In vitro Sélection de répresseurs transcriptionnels modifiés pour le silençage épigénétique ciblé

La technologie de silençage épigénétique que nous avons développée appartient à un domaine plus vaste de technologies, qui sont des technologies de silençage génique. Avant que nous commencions à développer le besoin de silençage épigénétique, il y avait deux nombreuses alternatives dans le domaine. L’un est l’inactivation des gènes par interférence de l’ARN, et l’autre était la perturbation des gènes par des nucléases artificielles.

Et la perturbation génétique par les nucléases artificielles agit au niveau de l’ADN. Vous avez donc votre gène cible que vous voulez inactiver, et vous délivrez à la cellule des nucléases artificielles, qui induisent une double rupture de corde. Ce type de double rupture de corde peut effectuer la somme dégénérative, mutation de décalage de cadre, qui impose finalement soit une dégénérescence de la protéine non fonctionnelle, soit simultanément une dégradation transcriptionnelle.

Ainsi, le silençage épigénétique fonctionne en délivrant la cellule, ce que l’on appelle des répresseurs de transcription modifiés. Il s’agit de petites protéines qui sont capables de se lier à votre ADN cible, puis de ne s’imposer qu’à votre gène cible, ce que l’on appelle le marx épigénétique. Il s’agit d’une modification chimique qui, une fois déposée sur l’ADN, peut entraîner un compactage de la chromatine.

Il est important que le compactage de la chromatine conduise alors à l’inhibition de la transcription, de sorte que vous n’avez plus l’expression de votre gène cible. Et très important, ce type d’état répressif de transcription peut être prolongément uni par les cellules. Pour identifier les lignées cellulaires qui expriment le gène cible à réduire au silence, parcourez le gène cible dans l’Atlas des protéines humaines et naviguez dans la section Lignée cellulaire pour identifier les lignées cellulaires représentatives du tissu somatique d’intérêt.

À partir des lignées cellulaires identifiées, priorisez celles pour lesquelles des protocoles efficaces d’administration de gènes transitoires sont disponibles. Ensuite, ouvrez une visionneuse de gènes et identifiez la région du gène cible pour intégrer la cassette d’expression du fluorophore. Ensuite, utilisez CHOPCHOP pour identifier et sélectionner GNRA, qui coupera dans la région cible dans le premier intron du gène Beta-2M.

Ensuite, concevez un modèle de donneur pour le site de coupe GNRA, composé d’un bras d’homologie gauche, d’une cassette d’expression de transgène libre promoteur et d’un bras d’homologie droit. Administrer le système de nucléase CRISPR Cas9 et le modèle de donneur à l’intérieur de la lignée cellulaire K-562 par nucléofection, conformément aux instructions du fabricant. Cultivez les cellules K-562 pendant au moins 14 jours.

Surveillez les niveaux d’expression du rapporteur fluorescent au fil du temps à l’aide d’un cytomètre en flux. Activez le canal étherin FICO pour mesurer l’intensité de fluorescence du rapporteur tdTomato. Parcourez le gène cible dans l’UCSC Genome Browser et extrayez la séquence nucléotidique des régions qui régulent potentiellement son activité transcriptionnelle, telles que les îlots CpG et les sites enrichis pour l’acétylation de H3K27.

Collez les séquences sélectionnées dans l’outil en ligne CHOPCHOP et sélectionnez la répression comme objectif des GNRA à récupérer. CHOPCHOP fournira une liste de GNRA cartographiés sur la séquence génétique d’intérêt et répertoriés en fonction d’un score, en tenant compte du nombre de correspondances hors cible et de l’efficacité prévue sur la cible. Sélectionnez au moins 10 GNRA par séquence cible.

Essayez de sélectionner des GNRA couvrant l’ensemble de la région à intégrer sans correspondances complètes avec d’autres séquences intergéniques dans l’ensemble du génome. Après avoir transformé les plasmides codant pour l’ETRS dans des cellules E. coli chimiquement compétentes, cribler les colonies pour détecter la présence du plasmide porteur d’ETR par digestion enzymatique de restriction et séquençage de Sanger. Pour cloner les GNRA à l’intérieur du squelette phU6 GNRA, il faut d’abord générer des oligos à l’aide d’un logiciel de conception de biologie moléculaire.

