Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Bonjour, je m’appelle Christine Beaton. Je suis chercheur adjoint dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l’Université de Californie à Irvine. Et dans les deux prochains jours, je vais vous montrer comment préparer le TCGF, qui signifie facteur de croissance des lymphocytes T.

Ainsi, pour notre culture cellulaire quotidienne, lorsque nous n’avons pas besoin d’une connaissance précise de la composition des cytokines dans le milieu de culture, nous utilisons le facteur de croissance des lymphocytes T, qui est le surnageant S de la culture spl CY qui contient les cytokines nécessaires pour aider les lymphocytes T à se développer. Donc, la façon dont nous préparons le TCGF, c’est que lorsque nous tuons des rats Louis en bonne santé, nous prenons leur rate, préparons une suspension unicellulaire, nous nous débarrassons des globules rouges en les choisissant, puis les cellules mononucléées que nous allons stimuler avec con carnaval in a, ce qui va induire les lymphocytes T à produire toutes les cytokines nécessaires à leur croissance. Pour générer le TCGF, nous devons activer les cellules.

Donc, la façon dont nous le faisons est que nous allons ajouter la lectine conval dans un abrégé en corona A à notre culture cellulaire. Ainsi, lorsque nous ajoutons le conc dans a à notre culture cellulaire, il va se lier au complexe récepteur des lymphocytes T glycosylés et se lier à plusieurs complexes en même temps, il va faire ce que nous appelons le coiffage. Il va donc s’agréger, former un cluster de tous les récepteurs à la surface de la cellule et cela va induire un signal d’activation dans les lymphocytes T.

Donc, une fois que les cellules se sont activées, elles vont exploser. Ils vont donc grossir et ensuite ils vont commencer à sécréter des cytokines. Donc, à l’origine, nous pensions que TCGF était principalement l’interleukine deux, mais nous savons maintenant que ce n’est pas vraiment le cas.

Il contient également de l’interféron gamma, du TNF alpha et probablement aussi des cytokines en très petites quantités qui sont juste nécessaires pour maintenir les cellules en vie après 48 heures. En culture, les cellules ont produit toutes les cytokines dont nous avons besoin. Nous allons donc retirer les cellules et lorsque nous avons retiré les cellules et que nous n’avons que le surnageant, nous avons encore du conal libre dans a dans le snat. Et cela va être un problème parce que nous voulons vraiment utiliser notre facteur de croissance des lymphocytes T pour maintenir la croissance des lignées de lymphocytes T.

Et si nous laissons le conval dans un espace libre là-dedans, il va activer les cellules alors que nous ne voulons pas qu’elles soient activées. Donc, pour contourner ce problème, nous allons ajouter un excès de sucre qui va se lier à tout le contenu libre dans a, dans l’ate. Il sera donc complètement inactivé et ne se liera pas à d’autres récepteurs glycosylés sur les cellules lorsque nous ajoutons le TCGF à la culture.

Alors commençons. La première étape de cette expérience consiste à retirer la rate du rat juste après l’euthanasie. C’est donc ce que je vais faire tout de suite en utilisant des instruments stériles.

Et une fois que j’aurai enlevé la rate, je vais les mettre dans du PBS complété par des antibiotiques et comme antibiotiques, j’utilise de la pénicilline et de la streptomycine. Alors commençons. Je pulvérise donc le rat avec de l’éthanol à 70 % pour m’assurer que je n’ai pas une grande contamination de ma culture.

Et puis, à l’aide de mes instruments, je vais faire une petite incision dans la peau ici. Ensuite, j’enlève une couche de muscle et la rate apparaît ici. Alors je prends d’autres pinces à épiler, je retire doucement la rate sans l’abîmer.

J’enlève le tissu conjonctif de connexion comme ça. Alors maintenant, j’ai une rate. Bien sûr, je fais très attention à ne rien endommager d’autre à l’intérieur de la cavité abdominale, car tout dommage à l’intestin entraînera une contamination immédiate de ma rate.

Ensuite, je vais transférer ma rate dans un tube contenant du PBS et des antibiotiques. Et ce tube, je le garde sur la glace. Alors maintenant, j’ai récolté la rate de trois rats.

Nous sommes donc prêts à préparer une suspension unicellulaire à partir de ces rates. Alors maintenant que j’ai mes rates, je les ai amenées dans une cagoule de culture tissulaire pour préparer une suspension unicellulaire à partir d’elles à l’aide d’entraîneurs de cellules de 70 microns. Je vais donc avoir besoin de plusieurs choses pour fabriquer la suspension unicellulaire à partir de la rate.

