Name: Démonstration dune relation linéaire entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et lhormone lutéinisante dans les extraits de cortex rénal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Découvrez la corrélation entre VEGF et LH dans les extraits de cortex rénal de bovins et porcins par ELISA. Cette méthode normalisée avance la compréhension de la physiologie rénale et des interactions hormonales.

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Les auteurs remercient Scholl's Slaughterhouse (Blissfield, MI) d'avoir fourni les reins bovins et porcins. Aucune subvention n'a été utilisée pour cette étude.

Aucun animal vivant ou expérimental n'a été utilisé pour cette étude.
1. Manipulation des tissus
<ol><li>Procurez-vous des reins entiers bovins et porcins immédiatement après l'abattage d'un abattoir. Transport sur glace jusqu'au laboratoire.</li>
	<li>À l'arrivée au laboratoire, rincer les reins avec 50 ml de phosphate glacé tamponné saline (PBS). Répétez cette étape 2x pour enlever complètement le sang.</li>
	<li>Conserver les reins sur la glace (ou réfrigéré) jusqu'à l'extraction ultérieure.</li>
</ol>2. Dissection des reins
<ol><li>Utilisez des ciseaux stériles, des forceps, un couteau et des plats Petri pour disséquer les reins et exciser la portion tissulaire requise.</li>
	<li>Préparer le tampon de lyse RIPA avant la dissection rénale. Dissoudre 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH 8,0), NP-40 (ID - GEPAL CA-630), 10% de désoxycholate de sodium, et 10% DeDS dans de l'eau double distillée, puis bien mélanger. Réfrigérer le tampon de lyse RIPA lorsqu'il n'est pas utilisé.</li>
	<li>Couper doucement le rein en deux (plan sagittal) et couper un morceau de tissu (50-70 mm2) de la région du cortex au centre du rein (pesant 80-100 mg par poids humide).</li>
	<li>Émincer le bloc de tissu en petits morceaux avec un couteau pour aider le processus d'homogénéisation.</li>
	<li>Après avoir mis élagué les tissus, les transférer dans un tube de microfuge avec 1 ml de tampon d'extraction de lyse RIPA glacé. Placer les tubes dans la glace jusqu'à l'extraction ultérieure.</li>
</ol>3. Homogénéisation des tissus
<ol><li>Étiqueter les tubes de microfuge avec des détails d'échantillon spécifiques pour la collecte des supernatants tissulaires.</li>
	<li>À l'aide d'un homogénéisateur portatif à l'aide d'une sonde stérile, puis homogénéiser les tissus pendant 1-2 min dans des conditions froides (échantillons sur le seau à glace) jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu ne soit visible.</li>
	<li>Soumettre les extraits de tissu immédiatement pour la centrifugation dans la centrifugeuse réfrigérée à 9 600 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Retirer les tubes de la centrifugeuse et les placer sur le seau à glace.</li>
	<li>Recueillir le supernatant dans un nouveau tube de microfuge étiqueté et stocker sur la glace. Jeter la boulette.</li>
	<li>Préparer des aliquots distincts des supernatants pour les essais immunosorbent liés à l'hilité Etide (ELISA) et l'analyse totale des protéines , respectivement, afin d'éviter les cycles de gel et de dégel.</li>
</ol>4. Bovine et Porcine LH ELISA Esay
<ol><li>Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans le kit ELISA (LH) de l'hormone lutéinisante disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.</li>
	<li>Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à la température ambiante (RT). Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.</li>
	<li>Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation</li>
	<li>Configurez les puits vierges sans aucune solution.</li>
	<li>Ajoutez 50 ll de norme ou d'échantillon à chaque puits (n '2), puis ajoutez 50 l de peroxidase de raifort (hrp)-conjugué à chaque puits. Ajoutez immédiatement 50 l de solution d'anticorps à chaque puits. Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 1 h à 37 oC.</li>
	<li>Laver les puits à l'œil de 1x tampon de lavage (200 l/puits) et répéter 4x.</li>
	<li>Ajouter 50 l de substrat A et 50 l de substrat B à chaque puits, et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller l'assiette et incuber pendant 15 min à 37 oC dans l'obscurité pendant 15 min.</li>
	<li>Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.</li>
	<li>Normaliser les niveaux de LH bovine et porcine en protéines totales (voir la section 6).</li>
</ol>5. Bovine et Porcine VEGF-A ELISA Esay
<ol><li>Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans les kits ELISA (facteur de croissance endothéliale vasculaire disponible dans le commerce) (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.</li>
	<li>Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à RT. Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint, et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.</li>
	<li>Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation</li>
	<li>Ajouter 100 l'échantillon ou l'échantillon à chaque puits (n '2). Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 2 h à 37 oC.</li>
	<li>Retirer le liquide dans chaque puits et ajouter 100 l de réagent de détection A à chaque puits, sceller la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.</li>
	<li>Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.</li>
	<li>Ajouter 100 l de réagent de détection B à chaque puits et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller la plaque et la couver pendant 1 h à 37 oC.</li>
	<li>Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.</li>
	<li>Ajouter 90 l de solution de substrat à chaque puits, tapoter doucement la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.</li>
	<li>Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.</li>
	<li>Normaliser les concentrations de VEGF-A bovines et porcines en protéines totales (section 6).</li>
</ol>6. Estimation totale des protéines
<ol><li>Estimer la protéine totale des extraits de rein bovin et porcin par test standard d'albumine de sérum bovin (BSA) à l'aide d'un kit commercial (voir tableau des matériaux) selon les recommandations du fabricant.</li>
</ol>7. Analyse statistique
<ol><li>Calculez l'écart moyen, médian et standard de chaque analyte.</li>
	<li>Testez la divergence de la distribution de l'échantillon par rapport à l'utilisation normale du test Kolmogorov-Smirnov pour décider, sur utilisation, entre paramétrique et. tests statistiques non paramétriques. Si les données sont normalement distribuées, effectuez des tests statistiques par des tests paramétriques.</li>
	<li>Dans des circonstances appropriées (comme la distribution normale des données), utilisez des modèles de régression pour examiner la relation linéaire entre LH et VEGF-A.</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
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<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
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<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
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<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
<li>Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+vitreous+fluid+analysis+in+the+translational+research+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy.</a> Mediators of Inflammation. , 872978(2012).</li>
<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