Ajoutez une séquence de cinq nucléotides en amont de l’espaceur de proto-éléments et étiquetez cet oligo long de 25 nucléotides. De même, ajoutez une séquence de cinq nucléotides du complément inverse du proto-espaceur et une cytosine en aval de celui-ci, pour générer un oligo long de 25 nucléotides et le marquer. Faites synthétiser ces oligos sous forme d’oligos d’ADN simple brin sans sel remis en suspension dans l’eau à 100 micromolaires.

Ajouter un microlitre de chaque oligo à deux microlitres de tampon de recuit et 16 microlitres d’eau. Effectuez un oligo-recuit en plaçant la solution dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez progressivement à 25 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Diluer un microlitre d’oligos recuits avec 99 microlitres d’eau sans nucléase. Ensuite, ligaturez un microlitre de cette dilution avec 50 nanogrammes de plasmide phU6 GNRA, préalablement digéré avec l’enzyme de restriction Bsa1. Transformation de 20 microlitres de cellules E.coli chimiquement compétentes avec deux microlitres de produit de ligature.

Choisissez plusieurs colonies pour la production d’ADN plasmidique et confirmez le clonage réussi de l’espaceur de proto-proto par séquençage de Sanger. Pour délivrer les DTR basés sur GNRA et CRISPR dCas9 dans la lignée cellulaire rapporteure en réseau, préparez d’abord des tubes séparés contenant 500 nanogrammes de chacun des plasmides, et ajoutez 125 nanogrammes de plasmides codant pour différents GNRA à tester. Inclure une condition de nucléofection sans GNRA et ETR comme échantillon traité simulé.

Préparez au moins trois répétitions techniques par échantillon. Pelleter cinq fois 10 à la cinquième cellule Beta-2M tdTomato K-562 par tube, et les nucléer avec le mélange plasmidique. Remettre les cellules en suspension dans 200 microlitres de milieux de culture de cellules de mammifères RPMI 1640 préalablement réchauffés et les placer dans l’incubateur.

Utilisez la cytométrie en flux pour mesurer le pourcentage de cellules réduites au silence à différents moments après l’administration des ETR. Utilisez des cellules de type sauvage sans la séquence d’enrobage Flora 4. Permet de définir le seuil de cellules négatives rapporteures.

Utilisez l’échantillon traité fictif pour définir la porte pour les cellules rapporteures positives. Identifiez les trois principaux GNRA en termes d’efficacité de réduction au silence à long terme. Utilisez des faits pour sélectionner les sous-populations négatives déclarées qui sont maintenues de manière stable dans ces échantillons.

Effectuez également des faits sur les échantillons traités fictifs sous le même traitement pour permettre une comparaison appropriée dans les analyses ultérieures. Un rapporteur fluorescent tdTomato a été intégré dans le premier intron du gène humain Beta-2M par réparation dirigée par tomologie induite par CRISPR Cas9. Des cellules K-562 rapporteures positives apparaissent dans l’échantillon traité après intégration.

Lors de l’administration transitoire de la combinaison triple ETR, ainsi que des GNRA, une analyse par cytométrie en flux longitudinal a été effectuée pour évaluer l’expression du rapporteur fluorescent. Un pic a été observé dans la répression des rapporteurs lors des analyses aiguës, qui a été partiellement réabsorbée en raison de la dilution mitotique des plasmides codant pour l’ETR au fil du temps. Le dépôt efficace de la méthylation de CpG sur le locus cible par la combinaison GNRA de l’ETR a été mis en évidence par une répression permanente du rapporteur dans une fraction importante des cellules traitées.

Différents GNRA ont montré une efficacité de réduction au silence variable à long terme. L’une des étapes les plus importantes pour parvenir à un silençage permanent et efficace de l’épigénome est l’identification d’un ARNg unique efficace. Pour ce faire, tout type d’application, il faut commencer par l’identification des séquences les plus réactives, y compris le promoteur et la réponse dans tous les autres sites pour les régulateurs transcriptionnels.

Une fois identifié quelle pourrait être la région la plus réactive et la plus efficace, n’importe qui devrait concevoir différents types de test à ARNg unique en tant qu’individu ou combinaison d’ARNg unique. L’une des applications les plus évidentes de l’édition de l’épigénome est sans aucun doute la traduction préclinique dans tout gain de mutation fonctionnelle, dans laquelle le silençage de ce gène pourrait être utile pour guérir des maladies spécifiques. Alternativement, nous devrions de toute façon garder à l’esprit que la capacité de modifier spécifiquement la régulation épigénétique d’un promoteur donné pourrait être un outil très utile pour la science translationnelle clinique et fondamentale.