Optimisation et l'utilisation des Agrobacterium Médiée par la production de protéines transitoire dans Nicotiana

L’objectif global de cette procédure est de développer une méthode simple, efficace et évolutive pour la production de protéines recombinantes transitoires dans un système à base de plantes en utilisant la technique d’agro-infiltration. Pour ce faire, il faut d’abord optimiser les conditions de croissance des plantes. La deuxième étape consiste à transformer l’agrobactérie à l’aide de vecteurs de lancement qui combinent des composants de virus végétaux et de plasmides binaires, puis à cultiver l’agrobactérie transformée pour l’utiliser dans les expériences agricoles.

Lors de l’infiltration d’agrobactéries, les plantes sont retournées et les parties aériennes sont immergées dans une suspension d’agrobactérie. Un vide est ensuite appliqué, provoquant l’évacuation de l’air des espaces intercellulaires dans les tissus foliaires. Grâce à la repressurisation rapide après libération du vide, la suspension d’agrobacterium est inversée dans les feuilles.

En fin de compte, des tests d’immuno-transfert et de fluorescence sont utilisés pour montrer la production de protéines recombinantes dans les plantes infiltrées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’infiltration manuelle, est que la méthode d’infiltration sous vide peut être étendue à la production industrielle de protéines recombinantes, y compris les vaccins et les protéines thérapeutiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biotechnologie végétale et faciliter davantage l’utilisation des plantes comme plate-forme alternative pour la production commerciale de protéines recombinantes.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons découvert qu’il était difficile d’étendre l’agrofiltration aux plantes cultivées en terre. Pour plusieurs raisons, le sol contient des uchin tels que des virus, des bactéries, des nématodes, et en outre, le contenu du sol et l’eau d’irrigation varient d’un lot à l’autre et d’une saison à l’autre, et les œufs du sol au fil du temps en stockage. De plus, le retournement du sol des plantes en croissance entraînerait un coulage indésirable de sol dans la culture d’agrobactéries lors de l’infiltration.

Rebecca Snow, assistante de recherche principale du laboratoire de biologie végétale et d’ingénierie, et Emma Gut Robin Lobe feront la démonstration de cette procédure. Elle, elle et Adam Trevor, qui sont assistants de recherche dans mon laboratoire. Cette étude utilise un milieu de croissance hydroponique et une solution nutritive pour assurer l’uniformité de la croissance des plantes et éliminer les complexités associées à l’utilisation du sol pour la culture des plantes.

Pour commencer cette procédure, faites tremper des plaques de laine de roche dans une solution d’engrais pour plantes pendant cinq minutes, semez manuellement les graines sur la surface de la laine de roche imbibée de nutriments. À l’aide du cèdre, trois espèces de Nico Oceana seront évaluées dans cette étude, deux espèces de type sauvage, Nico Oceana, Benham Ana et Nico Oceana Excelsior, et un hybride de Benham, Ana et Excelsior nommé Nico Oceana. Excela cultive des plantes à partir des graines dans des conditions contrôlées et une longue période de photopériode dans un système hydroponique en cascade.

Nico Oceana, Bentham Miana et Nico Oceana Excela pendant quatre à cinq semaines, et Nico Oceana Excelsior pendant cinq à six semaines. Les souches tumorales Fasion d’Agrobacterium utilisées dans cette expérience ont été transformées avec les vecteurs de lancement appropriés, comme décrit dans le manuscrit ci-joint. Pour les besoins de cette démonstration, cinq souches d’agrobactéries transformées sont utilisées.

GV 3 1 0 1, porteur d’une protéine fluorescente verte rapporteure, ou gène GFP GV 3 1 0 1, porteur du gène viral du suppresseur de silençage du virus du rabougrissement buissonnant de la tomate P 19 et A quatre GV 3 1 0 1, et a T 10. Portant le gène d’une protéine porteuse, les souches d’agrobacterium cultivent des souches d’agrobacterium pendant la nuit dans un milieu LB, complétées par 50 milligrammes par litre de mycine en conserve à 28 degrés Celsius avec agitation à 200 à 250 tr/min le lendemain. Préparer des suspensions d’agrobactéries pour les expériences souhaitées afin d’examiner la faisabilité d’utiliser plusieurs souches d’agrobactéries pour la production de protéines transitoires, diluer une souche de laboratoire et deux souches de type sauvage, hébergeant le vecteur PBI de quatre kilomètres de léchage dans de l’eau milli Q à une densité optique de 600 nanomètres de 0,5.

