Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l'évolution dirigée de protéines dans les E. coli

L’objectif global de cette procédure est de créer une banque de mutants aléatoire pour une séquence d’ADN cible donnée, et d’identifier et de caractériser rapidement les mutants à l’aide d’une sélection fonctionnelle semi-quantitative. Ceci est accompli en transformant d’abord un plasmide avec un coli, une origine de réplication contenant la séquence cible en souche mutatrice. Après avoir plaqué et incubé les cellules pendant la nuit, elles sont récoltées et le plasmide cible est isolé pour obtenir la banque de mutants, la bibliothèque de mutants est ensuite transformée en une souche de lecture pour caractériser les mutations dans la deuxième partie du protocole, une plaque de croissance de gradient est construite et les cultures bactériennes de la souche de lecture sont chargées dans une boîte de Pétri séparée contenant de l’aer mou.

La dernière étape de la procédure consiste à transférer ces cultures bactériennes dans le gradient. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des changements dans le profil phénotypique d’une séquence cible donnée par des différences de croissance sur un gradient de médicament. Cette vidéo présente une méthode d’évolution dirigée des protéines chez E. coli.

Ce processus imite l’évolution naturelle dans la génération de bibliothèques de nutriments aléatoires, suivie d’une sélection qui limite cette diversité. Ainsi, il améliore notre capacité à générer de nouvelles activités biochimiques à des fins industrielles ou biomédicales. Cette procédure comporte deux composantes, la génération d’une banque de mutants aléatoires et la sélection fonctionnelle pour obtenir des mutations de gain de fonction.

Avant le début de ce protocole, les cellules JS 200 électro-compétentes exprimant une variante basse fidélité de l’ADN polymérase un ou un pôle basse fidélité, qui avait été préalablement préparée comme décrit dans le protocole écrit, ces cellules contiennent un allèle sensible à la température du pôle un, de sorte que l’activité du pôle basse fidélité un prédomine à 37 degrés Celsius, construire. Un plasmide cible contenant un coli, une origine de réplication avec la séquence cible clonée à côté de l’origine de la réplication, un pôle basse fidélité initie coli, un plasmide réplication. Introduisant ainsi des mutations pour initier la mutagénèse.

Combinez 40 microlitres de cellules électrocompétentes et entre 30 et 250 nanogrammes d’ADN plasma cible dans un espace de deux millimètres. Électroporation vet pulse, le mélange dans l’électro à 1800 volts. Vérifier la constante de temps ou TC pour assurer l’uniformité des conditions d’utilisation de chaque échantillon.

Idéalement, TC est égal à cinq à six millisecondes. Laissez le mélange d’ADN cellulaire se rétablir dans un millilitre de bouillon LB pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius en secouant à 250 tr/min. Procurez-vous une boîte de Pétri agro LV de 100 millimètres de préchauffage à 37 degrés Celsius contenant des antibiotiques appropriés pour sélectionner pour les deux plasmides les cellules récupérées à une dilution appropriée afin d’obtenir une concentration proche de la pelouse, qui est définie comme un nombre distinct mais indénombrable de colonies, comme le montre cet exemple.

Après une nuit d’incubation, récoltez les colonies bactériennes des boîtes de Pétri avec du bouillon LB. Isolez le plasmide, l’ADN des cellules récoltées, le plasmide résultant. L’ADN constitue la banque mutante aléatoire.

Effectuez une digestion de restriction en coupant la bibliothèque de plasmides avec une enzyme de restriction qui linéarise à la fois le plasmide cible et le pôle. Un plasmide a analysé l’ADN du plasmide isolé pour confirmer la qualité et la quantité. Une fois les plasmides vérifiés, digérez un microgramme de la banque avec une enzyme de restriction qui linéarise le plasmide du pôle un, mais ne coupe pas le plasmide cible.

Une fois la synthèse de restriction terminée, nettoyez la bibliothèque à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Enfin, transformez la bibliothèque propre en une souche de lecture pour caractériser les mutations. Pour commencer la préparation du dégradé, marquez 10 voies espacées uniformément sur un bord du bas de la boîte de Pétri carrée.

Placez le plat sur une pente telle que le bord inférieur marqué soit surélevé de sept millimètres. Versez 25 millilitres de gélose chaude bien mélangée avec une concentration appropriée de l’agent de sélection dans le plat incliné. Il s’agit de la couche inférieure du dégradé.

Assurez-vous que la gélose LB recouvre la boîte de Pétri de sorte que l’extrémité surélevée et marquée de la boîte contienne environ un millimètre de gélose LB et que la partie abaissée contienne environ huit millimètres. Couvrez la plaque avec le couvercle KU pour la ventilation et laissez l’agri prendre pendant 10 à 15 minutes. Une fois que la couche inférieure de gélose LB a durci, déplacez le plat sur une surface plane.

