In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

Notre protocole permet la création d’enzymes de restriction avec des spécificités de séquence modifiées et plus strictes utilisant la compartimentation in vitro et une stratégie de sélection unique dans l’évolution dirigée. Potentiellement, il est tout à fait universel, car il devrait s’appliquer à toute restriction endonuclease et la sélection peut être dirigée vers toute version plus rigoureuse d’une séquence cognate originale. Si les variantes nouvellement créées sont exprimées par transcription-traduction in vitro, le protocole convient non seulement pour affiner la spécificité, mais aussi pour modifier la spécificité.

Pour décider des sites de mutagenèse de subsaturation, choisissez des fréquences de mutagenèse en fonction de l’importance hypothétique des sites, en gardant à l’esprit les limites de la complexité globale de la bibliothèque. Pour commencer la synthèse, insérez des colonnes qui ont été emballées avec de la nouvelle résine dans le synthétiseur. Synthétiser les oligonucléotides dans toutes les colonnes jusqu’au triplet, immédiatement avant le deuxième site de mutagenèse de sous-saturée comptant à partir de l’extrémité à trois premiers.

Synthétiser, laissant un groupe trityl à cinq premiers à la fin. Le groupe protecteur sera supprimé au début du prochain cycle de synthèse. Ouvrez les colonnes de synthèse et centrifugez brièvement dans des tubes secs de 1,5 millilitre pour recueillir la résine.

Tirez le support de synthèse CPG et mélanger par vortex. Re-partitionner la résine mixte CPG en nouvelles colonnes de synthèse. Évitez d’introduire l’humidité parce qu’elle diminuera le rendement global.

Poursuivre la synthèse, à partir du triplet du site de mutagenèse de sous-saturation. Attribuez des colonnes à des triplés NNS randomisés ou à des triplés de type sauvage selon la fréquence de mutagenèse souhaitée. Si d’autres sites de subsaturation sont présents, ne procéder qu’au triplet précédant le prochain site de mutagenèse de sous-saturé.

Si aucun autre emplacement de sous-saturé n’est présent en aval, complétez la synthèse, laissant un groupe trityl à cinq premiers à la fin. Utilisez de larges pointes de pipette de forage pour préparer un mélange de surfactant à l’huile en ajoutant 225 microlitres de Span 80 et 25 microlitres de Tween 80 à 5 millilitres d’huile minérale dans un tube conique de 15 millilitres. Bien mélanger par inversion douce 15 fois.

Le mélange à cette étape doit être translucide. Pour chaque bibliothèque, transférer 950 microlitres du mélange de surfactant à l’huile sur un flacon cryogénique rond de deux millilitres. Étiquette avec un nom de bibliothèque et transfert sur la glace.

Mettre une petite barre cylindrique en remuant dans chaque flacon. Préparez un mélange de réaction transcription-traduction in vitro selon les suggestions du fabricant. Compléter le mélange avec du chlorure de magnésium à une concentration finale de 1,5 millimolar.

Distribuez 50 microlitres aliquots du mélange de réaction en tubes de 1,5 millilitre sur la glace. Ajouter 1,7 femtomoles de la bibliothèque au mélange de réaction sur la glace. Préparez l’émulsion d’eau dans l’huile consécutivement pour chaque bibliothèque en plaçant d’abord un petit bécher rempli de glace sur un agitateur magnétique avec la vitesse d’agitation réglée à 1150 RPM.

Transférer ensuite un flacon cryogénique avec 950 microlitres de mélange de surfactant à l’huile et une petite barre d’agitation à un bécher glacé sur l’agitateur magnétique. Vérifiez que la barre d’agitation tourne. Ajouter cinq aliquots de 10 microlitres du mélange transcription-traduction de la bibliothèque in vitro sur une période de deux minutes en intervalles de 30 secondes et continuer à remuer pendant une minute supplémentaire.

Transférer le flacon avec l’émulsion dans un récipient de glace. À ce stade, le liquide doit être opaque, pas translucide. Ensuite, procédez à la bibliothèque suivante.

Une fois toutes les bibliothèques traitées, commencez l’incubation de toutes les bibliothèques selon les recommandations du fabricant du kit. Transférer les flacons à la température optimale pour l’endonuclease machinée pendant deux heures supplémentaires avant de les placer sur la glace pendant au moins 10 minutes. Transférer les émulsions des flacons cryogéniques dans des tubes de 1,5 millilitre.

Ajouter un microlitre de 5 molaire EDTA. Et centrifugez-les à 13 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Si après centrifugage vous ne pouvez pas voir clairement l’interface eau-huile, congelez le mélange avant l’aspiration de la phase supérieure de l’huile.

Déplacez la phase supérieure de l’huile à l’l’huile à l’l’huile d’une pipette et jetez-la. Effectuez immédiatement l’extraction en ajoutant 150 microlitres de chloroforme phénol et 100 microlitres de Tris-HCl de 10 millimlaires à la phase aqueuse. Vortex, puis effectuer la séparation de phase via centrifugation de 30 secondes à 13 000 fois g.

Recueillir la phase aqueuse supérieure. Précipitez l’ADN en ajoutant 15 microlitres d’acétate de sodium trois molaires, 2,5 à 5 microgrammes de glycogène et 375 microlitres d’éthanol. Après avoir incubé les échantillons à moins-20 degrés Celsius pendant une heure, centrifugeuse pendant 15 minutes à 13 000 fois g, quatre degrés Celsius.

Jetez le supernatant et lavez brièvement la pastille avec un millilitre d’éthanol froid à 70 %. Séchez la pastille de glycogène d’ADN dans un vide de vitesse ou un séchoir à air pendant plus de cinq minutes. Puis dissoudre la pastille en 50 microlitres de 10 millimolaires Tris-HCl.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres de perles magnétiques streptavidin, préparés selon les instructions du fabricant. Mélanger pendant une heure à température ambiante, de préférence dans un mélangeur de carrousel ou par vortex doux. Transférer les tubes sur un support magnétique pour séparer les perles.

Puis recueillir le liquide enrichi en ADN sans biotine. Ce protocole est un outil pour augmenter la fréquence des variantes désirées des endonucleases de restriction machinés en appauvrissant des enzymes et des endonucleases inactifs avec la spécificité inchangée de séquence sauvage-type. Un dépistage réussi peut identifier jusqu’à 20 % des variantes prometteuses.

Les variantes sont étiquetées comme des variantes prometteuses si elles produisent un modèle de clivage distinct de l’enzyme de type sauvage. Les variantes qui auraient pu modifier la préférence de séquence sont également étiquetées. Montré ici est un criblage infructueux avec la majorité de la variance inactive et une variante avec le modèle apparemment inchangé de clivage.

Dans ce cas, les bibliothèques sont très probablement dominées par des variantes inactives qui ont échappé à l’étape de sélection de capture streptavidine. Il est essentiel de concevoir soigneusement les séquences sélectionnées et contre-sélectionnées et de limiter la diversité de la bibliothèque par stratégie de mutagenèse qui génère des substitutions dans seulement quelques positions sélectionnées. Les meilleures variantes sélectionnées doivent être soigneusement caractérisées pour la cinétique de liaison et de clivage sur des séquences préférées et non fendées basées sur les résultats du dépistage initial.

Dans notre cas d’essai, des emplacements de mutagenesis ont été choisis basés sur un modèle d’homologie. Étonnamment, une structure cristalline a montré plus tard que certains résidus altérés ne sont probablement pas en contact direct avec l’ADN.