Pour étudier la nécessité d’induire les gènes de virulence d’Agrobacterium avant l’infiltration, d’abord centrifuger des cultures d’Agrobacterium portant le vecteur P bid 4G FP cultivées dans un milieu LB à 4 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, remettre en suspension dans un milieu d’induction MMA à une densité optique de 600 nanomètres de 0,5 et agiter à température ambiante pendant deux heures pour tester si le cône d’acétyle améliore la production de protéines transitoires, la centrifugeuse et la culture d’agrobactéries. Porteur du vecteur PBI 4G FP cultivé pendant la nuit dans un milieu LB et remis en suspension dans un tampon d’infiltration contenant un sel X ms 10 millimolaires, MES et 2 % de glucose.

Divisez la suspension cellulaire en quatre récipients. Ajoutez une concentration différente de cône d’acéto à chacune des suspensions d’agrobacterium et incubez à température ambiante pendant trois heures. Tester l’effet de la co-infiltration d’un suppresseur de silençage viral sur un mélange de production transitoire de protéines GFP.

Une culture d’agrobactérie diluée dans l’eau milli Q portant le gène GFP et une culture portant le suppresseur de silençage viral P 19 à un rapport de quatre pour un lors de l’infiltration sous vide des plantes, qui seront démontrées. Ensuite, il est essentiel de contrôler la pression du vide et la durée de l’infiltration pour infiltrer les plantes. Tout d’abord, transférez la suspension d’agrobacterium préparée dans un récipient à l’intérieur de la chambre à vide.

Ensuite, retournez la plante dans l’agrobactérie diluée et appliquez un vide de 50 à 400 millibars pendant 30 ou 60 secondes. L’infiltration optimale est appliquée régulièrement à 50 à 100 millibars pendant 60 secondes. Une fois le vide brisé, retirez les plantes de la chambre à vide, rincez-les à l’eau et cultivez-les pendant cinq à sept jours dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour la croissance avant la filtration.

Pour préparer des échantillons pour l’analyse occidentale, prélevez d’abord des échantillons de feuilles aléatoires de plantes Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior ou Nico Oceana Excela quatre à sept jours après l’infiltration ou pulvérisez les échantillons de feuilles dans de l’azote liquide en une poudre fine. Ajoutez trois volumes d’un tampon XPBS contenant 0,5 % de Triton X 100 à chaque échantillon, puis transférez l’échantillon dans un tube einor. Secouez doucement ou faites pivoter les échantillons extraits pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Faites tourner l’extrait pendant cinq minutes et recueillez la totalité des protéines solubles dans un tube einor propre. Diluez les extraits à une dilution appropriée dans un tampon d’extraction XPBS et ajoutez cinq tampons d’échantillon à une concentration finale de X. Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes avant de séparer les protéines par page SDS.

Une fois que les protéines ont été transférées sur une membrane de transfert de P immobile, la GFP est détectée à l’aide d’un antisérum polyclonal anti-GFP de lapin à une dilution de un à 5 000 dans une solution bloquante. Incuber à température ambiante pendant une heure avec un léger balancement après avoir lavé les membranes trois fois avec un X-P-B-S-T 20. Incuber avec l’anticorps anti-rage conjugué à la peroxydase de raifort et ajouter une dilution de un à 5 000 pendant une heure pour la détection de la GFP.

Par la suite, les transferts western sont traités et les intensités de bande correspondant aux protéines sont analysées comme décrit dans le manuscrit ci-joint. La détection visuelle de la fluorescence GFP dans des plantes entières transformées transitoirement est réalisée à l’aide d’une lampe UV portable à longue longueur d’onde, à l’aide d’un appareil photo numérique et d’un temps d’exposition de 15 secondes pour photographier les plantes transformées transitoirement à travers un filtre jaune huit ES 52. Obtenez des images à partir d’analyses par transfert Western à l’aide du logiciel de capture de gène sur un génome.

Quantifiez les résultats à l’aide du logiciel de l’outil génétique avec une courbe d’étalonnage basée sur un étalon GFP purifié, Nick Oceana Bentham Miana a été cultivé sur des dalles Rockwell trempées dans des engrais disponibles dans le commerce pour déterminer les conditions optimales pour la croissance des plantes et l’accumulation de biomasse. La présence de phosphore est essentielle à la germination et à la croissance de NICO Oceana. Les graines de Bentham, comme le montrent ces plantes de six semaines poussant soit dans une solution d’engrais contenant 4,8 % de phosphore, soit dans une solution d’engrais contenant 0 % de phosphore.

Les effets des milieux de croissance et d’infiltration d’agrobactéries sur la santé des plantes et la production de protéines ont été examinés en comparant la production de GFP dans la nicotiana. Plantes Hamana infiltrées sous vide avec PBI 4G FP hébergeant des cultures d’agrobactéries cultivées dans trois milieux différents. Les cultures YEB AB et LB cultivées pendant la nuit dans des milieux YEB ou LB ont été centrifugées à basse vitesse et remises en suspension dans un milieu d’induction MMA ou cultivées pendant la nuit dans des milieux YEB LB ou AB et directement diluées de un à cinq ou de un à 10 avec de l’eau Milli Q comme illustré dans ce résultat de western blot, les plantes infiltrées avec des cultures d’agrobactéries cultivées dans des milieux YEB LB ou AB et diluées avec du Milli Q. de la production moyenne de GFP à partir de cultures centrifugées et remises en suspension dans du MMA.