Zietchick Research Institute (ZRI) est un institut de recherche privé (à but lucratif), et le Dr Tammy Movsas (fondateur et directeur de ZRI) a une demande de brevet en instance et des brevets validés pour l'utilisation d'antagonistes de la gonadotropine dans le traitement des maladies oculaires et le diabète. En plus d'être un employé (biochimiste) à ZRI, le Dr A. Muthusamy n'a pas d'autres conflits financiers à signaler. A. Arivalagan (stagiaire d'été à L'IRZ, étudiant de premier cycle à l'Université du Michigan) n'a pas d'autres conflits financiers à signaler.

L'aveux des reins de l'abattoir immédiatement après la mort animale est la clé du succès de cette méthodologie. C'est le principal avantage d'utiliser des organes de vaches et de porcs au lieu de cadavres humains. Il y a habituellement au moins un retard de 12-24 h à partir du moment de la mort jusqu'à ce que les organes humains de cadavre soient achetés. Puisque la composition chimique des organes corporels change de manière significative dans 2 h post-mortem15,16</su...

Le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGF-A), aide à réguler l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein et d'autres organes1,2 (ci-après, VEGF-A sera appelé VEGF). Les niveaux de VEGF dans le rein sont sous contrôle homéostatique serré. Lorsque les niveaux rénaux de VEGF sont élevés ou déprimés, le rein peut dysfonctionnement. Par exemple, dans les 3 semaines suivant la naissance, les souris avec l'hétérozygosity podocyte-spécifique pour VEGF développent l'endotheliosis et le glomeruli sans sang (c.-à-d., lésions rénales vues dans la preeclampsia humaine), et l'échec rénal de phase finale se produit dans ces heterozygotes par 3 mois d'âge. Les ko homozygotiques spécifiques aux podocytes meurent d'hydrops et d'insuffisance rénale dans un délai de 1 jour après la naissance3,4.
D'autre part, la surexpression de VEGF rénal provoque la protéinurie et l'hypertrophie glomerulaire3,4. Par exemple, les lapins transgéniques qui surexpriment veGF présentent des proteinuria progressives avec des taux de filtration glomerulaires accrus aux premiers stades de la néphropathie, suivis d'une diminution des taux de filtration glomerulaire s'est accentué aux stades plus avancés3. La néphropathie diabétique, une cause majeure de la maladie rénale de phase finale dans les adultes diabétiques, est fortement associée à la dysregulation de VEGF2,5. Une grande attention a été accordée au rôle de l'hypoxie dans l'induire l'expression de VEGF dans des conditions pathologiques5. Cependant, les facteurs régissant le VEGF dans des conditions physiologiques (tant dans le rein que dans d'autres organes) ne sont pas bien compris2,6. L'identification de ces facteurs (à l'exception de l'oxygène) qui sont impliqués dans la régulation physiologique et pathologique du VEGF est une entreprise importante.