J’ai besoin d’instruments stériles, d’une paire de pinces et d’une paire de ciseaux. Ensuite, j’ai le piston d’une seringue stérile d’un mil dans la boîte de Pétri. Je vais mettre ma rate dans PBS plus des antibiotiques.

Et dans une autre boîte de Pétri, j’ai mis une passoire cellulaire de 70 microns dans 10 millilitres de PBS plus des antibiotiques. La première étape consiste donc à s’assurer que les rates sont propres, car comme vous pouvez le voir ici, il y a encore de petits morceaux de tissu conjonctif et je vais les enlever parce qu’ils vont obstruer la crépine cellulaire très rapidement. Donc, pour cela, je coupe simplement ce que je ne veux pas et je le jette dans le couvercle de la boîte de Pétri.

Alors maintenant, mes rates sont presque propres, donc je vais prendre les rates une par une, les mettre dans l’entraîneur de cellules et les couper en petits morceaux Et je mélange les trois pleens. L’étape suivante consiste à fabriquer une suspension à cellule unique. Alors bien sûr, comme je veux que tout soit plus dur, je ne touche pas du tout à l’entraîneur de cellules et j’utilise le piston d’une seringue stérile d’un mil pour presser mes morceaux de rate à travers l’entraîneur de cellules.

Et comme vous pouvez le voir à l’extérieur de l’entraîneur de cellule, j’ai une suspension à cellule unique en cours de fabrication. Donc, la première fois, j’ai encore quelques petits morceaux de rate, mais je vais déjà retirer la suspension à cellule unique. Je l’ai déjà transféré dans un tube de 50 mil que j’ai stocké sur de la glace.

Et je vais remplir ma passoire cellulaire avec 10 mils supplémentaires de PBS et d’antibiotiques. Donc, je prends 10 mils de plus de mon PBS avec des antibiotiques environ, il n’est pas nécessaire que ce soit très précisément 10 minutes, nous ne faisons que nous laver. Je le mets dans la passoire de la cellule et j’utilise ensuite la même procédure.

Je retourne à mon piston de seringue et j’appuie un peu plus sur l’ocid. Donc, bien sûr, vous n’arriverez jamais à tout faire parce qu’il y a du tissu conjonctif et de petits morceaux de graisse que je n’ai pas pu enlever et qui vont rester dans la passoire cellulaire. Mais vous devriez obtenir la majorité de votre rate pour la crépine cellulaire.

Et puis je répète exactement ce que j’ai fait plus tôt. Je vais récolter ma suspension à cellule unique et l’ajouter à la même dent. À présent, il ne reste presque plus rien de l’écran dans le filtre cellulaire et le PBS qui sort est beaucoup plus clair Et je vais simplement laver une fois de plus et nous devrions avoir la plupart des cellules sorties maintenant.

Alors maintenant, j’ai ma suspension unicellulaire de cytes PLE et je vais les faire tourner simplement pour les paletter. Donc, tourner pendant huit à 10 minutes suffira. Alors maintenant, nous avons fait tourner nos cytes PLE et nous avons une belle palette.

Donc, ce que je vais faire, c’est me débarrasser du surnageant et je vais ensuite mentir les globules rouges. Je vais donc suspendre les myocytes et je vais prendre du chlorure d’ammonium. Il s’agit donc d’une SU, une solution de chlorure d’ammonium de 15 molaires, et je vais utiliser cinq millilitres par rate.

Donc, comme j’avais trois rates, je vais utiliser 15 millilitres de chlorure d’ammonium et je vais le faire sur de la glace. Donc, pour trouver les érythrocytes, je vais doucement le faire monter et descendre pendant trois minutes. D’accord, nous allons utiliser cette prise avec l’exposition la plus élevée ici.

J’ai donc analysé les électrocytes pendant trois minutes. Je vais remplir mon tube avec du PBS ou vous pouvez également utiliser du moyen. Il s’agit de ramener l’osmolarité de la solution à la normale pour les cellules.

Et je vais faire tourner les cellules comme je l’ai fait précédemment pendant huit à 10 minutes pour les granuler. Et puis je les laverai deux fois en utilisant le même PBS avec des antibiotiques. Alors maintenant, nous étendons les cellules après avoir éliminé les électrocytes et ne vous inquiétez pas, nous n’obtenons jamais une libération à cent pour cent des électrocytes.