Par conséquent, l’eau milli Q est recommandée pour diluer les cultures d’agrobactéries pour l’infiltration des plantes et a été couramment utilisée dans des expériences ultérieures pour atteindre une densité optique à 600 nanomètres de 0,5. Ensuite, les effets de la densité de suspension cellulaire d’agrobacterium et de l’évolution temporelle sur l’expression de la cible ont été examinés. Quatre densités différentes de suspension cellulaire d’agrobacterium portant PBI 4G FP ont été évaluées et des échantillons de feuilles ont été prélevés quatre, sept et 10 jours après l’infiltration ou DPI pour l’analyse par western blot à quatre DPI, il y avait des différences notables dans la fluorescence de la GFP entre les plantes infiltrées avec différentes densités de suspension cellulaire d’agrobacterium aucune expression de GFP n’a été observée à un 600 de 0,05 à sept D-P-I-G-F-P.

La fluorescence était similaire chez les plantes infiltrées en suspension cellulaire. Des densités de 601,0 0,5 et 0,1, mais c’était des implants plus faibles infiltrés à un A 600 de 0,05 en contraste avec 10 DPI. Aucune différence dans la production de GFP n’a été observée entre les plantes infiltrées avec l’une ou l’autre des quatre densités de suspension cellulaire afin d’augmenter la diversité des souches d’agrobactéries disponibles pour la production de protéines transitoires.

Les plantes de Nicotiana Benham miana ont été infiltrées sous vide avec sept souches différentes d’agrobactéries hébergeant le vecteur KBI à quatre kilomètres de léchage. Les feuilles infiltrées ont été prélevées à sept DPI et le niveau d’expression de la kinase a été estimé par Western blot. Comme le montre ce graphique, le niveau le plus élevé de production de lisase a été atteint avec les souches GV 3 1 10, 1 A quatre et LBA 4 4 0 4 avec de légères différences.

Alors que le niveau d’expression le plus bas était avec C cinq huit, une production intermédiaire de lyase a été obtenue avec les souches a T 77, A T zéro six et une T 10, l’activité enzymatique de la lyase a été démontrée à l’aide d’un test XMO Graham. La protéine lyase bactérienne purifiée a été utilisée comme contrôle positif de l’activité enzymatique. Il est intéressant de noter que les plantes nicotiana Benham miana infiltrées avec les souches d’agrobactéries de type sauvage A quatre et T sept sept ont montré des symptômes pathologiques tels que le rabougrissement, l’élongation de l’animal et l’enroulement et l’enroulement des feuilles à sept DPI.

Les symptômes étaient légers chez les plantes de nicotiana benham infiltrées avec le type sauvage à la souche T 10. Aucun symptôme n’a été observé chez les plants de Nico Oceana Benham infiltrés par la souche de laboratoire GV 3 1 0 1. Une comparaison de la production de biomasse végétale chez les espèces de type sauvage a révélé que, dans les mêmes conditions de croissance, la biomasse foliaire la plus élevée pouvant être générée à partir de Nico Oceana Excela est environ deux fois plus élevée que celle de Nico Oceana.

La production de protéines de Benham a été examinée chez Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior et Nico Oceana Excela infiltrées avec la souche agrobacterium. GV 3 1 0 1 hébergeant PBI 4G F-P-G-F-P l’accumulation a été évaluée à sept DPI dans des feuilles entières infiltrées. L’examen visuel de l’expression de la GFP sous la lumière UV a montré une distribution uniforme de la GFP chez Nico Oceana Hamana et Nico Oceana Excela et une distribution inégale chez Nico Oceana Excelsior en raison de la difficulté d’infiltrer une surface foliaire entière de Nico Oceana Excelsior. L’analyse par transfert Western de l’accumulation de GFP dans ces feuilles infiltrées à sept DPI a montré que le niveau de GFP était plus élevé chez Nico Oceana Hamana que chez Nico Oceana Excela et Nico Oceana Excelsior le faible niveau de production de protéines chez Nico Oceana.

Excelsior est dû à une infiltration inégale et à une distribution inégale de la GFP accumulée dans la feuille collectée. Pour tester l’effet de la pression du vide sur les feuilles, les plantes de Nico Oceana Benham ont été infiltrées avec la souche d’agrobactérie, GV 3 1 0 1 hébergeant PBI 4G FP sous des pressions de vide de 400, 200, 100 ou 50 millibars avec un temps de maintien sous vide de 30 ou 60 secondes. Aucune différence dans la production de GFP et un impact négatif faible ou nul sur la santé des végétaux a été observé lorsque des pressions de vide de 5, 100 et 200 millibars ont été appliquées pendant 30 ou 60 secondes.

