilisateur d&#39;enquêter sur l&#39;activité de plusieurs enzymes dans un essai. Lysats sont obtenus grâce à une rupture mécanique doux cellulaire et incubées avec site actif sondes dirigées. Enzymes fonctionnelles sont étiquetés avec les sondes en enzymes inactives demeurent non. En termeNing cet essai, l&#39;utilisateur obtient des informations à la fois sur l&#39;activité et l&#39;expression potentielle de plusieurs enzymes de dé-ubiquitination d&#39;une manière rapide et facile. La méthode actuelle est nettement plus efficace que d&#39;utiliser des anticorps individuels pour les cent prédits enzymes de dé-ubiquitination dans la cellule humaine.

Cellules M17 et HeLa cultivées ont été récoltées en utilisant la méthode détaillée dans le (Cell récolte 3.) protocole et les tissus de la moelle épinière de souris a été obtenu. L&#39;/ tissu de la moelle épinière culot cellulaire a été placé dans un tube avec le tampon de lyse décrit dans la section de préparation des réactifs. Les culots cellulaires ont été lysés en utilisant des billes de verre (Figure 1A) et des échantillons de tissus de moelle épinière de souris ont été homogénéisées en utilisant ...

Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l&#39;activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l&#39;enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d&#39;identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Méthode de mesure de l&#39;activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser l'activité des enzymes déubiquitinées dans les cellules. Cette visualisation est obtenue en cultivant les cellules à forte confluence et en les récoltant afin de faciliter la production d'un lysat concentré dans une deuxième étape. Une lyse mécanique douce est utilisée pour produire un lysat qui préserve un instantané métabolique du cytoplasme cellulaire.Ensuite, les enzymes sont incubées avec des sondes dérivées de l'hémagglutinine afin de marquer les enzymes déubiquitines en réagissant avec le résidu de cystéine du site actif. Les résultats montrent les profils d'activité de nombreuses enzymes déubiquitines basés sur un immunoblot (Western blotting) et une détection chimiluminescente ultérieure. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le Western blot classique, est qu'elle permet à l'utilisateur de visualiser les activités de plusieurs enzymes. Dans une expérience, préparez le milieu de culture cellulaire en aliquotant 30 millilitres de milieu de culture Eagle modifié (DMEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal dans un tube conique de 50 millilitres pour la culture.Les ce

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L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

La détection des protéines ubiquitination

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Ce protocole explique comment mesurer l’effet de la variation génétique associée aux troubles neurodéveloppementaux sur l’activité de l’enzyme de désubiquitylation en combinant la purification des protéines recombinantes avec des tests de clivage de la chaîne d’ubiquitine.

Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à des technologies de sonde pour prédire et valider l’interaction entre de petites molécules de la médecine traditionnelle chinoise et des cibles protéiques.

Criblage de composés de médecine traditionnelle chinoise pour inhiber l’activité d’UCHL3 sur la base de la technologie des sondes enzymatiques d’amarrage moléculaire et de désubiquitination

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Découvrez une méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus. Cette technique utilise des sondes dérivées de l'hémagglutinine et le Western blot pour visualiser les profils d'activité enzymatique.

Méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

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