L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs tels que l'ovaire et le testicule7,8. Des études antérieures ont fourni des preuves que LH aide également à réguler VEGF dans les organes non reproductifs, tels que les yeux6,9,10. Les récepteurs de LH se trouvent dans la médulle et le cortex du rein11,12. A noter, les cellules épithéliales tubulaires rénales, ainsi que le récepteur LH, expriment VEGF11,12,13,14. Prenant ces deux observations ensemble, nous avons supposé que LH aide également à réguler l'expression VEGF dans le rein13,14. Pour fournir l'évidence de cette relation de LH/VEGF, le protocole présenté vise à montrer que les niveaux de LH sont capables de prévoir des niveaux de VEGF dans le rein. De nombreuses enquêtes antérieures sur le VEGF concernant le rein ont utilisé des modèles de mammifères d'ordre inférieur (c.-à-d. rongeurs et lapins)2. Pour traduire ce travail sur le corps humain, l'étude examine la relation entre le VEGF et le LH chez les mammifères de plus haut niveau (ici, les modèles bovins et porcins). Pour atteindre cet objectif, le lysate protéique total a été préparé à partir de la région du cortex des reins bovins et porcins.

<table><tbody><tr><td>Kit ELISA LH bovin</td><td>MyBiosource, San Diego, CA.</td><td></td><td></td>MBS700951</tr><tr><td>Kit ELISA VEGF-A bovin</td><td>MyBiosource, San Diego, CA.</td><td></td><td></td>MBS2887434</tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA LH porcin</td><td>MyBiosource, San Diego, CA.</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>Porcine VEGF-A ELISA</td><td>Ray Biotech, Norcross, GA.</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse et d’extraction RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>Référence 89901</td><td></td></tr></tbody></table>

démonstration d'une relation linéaire entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans les extraits de cortex rénal

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) aide à commander l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein. Les désordres rénaux, tels que la néphropathie diabétique, sont associés à la dysrégulation de VEGF dans le rein. Les facteurs qui régissent VEGF dans des conditions physiologiques dans le rein ne sont pas bien compris. L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs. Étant donné que les récepteurs LH se trouvent dans le rein, nous, à l'Institut de recherche Zietchick, présumé ici que LH contribue également à réguler l'expression VEGF dans le rein ainsi. Pour fournir des preuves, nous avons cherché à montrer que les niveaux de LH sont en mesure de prédire les niveaux de VEGF dans le rein des mammifères. La plupart des enquêtes liées au VEGF impliquant le rein ont utilisé des mammifères de moindre ordre comme modèles (c.-à-d. rongeurs et lapins). Pour traduire ce travail au corps humain, il a été décidé d'examiner la relation entre veGF et LH chez les mammifères de plus haut niveau (c'est-à-dire les modèles bovins et porcins). Ce protocole utilise le lysate protéique total du cortex rénal. Les clés du succès de cette méthode comprennent l'approvisionnement en reins d'animaux d'abattoir immédiatement après la mort ainsi que la normalisation des niveaux d'analytes (dans l'extrait de rein) par protéine totale. Cette étude démontre avec succès une relation linéaire significative entre LH et VEGF dans les reins bovins et porcins. Les résultats sont reproductibles chez deux espèces différentes. L'étude fournit des preuves à l'appui que l'utilisation d'extraits de rein de vaches et de porcs sont une ressource excellente, économique et abondante pour l'étude de la physiologie rénale, en particulier pour examiner la corrélation entre veGF et d'autres analytes.