L’effet de la durée du vide sur l’expression de la cible a été évalué en infiltrant un appartement de plantes Nico Oceana Benham toutes les heures avec un A 600 de 0,5 de GV 3 1 0 1 hébergeant PBI 4G FP pendant huit heures. Dans la même culture d’agrobactérie que celle montrée dans ce résultat représentatif, le niveau de production de GFP était similaire en tout temps, jusqu’à huit heures, ce qui suggère que pendant cette période, l’agrobactérie conserve sa capacité à lancer un seul brin d’ADN. Depuis lors, de nombreux produits chimiques et monosaccharides ont été signalés pour améliorer la production de protéines transitoires chez diverses espèces végétales.

Cette étude a également évalué l’effet de différentes concentrations d’acéto, de crinone et de glucose. Lors de la production transitoire de la protéine GFP chez Nico Oceana Benham, Ana s’est infiltrée avec la souche agrobacterium, GV 3 1 0 1 hébergeant PBI 4G FP. Les agrobactéries ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu YEB, centrifugées et remises en suspension à un a 600 de 0,5, soit dans du MMA contenant 2 % de glucose avec de l’acétylsérone aux concentrations indiquées, soit dans du MMA contenant 200 micromolaires d’acétophénone avec du glucose aux concentrations indiquées. Comme le montre ici, aucune des concentrations testées de ces composés n’a induit une augmentation significative de la production de protéine GFP par rapport au témoin où les milieux d’induction ne contenaient ni acétophénone ni glucose.

Ensuite, l’effet de la co-infiltration d’un suppresseur de silençage sur l’expression transitoire des gènes GFP et HAC one chez Nico Oceana. Les feuilles de Benham ont été examinées avant l’infiltration de l’agrobactérie GV trois un dix une cultures hébergeant PBI 4G FP et le suppresseur de silençage viral P 19 du virus du rabougrissement buissonnant de la tomate ont été respectivement mélangés dans des rapports de un à un, deux à un, trois à un et quatre à un. Comme l’indiquent les résultats de l’analyse par transfert Western à sept DPI, la présence de P 19 n’a pas augmenté ou diminué la production de GFP chez nicotiana Benham Miana à aucun rapport de deux des suspensions d’agrobacterium.

De plus, l’effet de deux suppresseurs de silençage génique viral P 23 et P 19 sur la prévention du silençage génique post-transcriptionnel pour HAC one a été étudié. Les points de vente de l’agrobactérie portant le vecteur de lancement PBI, quatre, HAC, un et l’un des deux plasmides suppresseurs de silençage viral ont été mélangés dans un rapport de quatre pour un, respectivement, et co-infiltrés dans Nicotiana Bentham, Miana. Les échantillons de feuilles infiltrées ont été prélevés de trois à huit DPI.

Ce graphique montre les niveaux moyens d’expression de HAC 1 provenant de trois expériences, tels que déterminés par l’analyse par transfert de Western. La co-infiltration de Nico Oceana Benham avec P 23 ou P 19 a entraîné une augmentation de la production de HAC un par rapport à l’utilisation d’aucun suppresseur de silence à 60 pi. Cela suggère que P 23 et P 19 sont efficaces dans ce système.

Il a également été observé qu’en présence et en l’absence d’un suppresseur de silence, le niveau de production de la protéine HAC un commençait à diminuer à sept DPI. Cela indique que le moment du déclin de la production de protéines transitoires chez Nico Oceana Benham Miana infiltré avec le vecteur de lancement est spécifique à la cible. Enfin, la stabilité de la banque de cellules Agrobacterium est évaluée chaque année en infiltrant des plantes de nicotiana benham avec le même lot de la banque de cellules Agrobacterium pour évaluer l’accumulation de protéines.

Ces résultats représentatifs indiquent que la production de la protéine HA 1 est très stable depuis plus de trois ans. La production moyenne d’HAC un dans les plantes de Nicotiana benam est de 651 plus ou moins 49,4 milligrammes par kilogramme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer la technique d’agro-infiltration pour la production de protéines recombinantes à grande échelle, qui peuvent être utilisées pour la fabrication de vaccins sous-unitaires, d’anticorps anti-protéine théo et d’antigènes diagnostiques.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de contrôler le croisement hydroponique de la plante, d’utiliser des agrobactéries viables, de contrôler la pression et la mise sous vide et de surveiller le véhicule de l’expression des protéines. Une fois maîtrisée, la technique d’agrofiltration peut être réalisée en 24 heures si elle est réalisée correctement dans des conditions contrôlées.