Ainsi, la palette sera toujours rouge, mais le surnageant sera plus clair. Et maintenant, je vais vider le surnageant, casser la palette, ajouter du PBS jusqu’à 50 mil, tourner vers le bas et répéter cette étape une fois de plus pour que j’aie deux lavages Et puis je pourrai me compter. J’ai lavé les myocytes deux fois, puis je les ai suspendus dans un milieu de culture et je les ai comptés à l’aide de votre cytomètre.

comme prévu. De trois rates, j’ai obtenu environ 600 millions de cellules, ce qui est attendu puisqu’une rate nous donne normalement 200 à 250 millions de cellules. Donc, ce que je vais faire maintenant, c’est que je vais ensemencer mes cellules à 2 millions par moulin dans mon milieu qui a été complété par 10 % de sérum calaire fœtal.

Et à ce milieu, je vais ajouter deux microgrammes par moulin de conc A pour stimuler les cellules. Et après cela, je vais simplement mettre les cellules dans l’incubateur pendant 48 heures. Les cellules sont maintenant dans l’incubateur depuis 48 heures et, comme je vais vous le montrer, elles ont assez bien grandi.

Le support est devenu orange. Nous sommes donc maintenant prêts à terminer notre préparation pour le TCGF. Comme vous vous en souvenez, j’ai ajouté con carnaval dans une suspension dans ma cellule pour activer les cellules.

Donc, le con carnaval dans a est la lectine. Il va lier les sucres sur tous les récepteurs de la cellule T et il va activer artificiellement toutes ces cellules. Le problème que nous avons maintenant, c’est que nous avons encore une partie du carnaval dans a, dans la cellule S surnageant.

Et puisque nous allons utiliser un piège dans d’autres cultures de cellules T pour développer les cellules, nous ne voulons pas que le con carnaval soit présent dans ces cultures cellulaires. Donc, pour m’en débarrasser, ce que je vais faire, c’est ajouter un excès de sucre auquel le contenu dans un se lie, et c’est le méthyle alpha D cyte montré ici. Et je vais ajouter un excès de ce sucre pour le dissoudre complètement.

Et une fois que c’est fait, je vais filtrer stérilement mes surnageants cellulaires et je vais congeler les liquides Ali pour les utiliser dans les prochaines semaines ou les prochains mois. Commençons donc pour cette dernière étape. J’ajoute donc mon surnageant de culture cellulaire à des tubes de 50 mil pour pouvoir les faire tourner et me débarrasser des cellules.

Donc, je remplis simplement autant de tubes que nécessaire et je ne le fais pas dans la hotte de culture, je le pourrais, mais comme j’ai besoin de n’importe quel moyen de filtrer ma, ma solution à la fin parce que j’ajoute le sucre, qui n’est pas stérile, je le fais simplement sur la paillasse. C’est plus facile. J’ai maintenant versé toutes mes cellules et mon surnageant dans mes tubes de faucon de 50 mil.

Je vais donc les amener à la centrifugeuse et les faire tourner pendant environ 10 minutes. Et la seule raison de les faire tourner est de granuler les cellules pour que j’aie des surnageants clairs. Les cellules ont maintenant été descendues, donc le surnageant est clair et c’est ce que je voulais collecter.

Je vais donc rassembler tout le surnageant dans une fiole propre de 150 centimètres carrés. Et dans cette fiole, je vais ajouter le sucre. Donc, pendant que les cellules tournaient, j’ai pesé suffisamment de sucre pour ajouter 15 milligrammes par ml de surnageant.

Je vais le laisser complètement se dissoudre, et après cela, je vais filtrer stérilement mon surnageant. Alors maintenant, je vais ajouter le sucre 15 milligrammes par ml de surnageant. Je remets le capuchon et comme je ne travaille pas dans des conditions stériles, peu importe si ate va dans le bouchon, alors je mélange jusqu’à ce que tout le sucre soit dissous.

Cela devrait être assez rapide. Oui, tout le sucre est dissous maintenant. Donc, tout ce que j’ai à faire est que le filtre stérile est surnageant, puis je vais l’aliquoter.

Donc, normalement, je fais des aliquotes de 10 à 15 mil que je stocke à moins 20 degrés. Des aliquotes comme celle-ci peuvent être stockées pendant plusieurs mois. Vous pouvez également conserver votre TCGF au réfrigérateur, mais je l’utiliserais ensuite dans les 10 à 15 prochains jours.

Au cours des deux derniers jours, je vous ai montré comment préparer le facteur de croissance des lymphocytes T, et ce surnageant est très simple à fabriquer et il est très bon marché à préparer. Nous l’utilisons donc très souvent en laboratoire pour maintenir nos lignées de lymphocytes T en culture sans avoir à acheter des cocktails coûteux de cytokines. Alors bonne chance pour vos expériences.