Les niveaux moyen et médians de LH et de VEGF par type d'animal et par sexe sont indiqués dans le tableau 1. Après vérification de la normalité des données par Kolmogorov-Smirnov Test de la normalité, des modèles de régression linéaire ont été utilisés pour examiner la relation entre LH et VEGF. LH s'est avéré être un prédicteur fort et significatif de VEGF dans les reins bovins et porcins (modèle bovin de rein : n ' 7, R2 - 0,86, p - 0,002 ; modèle porcin de r...

Présenté ici est un protocole pour l'utilisation d'une préparation corticale d'extrait de rein et de normalisation totale de protéine pour démontrer la corrélation entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans le rein de mammifères.

Démonstration d'une relation linéaire entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans les extraits de cortex rénal

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Notre protocole observe que l’utilisation d’extraits rénaux de vaches et de porcs est une excellente ressource économique pour l’étude de la physiologie rénale, en particulier l’examen de la corrélation entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et d’autres analytes. Il a toujours été difficile de corréler vegf, un facteur de croissance essentiel dans l’angiogenèse des organes, avec d’autres protéines. Cette technique nous permet d’examiner l’association entre vegf et analytes tels que les hormones.Cela fera certainement progresser notre base de connaissances concernant cet important facteur de croissance. Cette méthode peut être utile pour corréler d’autres analytes dans les extraits corticals rénaux en plus de ceux mentionnés dans cette vidéo. La démonstration visuelle aidera les autres à obtenir des résultats reproductibles sans aucune erreur d’échantillonnage.L’utilisation de tissus frais est essentielle au succès de cette technique. Il est important d’obtenir des reins entiers frais immédiatement après l’abattage auprès d’un animal. Toujours transférer le tissu au laboratoire sur la glace.Utilisez des ciseaux stériles, des forceps, un couteau et des boîtes de Pétri pour disséquer les reins et exciser la partie tissulaire requise. Couper doucement le rein en deux le long du plan sagittal et couper un morceau de tissu de la région du cortex au centre du rein. Hacher le tissu en petits morceaux avec le couteau et le transférer dans un tube de microfuge avec un millilitre de glace froide 1X RIPA tampon d’extraction de lyse.Étiquetez le tube avec des détails spécifiques de l’échantillon et placez-le sur la glace. Utilisez un homogénéiseur portatif avec une sonde stérile pour homogénéiser le tissu pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’aucun morceau ne soit visible, puis centrifugez immédiatement le tube à 9 600 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, préparer des aliquots distincts de l’échantillon pour l’ELISA et l’analyse totale des protéines afin d’éviter de multiples cycles de gel/dégel.Avant de commencer l’analyse, amener tous les reagents et la plaque d’essai à température ambiante en enlevant les puits excédentaires et en les stockant à quatre degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. Diluer le tampon de lavage 20X à 300 millilitres avec de l’eau distillée double et installer les puits vierges sans aucune solution. Ajouter 50 microlitres de norme ou d’échantillon et 50 autres microlitres de peroxydase de raifort conjugués à chaque puits, puis ajouter immédiatement 50 microlitres de solution d’anticorps à chaque puits et sceller la plaque.Mélanger l’assiette et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, laver chaque puits avec 200 microlitres de tampon de lavage. Ajouter 50 microlitres de substrat A et substrat B à chaque puits, mélanger délicatement la plaque en tapant sur le côté, puis sceller et l’incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.Ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits. Appuyez doucement sur la plaque et lisez l’absorption à 450 nanomètres avec un spectrophotomètre. Préparer les réaccentrages et laver le tampon tel qu’il a été décrit précédemment, puis ajouter 100 microlitres de norme ou d’échantillon à chaque puits, sceller la plaque, bien mélanger et l’incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Retirer le liquide dans chaque puits et ajouter 100 microlitres de réaccent de détection A.Seal la plaque et l’incuber pendant une autre heure. Ensuite, lavez chaque puits avec 400 microlitres de tampon de lavage, puis ajoutez 90 microlitres de solution de substrat à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et incubez-la pendant une autre heure à 37 degrés Celsius. Après la dernière incubation, ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez l’absorption à 450 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre.Estimer la protéine totale des extraits de rein bovin et porcin avec un test BSA standard et utiliser cette estimation pour normaliser les résultats de LH et VEGF-A-ELISA. Les niveaux moyen et médian de LH et de VEGF ont été calculés pour les animaux et les sexes. Après vérification de la normalité des données, des modèles linéaires de régression ont été utilisés pour examiner la relation entre LH et VEGF.LH s’est trouvé pour être un prédicteur fort et significatif de VEGF dans les reins bovins et porcins. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler d’échantillonner des zones identiques dans chaque tissu. Une procédure similaire peut être utilisée pour extraire n’importe quel type de tissu.N’oubliez pas de normaliser les analytes par extrait total de protéines de n’importe quel tissu que vous utilisez.