Ensuite, versez 25 millilitres de gélose tiède sans l’agent sélectionneur pour recouvrir la première surface agricole, en vous assurant de couvrir toute la couche inférieure. Couvrez la plaque avec le couvercle KU pour la ventilation, puis laissez l’agri prendre pendant 10 à 15 minutes pour effectuer le transfert de tampon des bactéries. Tout d’abord, obtenir des cultures bactériennes de la souche de lecture et les diluer pour avoir des densités cellulaires identiques avec une densité optique à 600 nanomètres inférieure à 1,0.

Ensuite, transférez deux millilitres de gélose molle liquide équilibrée à 42 degrés Celsius au fond d’une boîte de Pétri ronde de 100 millimètres, pipetez 40 microlitres de la culture bactérienne dans le plus doux, puis mélangez en balançant la plaque. Enduire le bord long de la lame de microscope en verre avec le mélange plus doux. Ensuite, alignez le bord revêtu de la diapositive avec le repère inférieur sur le plat dégradé.

Touchez la glissière à la surface de la gélose. Un toucher doux suffit pour transférer un ruban de gélose douce sur la surface du dégradé. La glissière est ensuite mise de côté pour le nettoyage et la réutilisation.

Répétez ce processus. Les échantillons restants, des contrôles expérimentaux doivent être inclus sur chaque boîte de gradient. Si plusieurs gradients sont exécutés, incubez la parabole de gradient de haut en bas pendant la nuit à 37 degrés Celsius et les températures d’incubation peuvent différer pour différentes souches bactériennes de lecture, mais une nuit à 37 degrés Celsius est généralement suffisante pour une croissance visible.

Enfin, imagez et analysez la croissance cellulaire comme décrit dans le protocole écrit. Montré. Voici des images d’une souche de lecture transformée avec soit une bibliothèque de mutants P-G-F-U-V non mutée, soit une bibliothèque de mutants PG FPUV qui ont été transportées. Quatre cycles de mutagénèse : des colonies sombres ou sombres indiquent des mutations inactivatrices du plasmide GFP.

Ce chiffre représente la fréquence des mutations tout au long de la séquence neutre du plasmide cible à 100 paires de bases d’intervalle. Notez que les mutations se produisent dans l’ensemble de la séquence plasmidique, mais à la fréquence la plus élevée la plus proche de l’origine de la réplication. Ici, la croissance des mutants est montrée par rapport à un gradient de médicaments.

La distance parcourue vers le sommet du gradient indique un profil différentiel de résistance aux médicaments entre les mutants. Dans cet exemple, des banques de plasmides de la déméthylase oxydative humaine ABH deux ont été criblées pour des mutants présentant une résistance accrue au sulfonate de méthylméthane à l’aide de gradients de sélection de médicaments. Deux. De telles banques représentant deux et quatre itérations du protocole de mutagénèse sont présentées par rapport au type sauvage parental et au vecteur vide.

La ligne blanche indique le seuil au-dessus duquel les colonies mutantes individuelles ont été isolées. Pour une analyse phénotypique plus approfondie, les mutants bêta-lactamase, R 1 64 H et E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R précédemment identifiés à l’aide de la mutagenèse P one basse fidélité et de la sélection d’astri et m sont représentés sur un coefficient de 0,4 microgramme par millilitre et un coefficient de quatre microgrammes par millilitre. La protection du gradient de céfotaxime contre le céfotaxime est indicative d’une activité bêta-lactamase à spectre étendu.

Notons que l’enzyme bêta-lactamase de type sauvage ne confère aucune protection par rapport aux cellules exprimant un vecteur vide. Par conséquent, ces mutants représentent l’adaptation ou l’évolution d’une nouvelle activité biochimique. Ici, nous avons présenté une puissante combinaison de mutagenèse et de sélection fonctionnelle pour cette génération de nouvelles activités biochimiques.

Une sélection fonctionnelle peut être obtenue soit par sélection de médicaments, soit par complémentation génétique, et elle capitalise sur notre capacité à générer une grande diversité génétique. Il peut être nécessaire de limiter la pathogenèse à une séquence donnée afin d’optimiser les activités protéiques préexistantes ou pour la pathogenèse dirigée vers un site. Ceux-ci peuvent être facilement réalisés par clonage.

De plus, la mutagénèse peut être découplée d’une sélection fonctionnelle afin d’obtenir des attaques de signature ou des empreintes mutationnelles.