Name: Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Apprenez à préparer le facteur de croissance T à partir de splénocytes de rat. Cette méthode utilise la concanavaline A pour stimuler les cellules et produire des cytokines essentielles à la culture des lymphocytes T.

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<ol><li> Prenez rate rat Lewis (rats entre 160-200g sont les meilleurs). Dilacerate sur la glace dans une boîte de Pétri contenant du PBS + antibiotiques (PBS-PS) à l&#39;aide d&#39;une passoire cellule. Mettre dans un tube de 50 ml. Remplir avec du PBS-PS. </li><li> Spin pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Laver les cellules deux fois. </li><li> Reprendre le culot dans NH 4 Cl 0,15 M (5 ml par la rate). Mélanger doucement et en continu avec une pipette pendant 3 min sur la glace pour lyser les érythrocytes. Remplir le tube avec milieu. </li><li> Spin pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Laver les cellules deux fois. </li><li> Compter les cellules. Une rate de rats donne de 200 à 250.000.000 cellules. </li><li> Ensemencer les cellules à 2 millions par ml dans un milieu complet: 50 ml par flacon de 75 cm2. </li><li> Laissez pousser pendant 48 heures dans l&#39;incubateur. </li><li> Spin 15 min à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Recueillir le surnageant et jeter les cellules. </li><li> Ajouter 15 mg / ml de méthyle à une mannoside le surnageant. Mélanger soigneusement. </li><li> Filtre (0,2 mm) </li><li> Aliquoter et conserver à -20 ° C. Peut être conservé à 4 ° C pendant 10 jours si nécessaire. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Nous préparons TCGF à partir de splénocytes de rats Lewis, depuis nous avons régulièrement euthanasier les rats naïfs de cette souche à la récolte de sérum et de stimuler la thymidine Lewis lignes rat cellules T in vitro. Cette TCGF peut être utilisé pour promouvoir la croissance et la survie des lignées de cellules T à partir de souches de rats d&#39;autres. TCGF peuvent aussi être préparés à partir d&#39;autres souches de rats.

Pour préparer le milieu de culture complet ajoutez la ligne suivante à une bouteille de 500 ml de RPMI 1640 et stérile filtre: FCS 10%, 1 bouteille de PSG; 5 ml de RPMI vitamines, 5 ml de pyruvate de sodium; 5 ml non acides aminés essentiels; 50 uM bêta-mercaptoéthanol; 2 ug / ml concanavaline A.

préparer t facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Entretien des lignes spécifiques de l&#39;antigène des cellules T ou de clones en culture exige tours de l&#39;antigène de l&#39;activation induite séparées par des phases d&#39;expansion de 1,2 cellule. Ajout de l&#39;interleukine 2 au milieu de culture pendant la phase d&#39;expansion est nécessaire pour prévenir la mort cellulaire et suffisantes pour maintenir à court terme des lignées de cellules T, mais a été montré pour augmenter la polarisation Th1 3. Remplacement de l&#39;interleukine 2 par le facteur de croissance des cellules T (TCGF) qui contient un mélange de cytokines est plus efficace que l&#39;interleukine 2 dans le maintien à long terme des lignées de cellules T in vitro 3. Par ailleurs, TCGF peut facilement être préparé en grandes quantités dans le laboratoire et est beaucoup moins cher que interleukine 2. Ici, nous montrons comment préparer TCGF à partir de surnageants de culture de splénocytes de rats. Pour cette procédure, nous récoltons les rates de rats Lewis naïve euthanasiés pour le thymus et la collecte de sang. Nous préparons une seule cellule suspensions à partir des rates, lyser les globules rouges par choc osmotique, et les graines des splénocytes en milieu de culture. Les cellules sont stimulées par la concanavaline A, un mitogène que les non-sélective active tous les lymphocytes T chez le rat, induisant la production de cytokines. Le surnageant de culture sont recueillies 48 heures plus tard andexcess concanavaline A est lié à l&#39;alpha méthyl mannoside pour l&#39;empêcher d&#39;activer lignées de cellules T à laquelle TCGF sera ajouté. Le TCGF est alors une filtration stérile, aliquotés et conservés à -20 ° C.

Nous décrivons la préparation de facteur de croissance des lymphocytes T utilisée pour l&#39;expansion in vitro de l&#39;antigène spécifique de lignes T lymphocytes de rats.

Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

Le maintien en culture de lignées ou de clones de lymphocytes T antigène-spécifiques nécessite des cycles d'activation induite par l'antigène séparés par des phases d'expansion cellulaire 1,2. ...

Bonjour, je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Au cours des deux prochains jours, je vais vous montrer comment préparer le TCGF, acronyme de T cell growth factor.Ainsi, pour notre culture cellulaire courante, lorsque nous n'avons pas besoin de connaître précisément la composition en cytokines du milieu de culture, nous utilisons un facteur de croissance pour les lymphocytes T, appelé surnageant TCGF provenant d'une culture de rate de souris Louis, qui contient les cytokines nécessaires au développement des lymphocytes T. La préparation du TCGF consiste à sacrifier des rats Louis sains, à prélever leurs rates, à préparer une suspension monocellulaire, à éliminer les globules rouges par lyse, puis à stimuler les cellules mononucléées avec de la concanavaline A, ce qui induit les lymphocytes T à produire toutes les cytokines nécessaires à leur croissance. Pour générer le TCGF, nous devons activer les cellules.La méthode que nous utilisons consiste à ajouter de la lectine conval, abrégée en corona A, à notre culture cellulaire. Lorsque nous ajouto

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Apprenez à préparer le facteur de croissance T à partir de splénocytes de rat. Cette méthode utilise la concanavaline A pour stimuler les cellules et produire des cytokines essentielles à la culture des lymphocytes T.

Préparer T facteur de croissance cellulaire à partir de splénocytes de rat

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