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Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Un bioessai simple pour l&#39;évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

Ce manuscrit décrit un test de formation de tubes pour quantifier les effets d’un composé ou d’une condition donnée sur l’angiogenèse en utilisant la formation de tubes de cellules endothéliales dans un environnement contrôlé.

Stratégique des cellules endothéliales Tube Formation Assay: Comparaison matrice extracellulaire et le facteur de croissance réduit la matrice extracellulaire

L'administration de médicaments pour la récupération de la fonction rénale nécessite un contrôle de la localisation et la distribution du composé thérapeutique. Ici, nous décrivons en détail une technique simple pour la livraison intrarenal de médicaments chez les rats. Cette procédure peut être facilement réalisée sans la mortalité et une reproductibilité élevée.

Livraison intravasculaire de produits biologiques du rein de rat

Ce protocole décrit une marche à suivre complète rein qui devrait être effectué dans des modèles murins de la maladie glomérulaire. Les méthodes permettent d’analyse fonctionnelle et structurelle mécaniste détaillée de la fonction glomérulaire, qui peut être appliquée à tous les modèles murins de la maladie glomérulaire.

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

Nous présentons ici un protocole de prélèvement de sang de la queue-extrémité pour prélèvement fréquents chez les souris sans retenue. Cette méthode est utile pour évaluer des modèles de la sécrétion pulsatile de LH et pourrait être adaptée pour l’analyse d’autres facteurs circulants.

Fréquente la queue-extrémité prélèvements chez les souris pour l’évaluation de la sécrétion de l’Hormone lutéinisante Pulsatile

L’hormone folliculo-stimulante (FSH) dans divers tissus et organes extragonadiques est associée à la pathogenèse de multiples maladies. Le modèle de souris ovariectomisé et traité à la FSH (OVF) peut être utilisé pour explorer les actions extragonadiques de la FSH.

Exploration des effets indépendants de l’hormone folliculo-stimulante in vivo dans un modèle murin

Ici, nous présentons des protocoles qui détaillent les instructions pour la mise en œuvre de cultures cellulaires 3D utilisant des matrices de collagène et de collagène-agarose dans un système microphysiologique. Ces protocoles prennent en charge la co-culture de sphéroïdes de tubule proximal rénal et de carcinome rénal, simulant des conditions in vivo et permettant une investigation avancée des interactions entre les cellules cancéreuses du rein.

Co-culture microfluidique d’épithélium rénal sain et tumoral pour modéliser la progression du cancer du rein

Cette vidéo montre deux méthodes de préparation et de placer des perles, qui ont été revêtues d'un facteur de croissance, sur des explants du cortex cérébral de développement. Ces perles peuvent être utilisées pour induire l'expression des gènes dans l'espace restreint sur le développement du tissu neural comme explants prosencéphale. Les méthodes sont donnés pour l'utilisation de deux Affi-Gel perles et perles acrylique héparine.

Facteur-Coated Croissance Placement billes sur des explants du cerveau antérieur dorsal

Une variété de facteurs de croissance et les protéines interagissent pour induire les cellules à prendre sur le destin des cellules différentes lors du développement. Ici nous démontrons l'utilisation d'un en préparation pour répondre ovo interactions possibles entre les différentes protéines dans le développement en plaçant des perles sur E2.5 embryons de poulet.

Placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène

Nous décrivons la préparation de facteur de croissance des lymphocytes T utilisée pour l'expansion in vitro de l'antigène spécifique de lignes T lymphocytes de rats.

Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Découvrez la corrélation entre VEGF et LH dans les extraits de cortex rénal de bovins et porcins par ELISA. Cette méthode normalisée avance la compréhension de la physiologie rénale et des interactions hormonales.

Démonstration dune relation linéaire entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et lhormone lutéinisante dans les extraits de cortex rénal (Vidéo) | JoVE Journal

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